阅读说明：本技术 一种人参皂苷组合物的制备方法及其应用 (Preparation method and application of ginsenoside composition ) 是由 李俊 章漳 蒋耀权 于 2019-04-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种人参皂苷组合物的制备方法。所述的制备方法包括使用巴斯德毕赤酵母CCTCC NO.M 2016763对人参全株提取物进行发酵,即得。本发明的巴斯德毕赤酵母经特定生物发酵转化工艺后,相比人参全株提取物底物,发酵滤液中Rd、CK和R-Rg<Sub>3</Sub>的提升幅度分别可高达9％、37％和2400％,为本领域稀有皂苷的制备提供了新的方向和思路；此外本发明获得的人参皂苷组合物对角质细胞的修复能力更强。(The invention discloses a preparation method of a ginsenoside composition. The preparation method comprises fermenting the whole plant extract of Ginseng radix with Pichia pastoris CCTCC NO. M2016763. After the Pichia pastoris is subjected to a specific biological fermentation and conversion process, compared with a substrate of a whole ginseng plant extract, Rd, CK and R-Rg in fermentation filtrate 3 The promotion range of the saponin can reach 9 percent, 37 percent and 2400 percent respectively, and a new direction is provided for the preparation of rare saponin in the fieldAnd the idea; in addition, the ginsenoside composition obtained by the invention has stronger repairing capability on keratinocytes.)

一种人参皂苷组合物的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种人参皂苷组合物的制备方法及其应用。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Mey.)，为五加科人参属多年生草本植物，始载于《神农本草经》，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺等功效，是一种常见的滋补强壮药，主要活性成分为人参皂苷。人参皂苷是一种固醇类化合物，在人参中有多种单体类型，它是由糖链和苷元连接而成的三萜类化合物。人参皂苷能够影响多重代谢通路，某些稀有的人生皂苷可明显地预防癌症，抑制肿瘤和癌细胞，被应用于抗癌临床治疗和癌症药物开发领域。人参中皂苷Rb₁、Rd、Re等含量较高，而Rg₁、Rg₃、Rh₁、Rh₂等为稀有人参皂苷，具有更高的活性，在改善记忆力及肿瘤防治方面效果独特。被人体吸收时，皂苷需要先经过降解脱糖基化，二醇型皂苷被分解为CK进入血液；三醇型需要水解成原人参三醇(Ppt)才能进入血液。尽管人参中天然人参皂苷含量丰富，但在人类肠胃中的吸收很差，且具有真正药理功效的皂苷代谢物CK和Ppt等含量极少，这些都使得食用人参后机体内血药浓度很难达到充分发挥药理活性的浓度。寻找可行的提取方法或生产高价值稀有人参皂苷单体的工艺路径是深入研究的重点和难点，而大量制备次级皂苷和苷元，具有极高的药用价值和商业价值。

利用微生物对人参根、花、籽等作为底物进行发酵，是研究者在了解人参活性成分功效特性的基础上，为解决稀有人参皂苷种类少，含量低，提取难度大等实际问题，结合生物转化技术和发酵技术进行的具有重要实际探索价值的深入研究。其原理是通过微生物在及代谢过程中产生的一种或多种酶对人参皂苷的C-3、C-6及C-20位置上的糖链进行结构性的修饰、通过酶催化反应将糖苷键进行水解，从而把人参中的主要人参皂苷定向转化成稀有人参皂苷或分解为苷元，使人参发酵提取物中的人体可直接摄入功效成分种类和数量明显提升。此外，相比直接提取植物成分，发酵技术通过适宜的温度、pH、氧气以及营养成分可以使菌丝的生长繁殖和新陈代谢都很旺盛，得到大量的菌丝或者次级代谢产物。

通过有益微生物(probiotic bacteria)及其代谢的葡萄糖裂合酶进行人参皂苷的裂解转化，能够有利于人体的更高效吸收。乳酸菌和芽孢杆菌是人参发酵研究中最常见的菌种，然而相比毕赤酵母真核表达体系、乳酸菌和芽孢杆菌等原核细菌的发酵周期长(如16d)，而毕赤酵母具备糖基化、蛋白质磷酸化和脂肪酰化等翻译后的加工修饰酶蛋白，表达的目标皂苷转化酶活性和产量高，可能会缩短皂苷转化发酵周期及提升目标稀有皂苷的产量。即便有部分关于使用毕赤酵母进行人参皂苷制备的记载，但底物主要是葡萄糖或人参皂苷前体物等通过达玛烯二醇代谢途径合成人参皂苷前体，产量和转化率均很低。

因此，仍有必要进一步通过代谢工程或过程工程技术来增加毕赤酵母三萜合成途径的代谢通路，进一步提高稀有皂苷生产效率和产量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中使用巴斯德毕赤酵母生产稀有人参皂苷产量低的缺陷，提供一种人参皂苷组合物的制备方法及其应用。

本发明创造性地使用巴斯德毕赤酵母CCTCC NO.M 2016763，通过生物发酵转化工艺，首次将人参全株提取物中的大分子量的人参皂苷生物降解为小分子量的人参皂苷(例如Rd、CK、Rg₂以及Rg₃等)，并特异性地转化获得更高比例的稀有人参皂苷。一方面利用了酵母生长代谢过程中代谢产物，另一方面利用酵母生物转化人参全株提取物中的稀有人参皂苷，使得发酵产物滤液在抗老和细胞修复等方面具有良好的护肤功效。

本发明提供一种人参皂苷组合物的制备方法，其包括使用巴斯德毕赤酵母CCTCCNO.M 2016763对人参全株提取物进行发酵，即得。

所述的制备方法较佳地包括下述步骤：

(1)将所述巴斯德毕赤酵母CCTCC NO.M 2016763的种子液按0.5～5v/v％接种于0.2～5wt％人参全株提取物溶液；

(2)在25～35℃下，进行发酵转化。

其中，步骤(1)中所述的0.2～5wt％人参全株提取物溶液中的溶剂可为本领域常规，例如水；较佳地，所述的0.2～5wt％人参全株提取物溶液为将人参全株提取物冻干粉溶解于去离子水中获得(即所述人参全株提取物冻干粉与所述水混合所得溶液，所述人参全株提取物冻干粉占所述人参全株提取物冻干粉与所述离子水总重量的0.2～5％)。

较佳地，所述种子液的接种体积为1v/v％，所述人参全株提取物溶液中所述人参全株提取物冻干粉的浓度为1wt％。

所述的人参全株提取物冻干粉可为本领域常规的人参全株提取物冻干粉，优选1％人参全株提取物冻干粉。

所述1％人参全株提取物冻干粉的制备方法可为本领域常规。较佳地，所述制备方法包括：将人参样品打碎后溶于水、水浴加热、过滤得滤液、将所述滤液旋蒸浓缩、真空干燥后即得；所述人参样品和所述水的质量体积百分比为1％，所述质量体积百分比的单位为g/mL；所述的人参样品中，根、茎叶、花和籽的质量比为(80～95):(1～10):(0.5～5):(0.5～5)，较佳地为90:5:2.5:2.5。所述水浴加热的温度较佳地为92～98℃，更佳地为96℃。所述水浴加热的时间较佳地为1.5～2.5h，更佳地为2.0h。

为保证所述人参全株提取物溶液的活性、避免污染并利于后续冷冻真空干燥，在上述过滤得滤液后将所述滤液于-20℃下冻存48h。

上述步骤(1)中种子液可通过本领域的常规方法制备得到，较佳地通过下述步骤获得：

a.将巴斯德毕赤酵母CCTCC NO.M 2016763接种于马铃薯葡萄糖培养基中，振荡培养16～18h获得初步种子液；

b.将步骤a.获得的所述初步种子液按5v/v％接种量接种于马铃薯葡萄糖培养基，振荡培养16～18h获得种子液；

上述振荡培养的速度优选200rpm。

在上述制备方法的步骤(2)中，所述发酵转化的温度优选30℃。

步骤(2)中所述的发酵转化的转速较佳地为150～250rpm，更佳地为200rpm。

为保证菌体正常生长代谢过程对氧的需求，步骤(2)中的发酵转化较佳地在通入气体的状态下进行；所述气体较佳地为无菌空气，所述通入气体的速度较佳地为1000～3000ccm，更佳地为2000ccm。

本发明提供一种根据上述的制备方法制备得到的人参皂苷组合物。

本发明提供一种上述人参皂苷组合物在制备人角质细胞修复剂中的应用，所述的人角质细胞修复剂优选为护肤品或者化妆品的形式。

本发明提供一种巴斯德毕赤酵母CCTCC NO.M 2016763在制备人参皂苷组合物或者人角质细胞修复剂中的应用；

所述的人参皂苷组合物优选稀有人参皂苷，所述的稀有皂苷为，例如Rd、CK、Rg₂以及Rg₃；

所述的人角质细胞修复剂优选为护肤品或者化妆品的形式。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的巴斯德毕赤酵母经生物发酵转化工艺后，相比人参全株提取物底物，发酵滤液中Rd、CK、R-Rg₃等稀有皂苷的提升幅度分别可高达9％、37％和2400％，为本领域稀有皂苷的制备提供了新的方向和思路；此外，本发明制备得到的人参皂苷组合物具有很强的角质细胞的修复能力。

生物材料保藏信息

本发明的航天酵母JBA-SP02-DZ-08-Gly-01，已于2016年12月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心，邮编：430072，保藏编号为：CCTCC NO:M 2016763，培养物名称是JBA-SP02-DZ-08-Gly-01，分类命名是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。

附图说明

图1A～C为二代太空酵母发酵液发酵前后HPLC图谱。

图2为发酵前后不同终浓度发酵液的划痕修复效果。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1巴斯德毕赤酵母转化稀有人参皂苷

1、1％人参全株提取物的制备

按根:茎叶:花:籽＝90:5:2.5:2.5的比例(重量比)，取200g人参全株样品，粉碎机打碎至20目左右，加入2000mL去离子水，96℃水浴加热2h，过滤离心得到滤液；滤渣再加入2000mL去离子水，水浴加热2h，过滤离心，得到滤液；所得到的滤液经过旋蒸浓缩，放入-20℃冰箱冻存48h后，真空冷冻干燥获得1％人参全株提取物冻干粉。

2、巴斯德毕赤酵母转化人参皂苷实验

以马铃薯葡萄糖肉汤(1L培养基含马铃薯提取物0.6％、葡萄糖2.0％，pH为5.6±0.2)为种子培养基，挑取SP-02-DZ-08的-80℃保藏管中菌液，于摇床30℃，200rpm振荡培养，16～18h后获得初步种子液。按5％接种量，同条件下扩培获得200mL种子液，转入2.0L已灭菌1％人参全株提取物发酵培养基(亦可称为1％人参全株提取物溶液，通过将上述制备得到的1％人参全株提取物冻干粉溶于去离子水中后获得)中。30℃，200rpm，2000ccm，发酵转化人参皂苷48h。发酵液于4℃，4000rpm，10min离心去细胞，取上清过300目无菌滤布，获得航天酵母人参提取物发酵滤液，重复转化实验共三批次，分别为批次1：Lot20170929、批次2：Lot20171018和批次3：Lot20171021。

3、人参皂苷HPLC分析

采用Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent Eclipse C18plus(150mm×4.6mm，5μm)，流动性为乙腈-0.1％磷酸水溶液进行梯度洗脱，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长203nm。以人参皂苷标准品为对照，以保留时间定性，外标法定量，对发酵前后的人参皂苷进行分析(详见图1A～C)。

4、测试结果

由表1可知，发酵前后，一些分子量较大的人参皂苷(如Rg₁，Re,Rb₁,Rb₂,Rb₃,Ro,Rc等)含量都降低了，而一些相对分子量较小的人参皂苷(如Rg₂,Rg₃,Rg₅,CK等)的含量都有所升高。

表1人参提取物经过太空酵母SP02-DZ-08发酵前后人参皂苷含量(mg/mL)的变化

实施例2巴斯德毕赤酵母人参发酵物的细胞划痕修复

研究航天酵母SP02-DZ-08的1％人参全株提取物发酵产物，对人角质细胞划痕损伤的影响。

表2待测样品及浓度

样品名	全成分	终浓度
			1％人参提取物	1％人参提取物	1％，0.05％
SP02-DZ-08的1％人参全株提取物发酵产物	1％人参提取物发酵液	1％，0.05％

1)细胞培养：角质细胞(AL17003FK P2)，以200000个/孔种于6孔板中，37℃的5％CO₂细胞培养箱中培养3天。

2)样品处理：发酵前后溶液过滤除菌后，用培养基稀释100和200倍，最终测试浓度为最终测试浓度为1％。细胞在含有待测样品的培养基中37℃，5％CO₂，培养24小时。

3)染色：用吉姆萨染液染色观察，拍照并记录划痕愈合情况。

4)实验结果

根据图2可知：相比对照组，人参提取物有一定的促进人角质细胞修复划痕的能力，发酵后的人参提取物修复能力更强。