阅读说明：本技术 病毒生物磁珠富集浓缩试剂盒及应用 (Virus biomagnetic bead enrichment and concentration kit and application ) 是由 韩俊 王文军 宋娟 王瑞芳 刘宓 史冰田 宋芹芹 梅国勇 夏志强 夏冬 于 2019-11-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种病毒生物磁珠富集浓缩试剂盒及应用。所述试剂盒包含平衡液和Fe<Sub>3</Sub>O<Sub>4</Sub>纳米磁珠。所述平衡液的组成如下：葡萄糖100-200g/L、甘露糖50-100g/L、半乳糖20-50g/L和麦芽糖20-50g/L,用生理盐水配制。利用本发明试剂盒进行病毒的富集浓缩,可广泛高效地吸附临床样本中的病毒,如肠道病毒,呼吸道合胞病毒等,且该试剂盒对于细菌有富集效果,成本低廉,操作简单,无需离心,保证生物安全。本发明提供的试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、对硬件要求低等优势,可广泛应用于各级疾病预防控制及医疗机构等。(The invention provides an virus biomagnetic bead enrichment and concentration kit and application thereof 3 O 4 The kit is used for enriching and concentrating viruses, such as enteroviruses, respiratory syncytial viruses and the like in clinical samples, can absorb the viruses in the clinical samples with high efficiency, and has the advantages of simple and quick operation, good specificity, high sensitivity, low requirement on hardware and the like, and can be used for widely applied to various levels of disease prevention control, medical institutions and the like.)

病毒生物磁珠富集浓缩试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种病毒生物磁珠富集浓缩试剂盒及应用。

背景技术

近年来，由于肿瘤患者，器官移植，免疫缺陷和免疫受损患者的人数逐渐增多，相关病毒感染的发病率大大增加。特别是病毒感染潜伏期时缺乏特征性的症状，临床上难以早期诊断。对于潜伏期时的病毒感染，体内收集的液体标本，例如组织液、血液、脑脊液、胸腹水、尿液和痰液，病毒量少，对标本直接进行荧光定量PCR检测时，由于检测方法的局限性，很难检测出微量病毒，同时此方法存在一定的假阴性或假阳性。并且当标本中病毒量少时，细胞培养的结果很可能为阴性，从而导致无法分离出病毒。因此提高标本中病毒检出率具有重要的临床意义。对于现有的磁珠富集检测方法，其成本高，操作不方便，需要离心步骤，难以广泛应用于临床。

发明内容

本发明的目的是提供一种病毒生物磁珠富集浓缩试剂盒及应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种平衡液，其组成如下：葡萄糖100-200g/L、甘露糖50-100g/L、半乳糖20-50g/L和麦芽糖20-50g/L，用于配制平衡液的溶剂为生理盐水(0.9％医用生理盐水)。

优选地，平衡液的组成如下：葡萄糖200g/L、甘露糖100g/L、半乳糖50g/L和麦芽糖50g/L。

第二方面，本发明提供一种病毒生物磁珠富集浓缩试剂盒，所述试剂盒包含上述平衡液。

进一步地，所述试剂盒还包含Fe₃O₄纳米磁珠。

优选地，所述纳米磁珠为表面经过硅烷基改性、油酸改性、柠檬酸改性或羧基改性的磁珠。

更优选地，所述纳米磁珠的平均粒径大小为800-1000nm(优选1000nm)。

第三方面，本发明提供上述平衡液、或含有平衡液的试剂盒在病毒富集浓缩及检测中的应用。

前述的应用，将样本与所述平衡液混匀，向其中加入经平衡液处理过的纳米磁珠，混匀后室温静置，将上述混合体系置于磁场中，收集磁珠沉淀，样本中的病毒吸附于磁珠表面，将磁珠直接用于后续检测。

本发明中，所述样本来自于体液、组织液、血液、脑脊液、胸腹水、尿液或痰液等。

前述的应用，将样本与平衡液按1-1.2ml：120μl(优选1ml：120μl)的体积比混匀，常温下颠倒混合20-30min(优选20min)。

前述的应用，向50-100mg(优选100mg)纳米磁珠中加入100μl平衡液，于常温下混合即得经平衡液处理过的纳米磁珠。

前述的应用，所述病毒包括包膜病毒和无包膜病毒，如肠道病毒，呼吸道合胞病毒等。

本发明中，磁珠和标本分别被平衡液处理后，将包被后的磁珠直接加入到标本中。室温静置后，将标本放置于磁场中，磁珠聚集形成沉淀。弃去上清液，磁珠沉淀用于后续检测，例如荧光染色，PCR检测以及细胞培养等。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明提供的病毒富集浓缩方法能够广泛高效地吸附临床样本中的各种包膜病毒和无包膜病毒，如肠道病毒，呼吸道合胞病毒等，且该试剂盒对于细菌有富集效果，成本低廉，操作简单，无需离心，保证生物安全。

(二)本发明提供的试剂盒具有操作简单(所有操作均在常温下进行)、快速、特异性好、灵敏度高、对硬件要求低等优势，可广泛应用于各级疾病预防控制及医疗机构等。

(三)平衡液采用0.9％医用生理盐水作为溶剂，便于样本的存储，有利于细胞形态的稳定。

(四)该试剂盒对病毒、细菌的富集效果明显，避免反复离心，防止离心机在高速离心时，样本漏出的风险，保证生物安全。

附图说明

图1为本发明实施例2中普通荧光显微镜下无包膜病毒(CVB3)通过磁珠富集的结果。

图2为本发明实施例2中普通荧光显微镜下包膜病毒(RSV)通过磁珠富集的结果。

图3为本发明实施例4中加平衡液和未加平衡液的病毒富集效果比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1病毒生物磁珠富集浓缩试剂盒的制备

本实施例提供的病毒生物磁珠富集浓缩试剂盒包含平衡液和Fe₃O₄纳米磁珠。

平衡液的组成如下：葡萄糖200g/L、甘露糖100g/L、半乳糖50g/L和麦芽糖50g/L,用于配制平衡液的溶剂为0.9％医用生理盐水。

Fe₃O₄纳米磁珠的平均粒径大小为1000nm。

实施例2临床样本的病毒富集浓缩方法

分别取CVB3与RSV病毒液各2ml(病毒滴度为10⁵PFU/ml)，DMEM培养基2mL用于实验检测。

检测流程：

1、取100mg磁珠溶于100μl平衡液中混匀；

2、按照以下分组，进行检测：

第一组(富集前)：1ml CVB3病毒液和100μl一抗鼠源anti-CVB3(1:500)颠倒混匀20min，然后加入100μl二抗抗鼠IgG(1:500)颠倒混匀20min；

第二组(实验组)：1ml CVB3病毒液和100μl一抗鼠源anti-CVB3(1:500)颠倒混匀20min，然后加入100μl二抗抗鼠IgG(1:500)颠倒混匀20min；

第三组(对照组)：1ml DMEM和100μl一抗鼠源anti-CVB3(1:500)颠倒混匀20min，然后加入100μl二抗抗鼠IgG(1:500)颠倒混匀20min；

第四组(富集前)：1ml RSV病毒液和100μl一抗鼠源anti-RSV(1:500)颠倒混匀20min，然后加入100μl二抗抗鼠IgG(1:500)颠倒混匀20min；

第五组(实验组)：1ml RSV病毒液和100μl一抗鼠源anti-RSV(1:500)颠倒混匀20min，然后加入100μl二抗抗鼠IgG(1:500)颠倒混匀20min；

第六组(对照组)：1ml DMEM和100μl一抗鼠源anti-RSV(1:500)颠倒混匀20min，然后加入100μl二抗抗鼠IgG(1:500)颠倒混匀20min；

3、向以上实验组与对照组中各加入120μl平衡液，颠倒混匀20min；

4、向步骤3的实验组与对照组的混合物中各加12μl磁珠，颠倒混匀20min；

5、将上述混合液置于磁场中，静置20min。弃上清，用DMEM培养基反复清洗、磁场吸附2-3遍，加入100μl DMEM培养基混匀；

6、以上各组最终结果均在普通显微镜下观察。

实验中所需激发光源均为568nm。

结果如图1所示。图1为普通荧光显微镜下无包膜病毒(CVB3)通过磁珠富集的结果。包括富集前(磁珠富集前)、实验组(磁珠富集后)和对照组(抗体对照)。由于普通荧光显微镜无法观察到病毒颗粒，故荧光下只能看到橙红色荧光；经过磁珠富集的实验组，光镜下观察到的磁珠与产生荧光的位置相应；而产生非特异性荧光的对照组，在相同条件下，结果显示抗体结合产生的非特异性荧光弱于病毒与抗体结合产生的特异性荧光。

图2为普通荧光显微镜下包膜病毒(RSV)通过磁珠富集的结果。所有结果与CVB3的结果一致，表明两种病毒(无包膜病毒与包膜病毒)均可以通过该磁珠富集，并且富集效果明显。

实施例3平衡液稳定性测试

1、热稳定性测试

将试剂样品(实施例1平衡液和平衡液处理后的纳米磁珠)置于40℃避光水浴3天，肉眼观察未发现分层，镜下无晶体析出，再按上述操作步骤进行试验，结果表明富集效果没有减弱。

2、冷稳定性测试

将试剂样品置于-20℃冰箱避光1月，期间反复冻融数次，取出，肉眼观察未发现分层，镜下无晶体析出，再按上述操作步骤进行试验，结果表明富集效果没有减弱。

3、常温稳定性测试

将试剂样品置于常温避光1个月，肉眼观察未发现分层，镜下无晶体析出，再按上述操作步骤进行试验，结果表明富集效果没有减弱。

4、酸碱稳定性测试

按上述操作步骤，对用0.9％医用生理盐水调至pH2-10的样本加入呼吸道合胞病毒进行检测，结果表明富集效果未发生变化。

实施例4病毒富集效果比较(与未使用平衡液进行比较)

取CVB3病毒液2ml(病毒滴度为10⁵PFU/ml)每管1ml，用于实验检测。

本实验中平衡液各成分比例同实施例1。

检测流程如下：

1、取100mg磁珠溶于100μl平衡液中混匀；

2、两管CVB3病毒液均按照下述操作：

1ml CVB3病毒液和100μl一抗鼠源anti-CVB3(1:500)颠倒混匀20min，然后加入100μl二抗抗鼠IgG(1:500)颠倒混匀20min；

3、第一组(加平衡液)：1200μl CVB3病毒液加入120μl平衡液，颠倒混匀20min，然后加入12μl平衡液处理后的磁珠，颠倒混匀20min；

第二组(未加平衡液)：1200μl CVB3病毒液加入120μl DMEM，颠倒混匀20min，然后加入12μl平衡液未处理过的磁珠，颠倒混匀20min；

4、将上述混合液置于磁场中，静置20min。弃上清，用DMEM培养基反复清洗、磁场吸附2-3遍，加入100μl DMEM培养基混匀；

5、以上两组最终结果均在LeicaSP8激光扫描共聚焦显微镜下观察。

实验中所需激发光源均为568nm。

实验结果如图3所示，在显微镜下观察，能够看到光镜下的磁珠和橙红色荧光(只有在电镜下才能观察到病毒颗粒)；加平衡液的第一组，光镜下观察到的磁珠与产生荧光的位置相对应，且荧光较强；而未加平衡液的第二组，则在相同条件下，橙红色荧光明显弱于第一组。

现有的利用免疫磁珠富集病毒的方法，主要是通过磁珠偶联免疫性亲和配体，通过亲和层析与目标病毒进行偶联，得到富集病毒的特异性免疫磁珠，从而达到富集病毒的目的。例如，磁珠表面包裹G蛋白或相关抗体，使其更好地吸附病毒，从而达到富集浓缩病毒的效果。但该方法存在以下主要问题：磁珠改良操作复杂、成本较高；改良磁珠富集病毒所需操作条件较高，如需要特定的温度25℃-37℃，且富集的病毒种类单一，因为需要制备特异性的单克隆抗体，以便磁珠与抗体的偶联，目前可富集的病毒仅限于甲肝、流感病毒等几类有限的病毒。相比而言，本方法能够广泛高效地吸附临床样本中的包膜病毒或无包膜病毒，如肠道病毒，呼吸道合胞病毒等；可在常温下进行；成本低廉，操作简单；富集效果明显；无需离心，保证生物安全。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。