阅读说明：本技术 一种提高司美鲁肽前体产量及菌体密度的方法 (Method for improving yield and thallus density of semaglutide precursor ) 是由 孙剑峰 孔凡楼 张颖 张立志 杨雨 闫飞 于 2020-06-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了用于大肠杆菌发酵生产司美鲁肽前体所需的基础培养基和补料培养基,以及利用该培养基发酵产生司美鲁肽前体的方法,针对大肠杆菌发酵过程中溶氧难控,补料速度慢,从而发酵密度低,表达量低等的不足,在基础培养中添加柠檬酸铁铵和全氟化碳乳液,并在补料培养基中添加全氟化碳乳液,从而使整个发酵过程溶氧可以控制在30％以上,菌体密度和产量显著提高。(The invention discloses a basic culture medium and a supplemented culture medium required by producing a semaglutide precursor by fermenting escherichia coli, and a method for producing the semaglutide precursor by fermenting the culture medium, aiming at the defects that dissolved oxygen is difficult to control and the supplemented culture speed is slow in the fermentation process of the escherichia coli, so that the fermentation density is low, the expression quantity is low and the like, ferric ammonium citrate and perfluorocarbon emulsion are added in the basic culture, and perfluorocarbon emulsion is added in the supplemented culture medium, so that the dissolved oxygen can be controlled to be more than 30% in the whole fermentation process, and the thallus density and the yield are obviously improved.)

一种提高司美鲁肽前体产量及菌体密度的方法

技术领域

本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种司美鲁肽前体及司美鲁肽前体生产菌株菌体密度提高的方法。

背景技术

糖尿病被认为是双激素异常疾病—绝对或相对胰岛素缺乏和相对胰高血糖素过多。胰岛素缺乏导致葡萄糖利用异常，胰高血糖素过多导致葡萄糖的产生增加，两种情况均可升高血糖水平。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一种肠促胰岛素，具有促进胰岛素分泌、降低胰高血糖素水平、减低胃排空速率、增进饱食感和刺激胰岛细胞增殖与分化等多种生理效应[Hoist J J，Gromada J.Am J Physiol EndocrinolMetab，2004]。

司美鲁肽是一款长效的GLP-1类似物，具有和GLP-1相似的作用机制。GLP-1是由肠道L细胞分泌的一种肽类激素，与受体特异性结合后，主要通过环腺苷酸信号途径发挥血糖依赖性的肠促胰岛素分泌作用。研究发现，司美鲁肽不仅可以大幅改善2型糖尿病患者血糖，而且还能够降低食欲和减少食物摄入量，诱导减肥。除此之外，还能够显著降低2型糖尿病患者重大心血管事件(MACE)风险。

目前对于司美鲁肽大肠杆菌的研究主要集中在纯化或者制剂上，对于发酵菌体密度的提高和前体产量的提高的报道较少。已经批准的专利CN 101643764 B(一种发酵生产胰岛素原的补料培养基及补料培养优化方法)开发了一种新型的补料方法，但该基础培养基缺少柠檬酸铁铵这一微量元素和酶的辅助因子，且甘油含量仅为1.5ml/L，补料前菌体生长缓慢，且补料过程中需要通入纯氧，成本高，发酵终点菌体密度过低(培养6h菌体OD₆₀₀吸光度仅为15.0，发酵终点19h菌体OD₆₀₀吸光度为69.0)，造成产量未有进一步的提高。田宁等在产香叶醇重组大肠杆菌发酵培养基的优化(林产化学与工业，2015年8月)中采用了改良的M9培养基，本发明发现该培养基加入了柠檬酸铁铵，铁可以促进多种大肠杆菌菌株的生长，降低乙酸的生成量，当培养基中铁供应不足时.引起呼吸链中许多含铁的组分(如琥珀酸脱氢酶、细胞色素还原酶等)活性下降，导致呼吸量的电子传递通量降低。由于NADH不能被有效氧化，照成ATP供应不足，大肠杆菌就会通过乙酸生成途径产生ATP供菌体所需，最终导致大肠杆菌产生大量的乙酸。但其在发酵罐上未进行补料，最终发酵液菌体密度仅达到OD₆₀₀ 45。

发明内容

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为克服司美鲁肽大肠杆菌发酵菌体密度低，目的蛋白产量低的问题，本发明提供一种新的基础改良培养基和补料培养基，以达到菌体高密度发酵和蛋白产量提高的目的。

为了达到本发明的目的，公开了一种适合大肠杆菌发酵司美鲁肽的基础培养基，该培养基中加入了柠檬酸铁铵促进了产物的表达，同时创新性地引入了全氟化碳乳液用于改善整个发酵过程中发酵液中氧的传递问题。

所采取的技术方案为：

一种用于大肠杆菌发酵产生司美鲁肽前体的基础培养基，配方为：磷酸二氢钾0.5～10g/L，酵母浸粉1～15g/L，一水柠檬酸0.5～4g/L，柠檬酸铁铵0.05～0.3g/L，葡萄糖1～20g/L，七水硫酸镁0.5～5g/L，微量元素液10～30ml/L，全氟化碳乳液1～10ml/L，pH值6.80～7.20；

优选的，基础培养基配方为：磷酸二氢钾3.5g/L，酵母浸粉6g/L，一水柠檬酸1.4g/L，柠檬酸铁铵0.13g/L，葡萄糖8g/L，七水硫酸镁2.12g/L，微量元素液16.7ml/L，全氟化碳乳液8ml/L，pH值7.00。

优选的，微量元素液配方为：七水硫酸锌2.9g/L，四水合七钼酸铵3.7g/L，硼酸24.7g/L，五水硫酸铜2.5g/L，四水合氯化锰15.8g/L。

优选的，全氟化碳乳液的制备方法包括：

a)基础乳液的制备：将乳化组分及Tyrode溶液经过低温超声乳化得到基础乳液；

b)全氟化碳乳液的制备：将全氟化碳组分加入到基础乳液中，进一步经低温超声和高压均质机处理得到全氟化碳乳液；

优选的，乳化组分为常见的蛋黄卵磷脂、溶血磷脂酰胆碱、胆固醇、鞘磷脂等中的一种；全氟化碳组分为全氟三丁胺、全氟十三胺、全氟溴辛烷、全氟正丁基呋喃、全氟萘烷、全氟甲基萘烷、全氟三丙胺中的一种或混合物。

针对大肠杆菌发酵后期耗氧量极大，菌体生长变缓，目的蛋白表达水平很差的问题，本发明还提出一种新的补料培养基，加入全氟化碳乳液以及其他组分，包括葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、硫酸镁。

优选的，补料培养基配方为：蛋白胨30～60g/L，酵母浸粉50～200g/L，葡萄糖400～500g/L，七水硫酸镁0.1～1g/L，全氟化碳乳液5～20ml/L；

优选的，补料培养基配方为：蛋白胨45g/L，酵母浸粉150g/L，葡萄糖500g/L，七水硫酸镁0.5g/L，全氟化碳乳液15ml/L。

本发明还提供一种基于上述所述基础培养基和补料培养基进行大肠杆菌发酵产司美鲁肽前体的方法，具体包含如下步骤：

(1)种子液制备：将超低温冰箱保存的大肠杆菌甘油菌种接种于含100ml LB培养基的500ml摇瓶，37℃、220rpm摇床培养5～7h作为种子液；

(2)分批培养：0.5～2L种子液接入含20L发酵基础培养基的50L发酵罐中，起始培养条件为37℃，pH 7.0，转速300rpm，通气量0.5m³/h。随着培养的进行，先增大通气量直至5.0m³/h，再增大转速直至780rpm，控制溶氧30％及以上，培养6～7h；

(3)分批补料培养：分批培养结束后，以400～900ml/h的速率流加补料培养基1～3h；

(4)诱导培养：分批补料结束后，控制温度为22～28℃，pH为6.00～7.50，加入终浓度为0.1～1.0mM的IPTG开始诱导，诱导过程中控制溶氧20～50％；

(5)取样检测及发酵结束：诱导培养开始后，每3小时取发酵液样品一次，3000～12000rpm离心5～10min，测定上清液中司美鲁肽前体表达量，待表达量增加缓慢或减少时，结束发酵。

优选的，步骤(1)中LB培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，pH值为7.00；

步骤(2)中种子液优选为1L；

步骤(3)中补料方式为恒速补料，速度优选为700ml/h，补料培养基需要搅拌，使全氟化碳乳液充分混合均匀；

步骤(4)中，诱导温度优选为23℃，pH优选为7.20，IPTG浓度优选为0.3mM，溶氧优选控制在30％～40％。

有益效果：

1、本发明的全氟化碳化合物是一种烃分子中的所有氢原子被氟原子取代而形成的有机化合物，由于全氟碳化合物的特殊结构，其具有高氧溶解性，而这一特性使其被广泛应用于生物医学领域，本发明首次将其应用于发酵中，用于改善发酵过程中氧的传递。

2、本发明首次在发酵基础培养基中添加全氟化碳化合物乳液，可以改善前期分批培养发酵阶段的氧传递，不必通入纯氧，可以控制溶氧DO在30％以上，在分批补料阶段前菌体光密度OD₆₀₀就达到50以上。

3、本发明在分批补料培养及诱导培养阶段的补料培养基中添加全氟化碳化合物乳液，大大增加了氧的传递，使得即使补料速度增加至700ml/h溶氧DO在不通入纯氧的前提下可以维持在30％以上，菌体密度增加迅速，发酵20h，菌体光密度OD₆₀₀达到220，菌体湿重可以达到300g/L，干重达到120g/L，菌体密度提高29.4％，产量提高73.6％。

4、本发明在发酵基础培养中添加柠檬酸铁铵，铁是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的组成成分，因此它是菌体有氧氧化必不可少的元素，通过本发明发现，发酵培养基中添加柠檬酸铁铵，发酵液中司美鲁肽前体的产量提高131.5％。

附图说明

图1为未加入全氟化碳乳液与加入全氟化碳乳液溶氧DO对比图。

具体实施方式

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以下结合具体实施方式对本发明作进一步描述，下述说明仅是为了解释本发明，本发明的保护范围并不限于这些实施例，本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

实施例1：

步骤1：基础乳液制备

称取蛋黄卵磷脂60g加入到台式液中，搅拌混匀定容至300ml，650W超声细胞粉碎机超声乳化3次，每次10s，间隔30s，制备出基础乳液。

步骤2：全氟三丁胺乳液制备

取全氟三丁胺原液120ml，加入到基础乳液中，搅拌定容至450ml，650W超声细胞粉碎机超声乳化5次，每次20s，间隔60s。乳化液再加入到高压均质机中，维持进样室4℃，压力2500bar～3500bar破碎3次得到全氟三丁胺乳液。

步骤3：基础培养基配制

称取磷酸二氢钾3～60g，酵母浸粉6～90g，一水柠檬酸3～24g，柠檬酸铁铵0.3～1.8g，葡萄糖6～120g，七水硫酸镁3～30g，微量元素液60～180ml，全氟化碳乳液6～60ml，加入纯水充分溶解后定容至6000ml，调整pH6.80～7.20。

微量元素液配制：称取七水硫酸锌1.45g，四水合七钼酸铵1.85g，硼酸12.35g，五水硫酸铜1.25g，四水合氯化锰7.9g，加水溶解后定容至500ml。

步骤4：补料培养基配制

称取蛋白胨300～600g，酵母浸粉500～2000g，葡萄糖4000～5000g，七水硫酸镁1～`10g，全氟化碳乳液50～200ml，加纯水溶解后定容至10000ml。

步骤5：种子液制备

取保存的菌株Sema-BL21 W20190411接种LB种子摇瓶中，接种量200μl/100ml，37℃220rpm培养7h。

步骤6：发酵批式培养

发酵转种量1000ml/20L，通过调节空气流量和转速控制溶氧DO≥30％，通过流加氨水控制pH7.00～7.20，培养温度37℃。

步骤7：补料培养

当发酵液溶氧DO在3min内上升至70％以上时，开始恒速补料，补料速度700ml/h，控制溶氧DO≥30％，通过流加氨水控制pH7.00～7.20，培养温度37℃。

步骤8：诱导培养

批式补料培养2.0h后，降温至22℃，加入终浓度为0.1mM的IPTG开始诱导，控制溶氧DO≥30％，通过流加氨水控制pH6.00～7.50，诱导培养12h。

步骤9：取样检测

取发酵液10000g离心20min后得到上清液，测定司美鲁肽前体含量为12g/L。

对比例1：基础培养基与补料培养基中未添加全氟化碳乳液

本实施例步骤1～2同实施例1，步骤3和步骤4中未添加全氟化碳乳液，步骤6～9同实施例1，由图1可以看出，在发酵批式培养过程中，由于基础培养基中不添加全氟化碳乳液，导致对比例中当空气流量和转速达到最大值时，发酵液中溶氧DO无法控制在30％以上，且出现溶氧DO为0的情况。而在补料培养和诱导培养阶段，由于补料培养基中未添加全氟化碳乳液，当空气流量和转速达到最大值时，发酵液中溶氧DO也无法控制在30％以上。而实施例1中在基础培养基和补料培养中均添加了全氟化碳乳液，整个发酵过程溶氧均可控制在30％以上，使得发酵终点菌体密度OD₆₀₀相比较对比例1提高29.4％，产量提高73.6％。

表1实施例1与对比例1在发酵阶段OD600及产量对比

对比例2：

基础培养基中未添加柠檬酸铁铵，采用专利CN 101643764 B一种发酵生产胰岛素原的补料培养基及补料培养优化方法的培养基进行实验

本实施例的配方为：

发酵液培养基配方:蛋白陈115g，酵母粉109g，十二水合磷酸氢二钠500g，磷酸二氢钾60g，氯化钠15g，氯化钾10g，氯化铵20g，甘油30mL,硫酸镁20.1g，加水溶解，发酵罐内灭菌备用。

补料培养基配方:蛋白陈2000g，酵母粉2000g，硫酸接500g，甘油2000mL，DMEM(高糖)培养基(含L一谷氨酸钠，不含丙氨酸钠，不含碳酸氢钠)2000mL，补足水至10000mL，灭菌后备用。

本对比例步骤6～9同实施例1，由于基础培养基中甘油含量较低，批式培养过程中，溶氧很容易控制在30％以上，但在补料阶段和诱导阶段，溶氧只能控制在10％以下，不利于菌体的生长和产物的累积，而实施例1中采用在基础培养基中添加司美鲁肽发酵的关键生长因子柠檬酸铁铵，并且补料阶段和诱导阶段溶氧均能控制在30％以上，使得发酵终点菌体密度OD₆₀₀相比较对比例2提高178.5％，产量提高131.5％。

表2实施例1与对比例2在发酵阶段OD600及产量对比