阅读说明：本技术 一种山慈菇均一多糖及其应用 (Pseudobulbus cremastrae seu pleiones homogeneous polysaccharide and application thereof ) 是由 李晓军 张雪 于 2020-07-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种山慈菇均一多糖及其应用,S1、取干燥山慈菇,先对干燥的山慈菇饮片进行乙醇脱脂处理,脱过脂的山慈菇饮片进行水提醇沉操作,低温烘干,除去其中乙醇,制得山慈菇多糖粗品,S2、对步骤S1中获得的山慈菇多糖粗品用水溶解后上氯型阴离子交换柱,本发明涉及天然药物技术领域。该山慈菇均一多糖及其应用,通过从山慈菇中提取分离得到山慈菇均一多糖,并对其结构进行详细的鉴定,同时山慈菇均一多糖能够显著性提高RAW264.7细胞的免疫活性,同时,具有很好的抗氧化活性,有望成为预防和治疗免疫低下病人的免疫调节剂,同时本发明制备方案简单,可以快速得到高纯度的均一多糖,适合于规模化生产。(The invention discloses a pseudobulb uniform polysaccharide and application thereof, S1, taking dry pseudobulb, firstly carrying out ethanol degreasing treatment on dry pseudobulb decoction pieces, carrying out water extraction and alcohol precipitation operation on the degreased pseudobulb decoction pieces, drying at low temperature, removing ethanol in the pseudobulb decoction pieces to prepare a pseudobulb polysaccharide crude product, S2, dissolving the pseudobulb polysaccharide crude product obtained in the step S1 with water, and then feeding the pseudobulb polysaccharide crude product to a chlorine type anion exchange column. The iphigenia indica homogeneous polysaccharide and the application thereof are characterized in that the iphigenia indica homogeneous polysaccharide is obtained by extracting and separating from the iphigenia indica, the structure of the iphigenia indica homogeneous polysaccharide is identified in detail, meanwhile, the iphigenia indica homogeneous polysaccharide can remarkably improve the immunocompetence of RAW264.7 cells, and meanwhile, the iphigenia indica homogeneous polysaccharide has good antioxidant activity and is expected to become an immunomodulator for preventing and treating patients with low immunity.)

一种山慈菇均一多糖及其应用

技术领域

本发明涉及天然药物技术领域，具体为一种山慈菇均一多糖及其应用。

背景技术

山慈菇，是兰科植物中的独蒜兰干燥的假鳞茎。山慈菇最早在本草拾遗中出现，在中国药典中归属为少常用药。味甘，微辛、寒、归肝、脾经，具有很好的清热解毒和消痈散结的作用。作为常规的中药，已经有报道对山慈菇多糖进行研究。

其中山慈菇含有原儿茶酸、丁二酸、天麻苷、胡萝卜素、多糖。其中关于多糖的研究，主要集中于山慈菇多糖对肝癌小鼠H22和乳腺癌小鼠4T1的抗肿瘤活性最多，这也符合了中药所述的消痈散结的特点。另外山慈菇多糖提取物对胃癌，大肠癌和脑癌等多种肿瘤均有很好的抑制作用。山慈菇多糖在总的化合物中含量最高。但是目前的研究仅仅局限于粗多糖，或者提取物。关于其结构研究的内容较少，至今还没有关于从山慈菇中提取纯化得到均一多糖并对其均一多糖化学的研究报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种山慈菇均一多糖及其应用，以拓宽山慈菇的应用性范围。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种山慈菇均一多糖，其制备方法具体包括以下步骤：

S1、取干燥山慈菇，先对干燥的山慈菇饮片进行乙醇脱脂处理，脱过脂的山慈菇饮片进行水提醇沉操作，低温烘干，除去其中乙醇，制得山慈菇多糖粗品；

S2、对步骤S1中获得的山慈菇多糖粗品用水溶解后上氯型阴离子交换柱，使用水进行洗脱，硫酸-苯酚法追踪洗脱曲线，收集含糖溶液，进行浓缩，8000Da 透析袋透析，干燥，得到山慈菇水相多糖；

S3、将步骤S2中获得的水相多糖上用8000Da的透析袋进行透析，然后进行冷冻干燥，即得所述山慈菇水组分多糖，收集的水洗脱组分进行8000Da膜超滤，也可以得到山慈菇水组分多糖；

S4、将步骤S3中得到的山慈菇水组分多糖用0.1-0.3mol/L的NaCl溶液溶解，离心，取上清液过0.22μm的滤膜，上样，用0.1-0.3mol/L的NaCl溶液进行洗脱，利用示差检测器进行检测，根据峰形进行收集、浓缩，采用1000Da 的透析袋进行透析，即得到均一山慈菇多糖。

优选的，所述步骤S1包含如下具体操作：先对干燥的山慈菇饮片进行乙醇回流脱脂，残渣干燥后加入水，加热提取2-5次，合并提取药液，进行浓缩，高速离心，收集上清液进行醇沉，即得到山慈菇多糖粗品。

优选的，所述脱脂所用的乙醇的质量分数为45-95％，脱脂时的物料比例 (g/mL)为1：4-1：25，回流脱脂时间为1-24小时，加热提取温度为100℃，每次提取2-4小时。

优选的，所述步骤S1中醇沉时，加入4倍体积的质量分数为90-100％的乙醇，搅拌后，直到最终乙醇的质量分数为75-85％，静置4-48小时。

优选的，所述山慈菇均一多糖作为活性成分在细胞免疫调节中的应用。

均一山慈菇多糖可以是多种多样的，只要可以使其山慈菇多糖的有效活性达到体内的剂型都是可以的，比如，口服液、片剂、胶囊、颗粒剂、冲剂等。

有益效果

本发明提供了一种山慈菇均一多糖及其应用。与现有技术相比具备以下有益效果：该山慈菇均一多糖及其应用，通过从山慈菇中提取分离得到山慈菇均一多糖，并对其结构进行详细的鉴定，同时山慈菇均一多糖能够显著性提高 RAW264.7细胞的免疫活性，同时，具有很好的抗氧化活性，有望成为预防和治疗免疫低下病人的免疫调节剂，同时本发明制备方案简单，可以快速得到高纯度的均一多糖，适合于规模化生产。

附图说明

图1为实施例1的山慈菇多糖水洗脱的凝胶分离柱的色谱图；

图2为实施例2的山慈菇均一多糖的高效凝胶色谱图；

图3为实施例3的山慈菇均一多糖的红外谱图；

图4为实施例4的山慈菇均一多糖的单糖组成谱图；

图5为实施例5的山慈菇均一多糖的甲基化图；

图6为实施例6的山慈菇均一多糖的碳谱分析图；

图7为实施例7的山慈菇均一多糖提高RAW264.7细胞的一氧化氮的释放量示意图；

图8为实施例7的山慈菇均一多糖提高RAW264.7细胞的TNFα的释放量示意图；

图9为实施例8的山慈菇均一多糖的DPPH自由基清除能力测定图；

图10为实施例8的山慈菇均一多糖的铁离子还原能力测定图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-10，一种山慈菇均一多糖及其应用，具体包括以下实施例：

实施例1

山慈菇均一多糖的制备与鉴定

S1、取干燥山慈菇1KG，加入5L水，在煮沸的条件下，提取3次，后加入 4倍体积的乙醇进行醇沉，24小时，过滤，收集沉淀物进行干燥，除去残留乙醇，制得山慈菇多糖粗品；

S2、取制得的多糖粗品10g，加入100mL蒸馏水溶解，上样于氯型阴离子交换树脂DEAE-Fastflow层析柱，使用蒸馏水洗脱，使用硫酸-苯酚法检测糖含量并在酶标仪490nm处检测，得到洗脱曲线，收集含糖溶液，干燥，用8000Da的透析袋透析24小时后，冷冻干燥，制得山慈菇水相多糖；

S3、得到的山慈菇水组分多糖用0.2mol/L的NaCl溶液溶解，离心，取上清液过0.22μm的滤膜，上样，用0.2mol/L的NaCl溶液的氯化钠溶液进行洗脱，利用示差检测器进行检测，根据峰形(见图1)进行收集、浓缩，采用1000Da 的透析袋进行透析，即得到均一山慈菇多糖，简称SCGW。

实施例2

纯度与分子量测定

采用高效液相凝胶色谱法(HPGPC)，色谱柱为BRT105、104、102，检测器为示差检测器，流动相是0.05mol/L氯化钠溶液，柱温40℃，流速为0.6mL/min，进样体积为20uL，精密称取样品和标准品，样品配制成5mg/ml溶液，12000rpm 离心10min，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将样品转置于1.8ml进样小瓶中，进样量20μl，以不同相对分子质量的葡聚糖(Mw1152、5220、11600、 23800、48600、80900、148000、273000、409800、667800)作为标准品，做出标准曲线，测定多糖的纯度及相对分子质量；

得到lgMp-RT(峰位分子量)，lgMw-RT(重均分子量)，lgMn-RT(数均分子量)校正曲线：

lgMp-RT校正曲线方程为：y＝-0.1878x+12.155(R²＝0.9961)；

lgMw-RT校正曲线方程为：y＝-0.2002x+12.75(R²＝0.9948)；

lgMn-RT校正曲线方程为：y＝-0.1855x+11.987(R²＝0.9926)；

根据标准品曲线，得出计算公式进而计算出每个样品的分子量大小，图2 得到山慈菇多糖的高效液相凝胶色谱图(HPGPC)，图中为单一对称峰，表明为均一多糖，通过公式计算出SCGW多糖的峰位分子量为384.6kDa，重均分子量为 555.4kDa和数均分子量314.4kDa。

实施例3

红外分析

通过FT-IR分析多糖的官能团，精密称取样品2mg和溴化钾200mg，压制成片，空白对照采用溴化钾粉末压片而成，分别置于傅里叶变换红外光谱仪 FT-IR650进行扫描记录；

结果如图3所示，多糖组分的红外结果。吸收带在3600-3200cm-1是-OH 的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。具体如下：3369cm-1 是-OH的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰。在2929cm-1处有一个弱的吸收峰，归属于多糖的C-H伸缩振动，在1606cm-1有一个吸收峰，可能为C＝O的不对称伸缩振动，1407cm-1处的吸收峰可归属于C-H的变角振动引起的吸收峰，在 1200-1000cm-1范围内的吸收峰，为C-O-C的伸缩振动，表明该组分为吡喃糖环。

实施例4

单糖组成分析

用还原水解法进行单糖组成分析：取均一多糖样品1-2mg，加入3mL 2M TFA 溶液，至盖帽试管中120℃水解120min，取出，进行旋蒸至无酸味后，加入50mg 的NaBH₄和1mL水，过夜反应，加入少量冰醋酸除去过量NaBH₄，旋蒸至粘稠状加入甲醇：冰醋酸(5：1)3mL，3-5次，再加入甲醇旋干2-3次，放入烘箱105℃，烘干10min，加入2mL乙酸酐，于烘箱反应1.5小时，后加入2mL水终止反应，加入2mL氯仿萃取，水洗2-3次，用无水硫酸钠干燥后，分析采用Shimadzu GCMS-QP 2010气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品；GC-MS条件为RXI-5SIL MS色谱柱30*0.25*0.25，程序升温条件为起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min，保持5min，进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min。其中标准品顺序为鼠李糖、岩藻糖、***糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖；

检测结果：所述的山慈菇均一多糖的GC-MS结果分析显示出2个峰，经过与标准单糖对比，证明为甘露糖和葡萄糖组成。

实施例5

多糖甲基化分析：多糖样品置于反应瓶中，加入DMSO，快速加入NaOH粉末，封闭，在超声作用下溶解，再加入碘甲烷反应。最后加入水到上述混合物中终止甲基化反应，取甲基化后的多糖，1ml的2M三氟乙酸水解90min，旋转蒸发仪蒸干。残基加入2ml双蒸水，60mg硼氢化钠还原8小时，加入冰醋酸中和，旋蒸，101度烘箱烘干，然后加入1ml乙酸酐乙酰化100℃反应1h，冷却，然后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复4-5次，以除去多余的醋酐。将乙酰化后的产物用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，如此重复4次。氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥，定容10mL，分析采用Shimadzu GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品。 GC-MS条件：RXI-5SIL MS色谱柱30*0.25*0.25；程序升温条件为：起始温度120℃，以4℃/min升温至280℃/min，保持5min，进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min；

结果按照出峰顺序进行分析，通过甲基化分析，得到山慈菇多糖有5种糖苷键(见表格)，分别为：2，3，4，6-Me₄-Glcp；2，3，4，6-Me₄-Manp；2，3， 6-Me3-Manp；2，3，6-Me3-Glcp；2，3-Me₂-Manp和2，3-Me₂-Glcp。其对应的链接方式为Glcp-(1→、Manp-(1→、→4)-Manp-(1→、→4)-Glcp-(1→、→4， 6)-Manp-(1→和→4，6)-Glcp-(1→。摩尔比分别为0.59：0.85：58.51：39.48： 0.33：0.24。表明该多糖可能为主链为→4)-Glcp-(1→4)-Manp-(1→的葡聚糖组成，更多信息需要通过解析NMR进一步确定。

实施例6

核磁碳谱分析

称取多糖样品50mg，将其溶于0.5ml的重水中并冷冻干燥。随后将冻干粉再溶于0.5ml的重水中，并继续冷冻干燥，重复以上过程，以充分交换活泼氢。然后将样品溶于0.5ml的重水中，在室温25℃下置于以500MHz(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)的核磁共振仪测定¹³C NMR谱。结果显示： Beta-Manp-1-4的C1、C2、C3、C4、C5和C6信号分别为102.02、72.04、73.51、 78.39、77.13和62.30ppm，而Beta-Glcp-1-4的C1、C2、C3、C4、C5和C6信号分别为104.45、74.82、75.94、80.45、77.13和62.30ppm。综上所述，可以推断出该山慈菇多糖主要为Beta甘露糖1-4和Beta葡萄糖1-4组成的葡甘聚糖，且具少量的分支。

实施例7

山慈菇均一多糖的免疫调节实验

1、通过小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7细胞实验筛选山慈菇多糖的免疫活性。详细步骤如下：将细胞小鼠腹腔巨噬细胞复苏，培养，传代。然后用DMEM培养基进行种植细胞，细胞浓度为5*10⁴细胞数/毫升的细胞液，置于96孔板中培养 8小时，然后采用不同浓度的山慈菇多糖溶液进行处理细胞(0-200μg/mL)，孵育24小时，然后加入20ul的MTT溶液(5mg/ml)到每个小孔中。孵育4小时，弃去上清液，然后加入100ul的二甲基亚砜溶液。避光条件下，在摇床上振摇 15分钟，采用酶标仪在570nm下测定吸光度，计算一氧化氮含量。结果显著提高RAW264.7细胞的一氧化氮释放量；

2、通过小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7细胞实验筛选山慈菇多糖的免疫活性。详细步骤如下：将小鼠腹腔巨噬细胞复苏，培养，传代，然后用DMEM培养基进行种植细胞，细胞浓度为5*10⁴细胞数/毫升的细胞液，取2ml细胞溶液置于6 孔板中培养8小时，然后采用不同浓度的山慈菇多糖溶液进行处理细胞(0–200 μg/mL)，孵育24小时，采用TNFα试剂盒测定RAW264.7细胞。结果显著提高 RAW264.7细胞的肿瘤坏死因子TNFα释放量。

实施例8

山慈菇均一多糖的抗氧化活性实验

1、DPPH自由基清除能力测定：用去离子水配制多糖样品溶液 (0.25-2.0mg/ml)，取30μL样品溶液置于96-孔板内，以溶剂水为空白对照，各加入180μL的DPPH溶液(甲醇配置成0.05mM)，室温、避光、混匀30min，于517nm波长下测定吸光度值，同样配置抗坏血酸溶液作为阳性对照；

清除率计算公式为：

A_s是样品的吸光度值，A₀是空白对照组，A_j是本底对照组；

结果表明山慈菇均一多糖能够清除DPPH自由基，具有抗氧化作用，当多糖浓度达到8mg/ml的时候，清除率达到40％左右；

2、铁离子还原能力测定(FRAP)

用0.1M的PBS(pH6.6)的混合溶液配制多糖样品溶液(0.25-2.0mg/ml)，取200μL样品溶液，加入200μL铁***(水配置成1％w/v)，于50℃水浴反应20min，待冷却后，加入200μL三氟乙酸(水配置成10％w/v)后混合，3000rpm 离心10min后，取100μL上清液置于96-孔板内，然后加入10μL三氯化铁溶液(水配0.1％w/v)反应2min，得到的普鲁士蓝溶液于700nm条件下进行吸光度测定，FRAP activity(％)计算如下：

其中A_sample是样品的吸光度，A_AA(plateau)是抗坏血酸吸光度达到平衡时的最大值。Aj是本底对照；

结果显示为该多糖具有铁离子还原能力，当浓度达到4mg/ml，对铁离子的还原率达到50％左右。

综上所述：本发明提供的山慈菇均一多糖具有很好的促进RAW264.7细胞分泌NO和TNFα水平，同时具有清除DPPH自由基清除能力和还原铁离子的效果。可望成为很好的免疫调节剂，为拓展山慈菇多糖在临床上的应用，新剂型的开发显得尤为重要。本发明制备方案简单，可以得到高纯度的山慈菇均一多糖，且纯度高，适合于规模化生产，实用性好。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。