阅读说明：本技术 百里香酚-壳寡糖复合物及其制备方法和应用 (Thymol-chitosan oligosaccharide compound and preparation method and application thereof ) 是由 曹汝鸽 于洋 马乾伟 周中凯 于 2020-03-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于食品领域,具体涉及一种百里香酚-壳寡糖复合物及其制备方法和应用。百里香酚-壳寡糖复合物为壳寡糖、百里香酚利用离子交联法交联形成的复合物。本发明以百里香酚和壳寡糖为原料,根据二者活性和结构的特点,通过离子交联法制备了百里香酚-壳寡糖复合物,发现复合物的抑菌性和抗氧化能力均得到显著提高,通过扫描电镜观察发现其呈现球状或块状结构,经过红外与核磁共振分析复合物分子的结构,发现百里香酚分子进入壳寡糖与TPP经电荷作用形成的疏水空腔中,利用分子间的静电作用力及疏水相互作用维持分子结构的稳定。将复合物制成涂膜喷洒于南国梨表面,贮藏实验证明百里香酚-壳寡糖复合物可显著提升南国梨的贮藏保鲜性质。(The invention belongs to the field of food, and particularly relates to a thymol-chitosan oligosaccharide compound and a preparation method and application thereof. The thymol-chitosan oligosaccharide compound is a compound formed by crosslinking chitosan oligosaccharide and thymol by an ion crosslinking method. According to the invention, thymol and chitosan oligosaccharide are used as raw materials, according to the characteristics of activity and structure of thymol and chitosan oligosaccharide, a thymol-chitosan oligosaccharide compound is prepared by an ion crosslinking method, the antibacterial activity and the oxidation resistance of the compound are obviously improved, the compound is observed by a scanning electron microscope to be in a spherical or block structure, the structure of a compound molecule is analyzed by infrared and nuclear magnetic resonance, the thymol molecule enters a hydrophobic cavity formed by charge interaction between chitosan oligosaccharide and TPP, and the stability of the molecular structure is maintained by utilizing the electrostatic acting force and hydrophobic interaction between molecules. The compound is prepared into a coating film and sprayed on the surface of the south China pear, and storage experiments prove that the thymol-chitosan oligosaccharide compound can obviously improve the storage and preservation properties of the south China pear.)

百里香酚-壳寡糖复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于食品领域，具体涉及一种百里香酚-壳寡糖复合物及其制备方法和应用。

背景技术

百里香酚属于单苯基酚，广泛存在于百里香属植物中，具有抑菌、抗氧化、抗发炎以及促进伤口愈合等作用，在医药和食品领域应用广泛。壳寡糖是由天然糖中唯一带正电的碱性氨基多糖壳聚糖降解而得，溶解性和吸收性均优于壳聚糖，且具有抗氧化、增强免疫力、抑菌、抗肿瘤等多种生物活性作用。研究表明，通过多酚和寡糖之间的相互作用，能够增强多酚的抗氧化、降血糖、抗凝血等生物活性，并能够影响多酚生物利用率，改善食品风味以及营养价值。

目前利用TPP将壳寡糖与百里香酚结合形成复合物的研究还未见报道，本发明探究百里香酚-壳寡糖复合物的离子交联制备方法并对其分子结构进行表征，评价复合物抗氧化和抑菌活性，并将其应用于南国梨的贮藏实验，为果蔬贮藏保鲜提供一种新的新途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种离子交联法制备壳寡糖-百里香酚复合物的方法。

本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种百里香酚-壳寡糖复合物，为壳寡糖、百里香酚利用离子交联法交联形成的复合物。

所述的百里香酚与壳寡糖的质量比为1:2-8。

优选的，所述的百里香酚与壳寡糖的质量比为1:5。

所述的壳寡糖分子量为1500Da。

所述的交联剂为三聚磷酸钠TPP。

本发明还包括一种制备所述的百里香酚-壳寡糖复合物，具体步骤如下：

⑴用醋酸溶液作为溶剂配制百里香酚溶液，在百里香酚溶液中加入壳寡糖并搅拌均匀得到百里香酚与壳寡糖的混合溶液；

⑵配制交联剂溶液，将百里香酚与壳寡糖的混合溶液逐滴滴入交联剂溶液中；

⑶反应结束后，离心收集产物用透析袋去除游离多酚后进行冻干用于后续的分析。

优选的，百里香酚溶液为1mg/mL的百里香酚醋酸溶液；壳寡糖溶液为5mg/mL的壳寡糖溶液；三聚磷酸钠溶液为1mg/mL的三聚磷酸钠水溶液；

本发明还包括一种权利要求1-4任一项所述的百里香酚-壳寡糖复合物的应用，其特征在于，在食品果蔬贮藏保鲜。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明以百里香酚和壳寡糖为原料，根据二者活性和结构的特点，通过离子交联法并利用三聚磷酸钠作交联剂制备了百里香酚-壳寡糖复合物，发现复合物的抑菌性和抗氧化能力均得到显著提高，通过扫描电镜观察发现其呈现球状或块状结构，经过红外与核磁共振分析复合物分子的结构，发现百里香酚分子进入壳寡糖与TPP经电荷作用形成的疏水空腔中，利用分子间的静电作用力及疏水相互作用维持分子结构的稳定。将复合物制成涂膜喷洒于南国梨表面，贮藏实验证明百里香酚-壳寡糖复合物可显著提升南国梨的贮藏保鲜性质。

本发明选用分子量为1500Da壳寡糖与百里香酚为原料以三聚磷酸钠为离子交联剂制备复合物，全面评价了复合物的抗氧化性与抑菌性，并系统地对复合物分子结构进行了解析。对复合物的抑菌性进行评价，证明其对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果显著。对复合物的抗氧化性进行测定，得出其对ABTS+、DPPH自由基清除率及其总抗氧化性均得到显著增强。由扫描电镜分析、紫外分光光度计、傅立叶变换红外光谱、热重分析、¹H-NMR分析表明复合物被成功制备且具有稳定构象。

附图说明

图1为细菌生长曲线图：大肠杆菌(a)、铜绿假单胞菌(b)、金黄色葡萄球菌(c)、枯草芽孢杆菌(d)；

图2为百里香酚-壳寡糖复合物处理前后大肠杆菌(a、a’)、铜绿假单胞菌(b、b’)、金黄色葡萄球菌(c、c’)、枯草芽孢杆菌(d、d’)的菌体电镜扫描图；

图3为壳寡糖(a)、百里香酚(b)、百里香酚和壳寡糖的混合物(c)与百里香酚-壳寡糖复合物(d)的扫描电镜图；

图4为壳寡糖、百里香酚、百里香酚和壳寡糖混合物(B-CT)、三聚磷酸钠和壳寡糖混合物(T-C)和百里香酚-壳寡糖复合物(T-CT)的紫外光谱图；

图5为壳寡糖、百里香酚、三聚磷酸钠与百里香酚-壳寡糖复合物(T-CT)的红外光谱图；

图6壳寡糖、百里香酚与百里香酚-壳寡糖复合物(T-CT)的¹H-NMR图；

图7为壳寡糖、百里香酚、三聚磷酸钠和百里香酚-壳寡糖复合物(T-CT)的热重光谱图；

图8为百里香酚-壳寡糖复合物的二维模拟结构图；

图9为在不同贮藏时间南果梨的失重率、硬度、可溶性固形物含量、VC含量图。

具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

材料与试剂:百里香酚(MW150.22Da)阿拉丁试剂有限公司；壳寡糖(MW1500Da)浙江金壳药业有限公司；2，2连氨基双二铵盐(ABTS)、6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，福林酚均购于北京索莱宝科技有限公司；2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)购于美国Sigma公司；大肠杆菌(ATCC10305)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、铜绿假单胞菌(ATCC15442)、枯草芽孢杆菌(ATCC6633)来自中国通用微生物收集中心。酵母提取物和胰蛋白胨购于英国OXOID公司。甲醇(分析纯)、无水乙醇(分析纯)，冰醋酸(分析纯)均购于天津市康科德科技有限公司；盐酸(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)、β-巯基乙醇、SDS溶液、硼砂均购于天津市北方天医化学试剂厂；氯化钠(分析纯)、抗坏血酸(分析纯)均购于天津市化学试剂一厂；琼脂购于厦门市赫凯生物科技有限公司；2，6-二氯靛酚(分析纯)、草酸(分析纯)均购于上海伊卡试剂。

主要仪器与设备:ALPHA 1-2LD PLUS冷冻干燥机，德国Marin Christ公司；SU-1510扫描式电子显微镜(SEM)，日本日立公司；89090A紫外分光光度计，美国安捷伦科技有限公司；IS50傅立叶红外光谱仪，美国尼高利公司；TGA-Q50热重分析仪，美国TA仪器；FG2pH仪，梅特勒-托利多；KQ3200B超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；Epoch2多功能酶标仪，美国Thermo公司；400MHZ核磁共振波谱仪，德国布鲁克科技有限公司；

实施例1：一种百里香酚-壳寡糖复合物，包括三聚磷酸钠(交联剂)、百里香酚以及壳寡糖，其中百里香酚与壳寡糖的质量比为1:2。制备方法如下：

(1)以三聚磷酸钠、百里香酚、壳寡糖(分子量1500Da)为原料；

(2)用1％的醋酸溶液作为溶剂配制1mg/mL的百里香酚溶液，在20mL的百里香酚溶液中分别加入40mg的壳寡糖并搅拌均匀；

(3)配制20mL 1mg/mL的三聚磷酸钠溶液，将百里香酚与壳寡糖的混合液中滴入三聚磷酸钠溶液；

(4)反应2h后，在10000r/min下离心20min收集复合物，用500Da的透析袋去除游离多酚后进行冻干，得到的成品即百里香酚-壳寡糖复合物；

(5)对复合物进行分子结构解析，评价复合物的抑菌性、抗氧化性、并从分子结构层面解释功能活性和物理性质的变化机理。

实施例2：实施例2与实施例1相似，区别仅在于，其中百里香酚与壳寡糖的质量比为1:5。

实施例3：实施例2与实施例1相似，区别仅在于，其中百里香酚与壳寡糖的质量比为1:8。

对比例1:壳寡糖与百里香酚物理混合物的制备方法：

(1)以百里香酚、壳寡糖(分子量1500Da)为原料；

(2)用1％的醋酸溶液作为溶剂配制1mg/mL的百里香酚溶液，在20mL的百里香酚溶液中分别加入40mg的壳寡糖并搅拌均匀；

(3)反应2h后，在10000r/min下离心20min收集混合物，用500Da的透析袋去除游离多酚后进行冻干，得到的成品即百里香酚与壳寡糖的物理混合物；

对比例2：壳寡糖与TPP的聚合电解质的制备方法为：

(1)以三聚磷酸钠、壳寡糖(分子量1500Da)为原料；

(2)配制20mL 5mg/mL的壳寡糖溶液并搅拌均匀；

(3)配制20mL 1mg/mL的三聚磷酸钠溶液，将壳寡糖溶液中滴入三聚磷酸钠溶液；

(4)反应2h后，在10000r/min下离心20min收集上清液冻干，得到的成品即壳寡糖与TPP的聚合电解质；

实验方法：

1、抑菌性测定：以革兰氏阴性大肠杆菌与铜绿假单胞菌以及革兰氏阳性金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌作为测试菌株，用添加壳寡糖与百里香酚物理混合物及其百里香酚-壳寡糖交联复合物培养的细菌与正常生长的细菌作对比绘制细菌生长曲线。取大约10⁶CFU/mL的细菌10μL，放入LB培养基中培养24h，每隔3h取菌液测试在600nm处的吸光度以绘制细菌的生长曲线。再将以上四种菌体在LB培养基中培养6h，以获得新鲜具有活力的菌液。传代时分别加入壳寡糖、百里香酚、壳寡糖与百里香酚物理混合物及其复合物于LB培养基中再培养6h。将菌液在5000r/min下离心6min，倒去培养基收集菌体；用0.9％的NaCl溶液清洗菌体，用移液枪小心地吹吸数次，离心；清洗3次后，收集菌体用2.5％(v/v)的戊二醛固定12h；将菌体用无菌蒸馏水快速清洗二次，菌体用25％，50％，70％，80％，90％和100％的酒精梯度脱水；最后取5μL菌体放在清洁盖玻片小块上，置于超净台中自然风干。利用SEM观察菌体的形态。

2、抗氧化性分析

2.1DPPH自由基清除率测定：用无水乙醇配置2×10^-4mol/mL的DPPH溶液为工作液。然后加入不同样品与一定量的DPPH溶液以及无水甲醇溶液避光放置30min，517nm处测吸光度。对照Trolox标准曲线以其当量表示其抗氧化能力。

2.2ABTS⁺自由基清除率的测定：用双蒸馏水配制7mM ABTS和2.45mM过硫酸钾的储备溶液(2:1)，在室温下避光保持16h形成蓝绿色ABTS⁺。通过混合ABTS⁺和乙醇(1:20)制备工作溶液。向5mL工作溶液中加入200μL待测样品，静置10min后，在734nm处测量吸光度。对照Trolox标准曲线计算样液的ABTS自由基清除率。

2.3FRAP清除率的测定：配制FRAP工作液，300mmol/L pH3.6的乙酸钠缓冲液、10mmol/L的TPTZ溶液(溶剂为40mmol/L的HCl溶液)以及20mmol/L的FeCl₃·6H₂O溶液，三者以体积10:1:1的比例混合均匀。FRAR溶液与样品混合均匀，在37℃下水浴30min，在593nm处测吸光值。最后利用Trolox标准溶液绘制标准曲线，其抗氧化能力以对应Trolox当量计算。

3、扫描电镜分析:观察冻干后的壳寡糖和百里香酚单体粉末，以及两种单体物质通过物理混合以及以交联作用形成的复合物的形态。使用SEM在低真空下以15kV加速电势下观察不同样品的结构形态。

4、紫外全波长扫描:取200μL样品溶液置于比色皿中，利用紫外分光光度计在200-600nm处进行全波长扫描，观察其特征吸收峰位置。

5、红外光谱扫描:准确称取1mg样品，加上150mg的KBr快速研磨，倒入模具压片45s，用洗耳球吹去表面多余的粉末后快速放入样品池内进行扫描。利用傅里叶红外光谱仪测定在4000-400cm^-1范围内的红外光谱图。

6、核磁共振分析:准确称量10mg样品溶于DMSO-d₆中，以5000r/min转速离心5min后用注射器吸取上清液注入5mm核磁管中进行检测。设定取样时间2.18s，扫描次数64次。

7、自由氨基减少率测定:首先配制OPA试剂：40mg邻苯二醛的甲醇溶液1mL、20％(w/v)的SDS溶液2.5mL、0.1mol/L的硼砂溶液25mL、β-巯基乙醇100μL混合加入后用蒸馏水定容至50mL。然后，取OPA试剂4mL于试管中，加入等量壳寡糖的不同样品溶液200μL，混匀后于35℃反应2min。利用酶标仪在340nm处测定吸光值。百里香酚-壳寡糖复合物中氨基减少率按以下公式进行计算。

8、热重测试:准确称取4mg样品，放入坩埚中，升温速度为20℃/min，测试温度范围40-600℃，氮气为保护气。

9、涂膜对贮藏中南果梨品质的作用:南果梨因其独特口感和酒香味深受大众喜爱。刚采摘的南果梨果肉偏硬2周后梨皮呈亮黄色且硬度适中，此时果实不耐磕碰，增加了其保藏与运输的难度。将大小均匀形态完好及同一时期采摘的南果梨随机分为6组，分别放置在不同涂膜基质中，30s后取出常温下风干。观察在常温贮藏条件下南果梨的失重率、硬度、糖分含量及VC含量的变化。处理方式见表1。

表1

结果与分析：

1、百里香酚-壳寡糖复合物中百里香酚的承载率和自由氨基减少率。

表2为交联复合物中不同浓度的壳寡糖对百里香酚的承载量表2

表2显示，当壳寡糖浓度为5mg/mL时，复合物对百里香酚的承载量最高，可达到52.30mg/g。

下面以壳寡糖浓度为5mg/mL时即实施例2为代表实施例进行说明。

表3示出不同样品中壳寡糖自由氨基的减少率。

表3

表3表明，壳寡糖与TPP结合自由氨基减少率为37.45％。当壳寡糖与TPP和百里香酚结合时，自由氨基减少率为40.63％，相对于只与TPP结合无明显差异说明壳寡糖上带正电荷的氨基主要与三聚磷酸钠带负电荷的磷酸基团通过电荷吸引结合在一起。

2、抑菌分析:图1为细菌生长曲线图，其中大肠杆菌(a)、铜绿假单胞菌(b)、金黄色葡萄球菌(c)、枯草芽孢杆菌(d)；从图1可看出，对比例1壳寡糖与百里香酚物理混合物(Added B-CT)对细菌生长具有一定的抑制作用；而经过实施例2百里香酚-壳寡糖复合物处理(Added T-CT)的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的数量均显著降低这表明复合物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较强的抑菌效果。

图2为实施例2百里香酚-壳寡糖复合物处理前后大肠杆菌(a、a’)、铜绿假单胞菌(b、b’)、金黄色葡萄球菌(c、c’)、枯草芽孢杆菌(d、d’)的菌体电镜扫描图；如图2所示，百里香酚-壳寡糖复合物会破坏细菌的细胞膜结构，使得菌体破裂不完整，对革兰氏阴性细菌细胞膜破坏的程度更大。菌体周围有可能有细菌内溶物如DNA、RNA、蛋白质等，部分可能由于内溶物粘液的存在，杂质粘附在表面。

3、抗氧化性分析:由表4可知，实施例2百里香酚-壳寡糖复合物的抗氧化能力明显高于壳寡糖单品、百里香酚单品以及两者的物理混合物(对比例1)，两者复合后其抗氧化能力显著增高(p<0.05)。酚羟基是黄酮类化合物发挥抗氧化作用的主要活性基团，其中，B环的酚羟基活性最高。由此推测，百里香酚-壳寡糖复合物抗氧化能力的提高，可能是由于复合物中引入壳寡糖中亲水羟基基团以及复合物形成过程氢键共同作用的结果。表4壳寡糖、百里香酚、壳寡糖与百里香酚物理混合物及百里香酚-壳寡糖复合物的抗氧化活性表4

4、显微结构分析：图3为壳寡糖(a)、百里香酚(b)、壳寡糖和百里香酚混合物(c)与百里香酚-壳寡糖复合物(d)的扫描电镜图；图3显示，冻干后的壳寡糖单体呈现碎片杂乱状。百里香酚分子较小，呈现小颗粒状。壳寡糖与百里香酚物理混合物呈现片状或条状无规则状态，其形态与单体壳寡糖相似，可观察到小颗粒状的百里香酚。复合物呈球状或块状状态，表面相对光滑，其大小存在差异。

5、紫外测试分析：图4为壳寡糖、百里香酚、壳寡糖与百里香酚混合物(B-CT)、三聚磷酸钠与壳寡糖复合物(T-C)和百里香酚-壳寡糖复合物(T-CT)的紫外光谱图；由图4可看出，壳寡糖以及壳寡糖与TPP的聚合电解质(T-C)在测试波长区间内并未出现吸收峰。百里香酚的特征吸收峰在276nm处，壳寡糖与百里香酚物理混合物(B-CT)的特征吸收峰仍然在276nm处，而百里香酚-壳寡糖复合物(T-CT)在271nm处出现吸收峰，。复合后百里香酚的特征峰出现偏移，而物理混合的百里香酚特征峰未出现偏移，证明用TPP交联后，壳寡糖与百里香酚成功地复合为新的分子。

6、红外光谱分析：图5为壳寡糖、百里香酚、三聚磷酸钠与百里香酚-壳寡糖复合物(T-CT)的红外光谱图；由图5可看出，百里香酚-壳寡糖复合物光谱中在1149cm^-1出现了磷酸基团的特征吸收峰，带负电荷的磷酸基团与壳寡糖中带正电荷的氨基基团通过离子作用结合在一起。百里香酚-壳寡糖复合物图谱中苯环的特征吸收峰强度发生变化甚至消失，这说明百里香酚负载在壳寡糖分子上形成新的复合物使得其特征吸收峰发生变化。图谱中未出现新峰表明复合物中并没有形成新的基团，说明其可能是依靠范德华力、离子作用等非共价键连接的。

7、¹H-NMR分析：图6壳寡糖、百里香酚与百里香酚-壳寡糖复合物(T-CT)的¹H-NMR图；如图6所示，复合后百里香酚的H3，H4，H6的信号峰向高场移动，化学位移变化值(Δδ)大小关系为：H3，H4(0.04ppm)>H6(0.02ppm)，由此可推测百里香酚H3与H4位置与壳寡糖相互靠近，这个过程可能削弱了羟基中氢和氧之间的共价键，使羟基供氢更容易，从而增强了复合物的抗氧化性。百里香酚中H3，H4的相似化学位移改变量(Δδ)也出现在与β-CD相互作用中，由此推测壳寡糖与三聚磷酸钠之间可能通过离子相互作用形成类似环糊精中的疏水空腔结构，这种结构吸引小分子百里香酚从而使复合物达到稳定状态。

8、热稳定性分析：图7为壳寡糖、百里香酚、三聚磷酸钠和百里香酚-壳寡糖复合物(T-CT)的热重光谱图；由图7可知，当温度达到50℃时百里香酚单体开始蒸发分解，其重量快速下降，当温度达到170℃时其重量损失接近100％。壳寡糖分子在达到232℃时，重量随温度升高而下降，在温度为570℃时其重量损失了65％。百里香酚-壳寡糖复合物在232℃开始发生热分解，相对而言其分解速度稍慢。最后达到稳定时重量损失57％。交联后复合物分子热稳定性较好，可能是由于TPP与壳寡糖形成复合电解质其分子更加稳定，百里香酚分子被包封其中使得复合物整体热稳定性增强。

综上对百里香酚-壳寡糖复合物的红外、核磁以及氨基减少率的分析推测其形成特点。TPP带负电荷的磷酸基团，与壳寡糖带正电荷的氨基基团通过静电作用结合形成疏水内腔，百里香酚进入疏水空腔，三者形成一个稳定的结构。图8为TPP-壳寡糖-百里香酚复合物的二维模拟结构图；

9、涂膜对贮藏中南果梨品质的作用分析：为在涂膜前后不同贮藏时间南果梨的失重率、硬度、可溶性固形物含量、VC含量图。如图9所示,得益于复合物良好的抑菌性和抗氧化性，将其作为涂膜应用于南国梨表面可显著延缓南果梨的软化及重量损失，减缓VC含量的损失速率，在贮藏期具有良好的保鲜效果。因此，本发明中制备的复合物在果蔬贮藏保鲜中有较好的应用前景。

以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。