基于新型腺病毒载体Sad23L和/或Ad49L的新型冠状病毒肺炎疫苗
阅读说明：本技术 基于新型腺病毒载体Sad23L和/或Ad49L的新型冠状病毒肺炎疫苗 (Novel coronavirus pneumonia vaccine based on novel adenovirus vector Sad23L and/or Ad49L ) 是由 罗升学 刘博超 张攀丽 于 2020-07-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于新型腺病毒载体Sad23L和/或Ad49L的新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗。通过优化外源基因使得外源蛋白的表达能够明显提高,同时进一步尝试使用人稀有或者猴的腺病毒作为载体,逃避预存的针对常见腺病毒的免疫反应,本发明获得的新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗能够在动物体内诱导产生高水平的体液和细胞免疫,在动物免疫之后没有发现副作用的出现。本发明新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗是安全有效且可以进行快速大量的制备,因此是可用于预防SARS-CoV-2的感染的候选疫苗株。(The invention discloses a novel coronavirus pneumonia COVID-19 vaccine based on a novel adenovirus vector Sad23L and/or Ad 49L. The expression of foreign proteins can be obviously improved by optimizing foreign genes, meanwhile, the method further tries to use rare adenoviruses or monkey adenoviruses as vectors to escape from the pre-existing immune response aiming at common adenoviruses, the novel coronavirus pneumonia COVID-19 vaccine obtained by the invention can induce and generate high-level humoral and cellular immunity in animals, and no side effect is found after the animals are immunized. The novel coronavirus pneumonia COVID-19 vaccine is safe and effective and can be rapidly prepared in large quantity, so that the vaccine is a candidate vaccine strain for preventing SARS-CoV-2 infection.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于新型腺病毒载体Sad23L和/或Ad49L研制的新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗。
背景技术
2019年冠状病毒病（COVID-19）病原体被鉴定为新型冠状病毒（severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）是一种类似重症急性呼吸道综合征冠状病毒（SARS-CoV，约79%）和中东呼吸道综合征冠状病毒（MERA-CoV，约50%）的ß冠状病毒属（Betacoronavirus）、Sarbecovirus 亚属的新型冠状病毒。SARS-CoV-2的人-人传播能力强于SARS-CoV和MERS-CoV，但其致病力低于SARS-CoV，存在轻症或无明显临床症状感染者。鉴于隐匿性带毒者的存在，可以推测在一级响应措施状态下，即使疫情得到了有效控制，但感染者携带的SARS-CoV-2可能会像MERS-CoV一样呈现持续的散发流行，时间可能长达1-2年或甚至数年。因此，研发有效的COVID-19疫苗仍是控制疫情或彻底清除疫情的最佳手段和迫切需求。
SARS-CoV-2属套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）。基因组为线性单股正链的RNA病毒，直径约80～120nm，基因组5′端具有甲基化的帽状结构，3′端具有poly(A)尾，基因组全长约29 kb。膜表面有三种糖蛋白：棘突糖蛋白（S，Spike Protein）、小包膜糖蛋白（E，Envelope Protein）和膜糖蛋白（M，MembraneProtein），其中 S蛋白在识别并结合宿主细胞表面受体，并介导病毒包膜与细胞膜融合的过程中起到关键性作用，也是诱导宿主产生免疫反应，尤其是体液免疫反应的主要抗原。目前已经有许多形式的COVID-19疫苗进入临床试验和正在研制，包括DNA质粒疫苗、腺病毒疫苗、mRNA疫苗和灭活的病毒疫苗等。但是目前为止还没有获得批准的COVID-19疫苗，因此安全有效的预防性COVID-19疫苗的研制是非常有必要的。
复制缺陷型腺病毒载体广泛的应用于疫苗的研制，由于能够诱导产生广泛的体液和细胞免疫反应，宿主范围广，不整合基因组中，高水平表达外源蛋白等优点。但是人群中预存的高水平的针对常见的人腺病毒（Ad5或者Ad2）的免疫反应限制了腺病毒载体的应用。
发明内容
为了解决现有技术的这种预存的免疫反应，本发明提供了一种基于新型腺病毒载体Sad23L和/或Ad49L的新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗。
基于现有的生物技术领域缺乏获得批准的新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗，以及构建有效的疫苗的技术难题，本发明人希望通过优化外源基因使得外源蛋白的表达能够明显提高，同时进一步尝试使用人稀有或者猴的腺病毒作为载体，逃避预存的针对常见腺病毒的免疫反应，本发明获得的新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗能够在动物体内诱导产生高水平的体液和细胞免疫，在动物免疫之后没有发现副作用的出现。本发明新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗是安全有效且可以进行快速大量的制备，因此是可用于预防SARS-CoV-2的感染的候选疫苗株。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
第一方面，一种表达SARS-CoV-2棘突糖蛋白的核苷酸，所述核苷酸的序列含有如SEQID NO:1所示的S蛋白序列。
第二方面，一种含有上述核苷酸的质粒载体。
在一个优选方案中，所述质粒载体为pShuttle2-CMV-nCoV-S。
第三方面，一种重组腺病毒载体，其含有上述的核苷酸或含有上述的质粒载体。
在一个优选方案中，构建所述重组腺病毒载体时所用的腺病毒载体为 Sad23L。
在一个优选方案中，构建所述重组腺病毒载体时所用的腺病毒载体为Ad49L。
一种表达上述的核苷酸的重组腺病毒。
在一个优选方案中，，所述重组腺病毒来源于用上述的重组腺病毒载体包装出的病毒。
第四方面，一种制备上述的重组腺病毒的方法，其包括以下步骤：
（1）构建含有上述的核苷酸的质粒载体；
（2）将步骤（1）的质粒载体克隆进入腺病毒载体，获得重组腺病毒载体；
（3）将步骤（2）所述的重组腺病毒载体线性化、转染入宿主细胞，包装出重组腺病毒；
（4）大量培养宿主细胞，并用步骤（3）中的重组腺病毒感染，大量扩增获得复制缺陷型重组腺病毒并纯化。
第五方面，上述的重组腺病毒在制备预防性的新型冠状病毒疫苗中的应用。
第六发明，一种新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗，所述疫苗任选以下一种：
（A）疫苗Sad23L-nCoV-S，其含有用上述基于腺病毒载体Sad23L的重组腺病毒载体包装出的重组腺病毒；
（B）疫苗Ad49L-nCoV-S，其含有用上述基于腺病毒载体为Ad49L的重组腺病毒载体包装出的重组腺病毒；
（C）初免疫苗Sad23L-nCoV-S&加强疫苗Ad49L-nCoV-S，所述初免疫苗用病毒为用上述基于腺病毒载体Sad23L的重组腺病毒载体包装出的重组腺病毒，所述加强疫苗用病毒为用上述基于腺病毒载体为Ad49L的重组腺病毒载体包装出的重组腺病毒，所述初免疫苗和加强疫苗间隔使用。
有益效果
本发明提供了提高外源基因蛋白表达水平的优化S蛋白的核苷酸序列。S基因序列克隆入穿梭质粒载体pShuttle2-CMV-Flag后，进一步将穿梭质粒载体上的启动子和外源基因克隆入复制缺陷的腺病毒载体，将重组的腺病毒载体酶切线性化之后，转染进入宿主细胞，包装出早期转录单位E1/E3缺陷的重组腺病毒Sad23L-nCoV-S或Ad49L-nCoV-S。此重组腺病毒载体源于新型冠状病毒毒株（GenBank no. MN908947.3）的S蛋白的基因。携带外源基因的重组腺病毒能够感染细胞之后高水平表达SARS-CoV-2的棘突糖蛋白，同时此重组腺病毒作为新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗免疫动物之后快速诱导产生针对SARS-CoV-2抗原特异性的体液和细胞反应。因此本发明提供的新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗可以作为预防SARS-CoV-2感染的候选疫苗。
附图说明
图1A. 构建重组复制缺陷型腺病毒载体Sad23L-nCoV-S和Ad49L-nCoV-S的示意图；
图1B.复制缺陷型腺病毒载体Sad23L-nCoV-S和Ad49L-nCoV-S的酶切鉴定图；
图1C.包装重组腺病毒Sad23L-nCoV-S和Ad49L-nCoV-S的图；
图2A.重组腺病毒Sad23L-nCoV-S和Ad49L-nCoV-S表达S蛋白的Western blot鉴定图；
图2B.重组腺病毒Sad23L-nCoV-S和Ad49L-nCoV-S表达S蛋白的免疫荧光鉴定图；
图3.氯化铯梯度离心纯化的重组腺病毒Sad23L-nCoV-S和Ad49L-nCoV-S；
图4A.新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗Sad23L-nCoV-S免疫小鼠四周之后血清中特异性针对S和RBD蛋白的结合抗体水平；
图4B.ELISPOT测定疫苗Sad23L-nCoV-S免疫小鼠四周之后，S多肽、RBD多肽、S蛋白和RBD蛋白特异性诱导脾脏淋巴细胞IFNγ分泌水平;
图5A.新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗Ad49L-nCoV-S免疫小鼠四周之后血清中特异性针对S和RBD蛋白的结合抗体水平；
图5B.ELISPOT测定疫苗Ad49L-nCoV-S免疫小鼠四周之后，S多肽、RBD多肽、S蛋白和RBD蛋白特异性诱导脾脏淋巴细胞IFNγ分泌水平；
图6A.疫苗Sad23L-nCoV-S初次免疫小鼠四周之后，用疫苗Ad49L-nCoV-S加强免疫，再四周之后检测血清中特异性针对S和RBD蛋白的结合抗体水平；
图6B.ELISPOT测定疫苗Sad23L-nCoV-S初次免疫小鼠四周之后，用疫苗Ad49L-nCoV-S加强免疫，再四周之后，S多肽、RBD多肽、S蛋白和RBD蛋白特异性诱导脾脏淋巴细胞IFNγ分泌水平。
具体实施方式
下面用实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。
． 材料
1.1 细胞和复制缺陷型腺病毒载体
培养基为10%胎牛血清（FBS）的DMEM。复制缺陷型腺病毒载体Sad23L根据中国发明专利申请2018111393002构建；复制缺陷型腺病毒载体Ad49L根据中国发明专利申请2019107303737构建。
1.2 限制性内切酶、菌株和质粒
限制性内切酶购自New England Biolabs, Inc.（美国NEB公司）；DH5α感受态购自于天根生化科技（北京）有限公司；E.coli HST08感受态购自于Takara（日本TaKaRa公司）。
pMV-nCoV-S质粒由华大基因全基因合成。pShuttle2-CMV-Flag载体购于Addgene公司。
SARS-CoV-2的棘突糖蛋白（Spike，S）和棘突糖蛋白受体结合区（receptor-binding domain, RBD）蛋白购于北京义翘神州科技有限公司。SARS-CoV-2的S多肽和RBD多肽在广州艾基生物技术有限公司合成。ELISPOT板购于MabTech公司。
1.3 实验动物
SPF级雌性的5周龄的C57BL/6小鼠购于南方医科大学动物中心，饲养于南方医院动物中心。所有动物饲养和实验都符合国家和机构有关动物福利的规定。
实施例1基于复制缺陷型腺病毒载体Sad23L和Ad49L的新型冠状病毒疫苗的制备
1. 外源基因S的密码子优化和获得。
SARS-CoV-2的棘突糖蛋白（S）的基因序列源于新型冠状病毒毒株（GenBank no.MN908947.3），使用软件Upgene进行密码子的优化，使得外源基因更适合在哺乳动物细胞进行表达，优化之后的S的基因序列见SEQ ID NO:1，将其在华大基因合成获得优化的外源基因序列的质粒pMV-nCoV-S。
2.重组腺病毒载体构建和病毒的包装。
2.1穿梭质粒pShuttle2-CMV-S的构建
将全基因合成的含有基因序列S的质粒pMV-nCoV-S使用EcoRI和 BamHI进行双酶切，回收酶切产物，将产物连接至质粒质粒pShuttle2-CMV-Flag进行连接，转化，涂板之后，获得重组的穿梭质粒pShuttle2-CMV-S。
2.2重组腺病毒载体Sad23L-nCoV-S和Ad49L-nCoV-S的分别构建。
重组的穿梭质粒pShuttle2-CMV-S用I-CeuI和PI-SceI进行双酶切，回收酶切产物，将产物和I-CeuI、PI-SceI双酶切的腺病毒载体Sad23L或Ad49L进行连接，转化，涂板之后，获得重组腺病毒质粒载体Sad23L-nCoV-S或Ad49L-nCoV-S（图1A）。
构建成功的重组腺病毒载体Sad23L-nCoV-S或Ad49L-nCoV-S用HindIII酶切鉴定，如果图1B所示经过琼脂糖核酸电泳鉴定有大小合适的条带，而且送测序均是目的基因S正确克隆至两个腺病毒载体。
2.3 重组腺病毒Sad23L-nCoV-S和Ad49L-nCoV-S的分别包装。
重组腺病毒载体Sad23L-nCoV-S或Ad49L-nCoV-S经过酶切鉴定和测序鉴定正确构建之后，使用限制性内切酶PacI酶切线性化，将线性化的腺病毒载体分别转染至HEK293细胞，大约转染8-10天之后可以看到明显的病毒空斑的形成（图1C）。收取病变的细胞，冻存在-80℃冰箱备用。
3.重组腺病毒Sad23L-nCoV-S和Ad49L-nCoV-S的外源基因表达鉴定和扩增纯化。
3.1重组腺病毒Sad23L-nCoV-S和Ad49L-nCoV-S分别感染HEK293细胞后，通过Western blot鉴定S蛋白的表达。
Western blot样品的制备：包装成功重组腺病毒Sad23L-nCoV-S和Ad49L-nCoV-S的细胞，经过在37℃和-80℃反复冻融之后，4000rpm，5分钟离心，吸取病毒上清液分别感染融合度90%的HEK293细胞。在病毒感染约48小时之后，收取病毒感染的细胞，然后用150μl的RIPA和10μl的蛋白酶抑制剂混合物裂解细胞，置于冰上20分钟，然后将混合液于12000g，4℃离心3分钟，取上清，加入上样缓冲液混合，于沸水浴10分钟。离心12000g，离心1分钟，吸取上清分装冻存在-80℃备用。
Western blot鉴定S蛋白：使用10%的SDS-PAGE凝胶对WB样品进行电泳分离，电泳结束之后，将凝胶上的蛋白转印至PVDF膜。用5%的脱脂奶粉对PVDF膜进行封闭，室温封闭2小时。孵育针对S蛋白的特异性的兔多抗（北京义翘神州科技有限公司）或者灭活的阳性病人的血清，室温孵育2h。用1xPBST洗膜5次，每次5分钟。孵育HRP标记的羊抗兔的二抗或羊抗人的二抗，室温孵育1h之后，洗膜5次，每次5分钟。GADPH的标签作为内参，然后进行化学发光显色。
结果如图2A所示，腺病毒Sad23L-nCoV-S和Ad49L-nCoV-S分别感染HEK293细胞之后能够检测到特异的S蛋白的表达，但是作为对照的Sad23L-GFP和Ad49L-GFP分别感染的HEK293细胞没有条带。
3.2 重组腺病毒Sad23L-nCoV-S和Ad49L-nCoV-S分别感染宿主细胞HEK293后，通过免疫荧光鉴定S蛋白的表达。
包装的重组腺病毒Sad23L-nCoV-S和Ad49L-nCoV-S分别感染融合度90%的HEK293细胞，48小时后，使用10%甲醛室温固定细胞20分钟，加入1xPBST洗板3次。然后加入2%BSA封闭1小时，洗板3次。孵育针对S蛋白的特异性的人源单抗，室温孵育1小时。洗板3次之后，加入Alexa Fluor 594标记的羊抗人的二抗，室温孵育1小时之后，加入DAPI染色核酸，室温10分钟之后，洗板5次，加入90%的丙三醇封板，使用荧光显微镜拍照。如图2B所示，红色荧光就是特异性表达的S蛋白，可以在重组腺病毒Sad23L-nCoV-S和Ad49L-nCoV-S分别感染的细胞中观察到，但是作为对照的Sad23L-GFP和Ad49L-GFP分别感染的HEK293细胞没有红色荧光。
3.3 分别大量扩增重组腺病毒Sad23L-nCoV-S和Ad49L-nCoV-S并纯化。
病毒扩增：已经鉴定可以在真核细胞表达外源基因的重组腺病毒Sad23L-nCoV-S，感染52个融合度90%的75T培养瓶的HEK293，感染48小时之后，收取细胞，5000g离心10分钟，弃去上清，用10ml的PBS重悬细胞，反复冻融三次之后，12000g离心30分钟，吸取病毒上清备用。
已经鉴定目的蛋白表达的重组腺病毒Ad49L-nCoV-S，感染100个融合度90%的75T培养瓶的HEK293，感染48小时之后，收取细胞，用10ml的PBS重悬细胞，反复冻融三次之后，吸取病毒上清备用。
病毒纯化：在超离管中按照顺序加入2.5ml 1.4g的氯化铯、2.5ml 1.2g的氯化铯、冻融的病毒液，在4度14000rpm离心3.5小时，吸取下层的感染性的病毒液（图3）。在透析液和浓缩液中，透析过夜。第二天收取病毒，分装冻存在-80℃冰箱。
病毒滴度的测定：使用50%组织培养感染剂量法测定病毒的感染滴度，以及OD450方法测定病毒的总颗粒数（VP）。
实施例2 新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗Sad23L-nCoV-S在小鼠模型上的免疫评价
1.重组腺病毒疫苗Sad23L-nCoV-S诱导特异性体液免疫的评价
1.1 疫苗免疫的接种滴度及部位
SPF级雌性的5周龄的C57BL/6小鼠购于南方医科大学动物中心，饲养于南方医院动物中心。所有动物饲养和实验都符合国家和机构有关动物福利的规定。注射体积是每只100μl，免疫四周后取眼球血，分离血清测定结合抗体和中和抗体水平。小鼠的分组，免疫如表1所示：
表1：Sad23L-nCoV-S免疫小鼠分组，免疫剂量和接种部位
1.2 疫苗免疫小鼠诱导的特异性针对S蛋白和RBD蛋白的结合抗体水平
适龄的C57BL/6小鼠免疫四周之后，眼球取血，分离血清，用ELISA的方法测定血清中S蛋白和RBD蛋白的特异性的结合抗体。具体方法如下：
1） S或者RBD蛋白包被：ELISA的板条，使用碳酸盐缓冲液稀释S或者RBD蛋白（北京义翘神州科技有限公司）至浓度为2μg/ml在4℃包被过夜；
2）封闭：弃去包被过夜的ELISA板条中液体，加入PBS配置的5%BSA的封闭液，200μl加入至ELISA板条中，在37℃封闭2小时；
3）孵育一抗（血清）：弃去封闭液，加入PBST(0.05%吐温)-BSA 3倍梯度稀释的免疫小鼠的血清，在37℃孵育1小时；
4）孵育二抗：用1xPBST洗ELISA板5次，加入PBST(0.05%吐温)-BSA以1:8000的比例稀释的酶标二抗（HRP-标记的羊抗鼠的二抗，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），在37℃孵育30分钟；
5）显色：用1xPBST洗ELISA板5次，100μl每孔加入显色液（TMB）进行显色，在37℃孵育15分钟；
6）终止：显色结束之后加入50μl 2M浓度的盐酸，终止显色；
7）读板：将终止显色的ELISA板放置酶标仪（BIO-R）读取OD值（A450）。血清的抗体滴度定义为大于2倍空白孔的稀释度的倒数，用Log10来表示。
小鼠免疫后四周血清中针对S和RBD蛋白的结合抗体水平如图4A所示，不同剂量（107、108和109 PFU）的疫苗Sad23L-nCoV-S免疫小鼠诱导产生了针对S蛋白特异性的结合抗体水平分别为7046.9、9594和18663.8，针对RBD抗原特异性的结合抗体水平分别为2992.3、3548.1和9462.4。此疫苗诱导产生了高水平结合抗体，而且呈现剂量依赖的模式，随着免疫的滴度的增高，结合抗体的水平也逐渐增高（P<0.001），而且跟免疫对照组相比，不同剂量的Sad23L-nCoV-S组均诱导产生高水平的抗体滴度（P<0.001）。
2.新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗Sad23L-nCoV-S诱导的细胞免疫反应
2.1 小鼠脾淋巴细胞的分离
小鼠免疫四周之后，分离脾脏，研磨之后，过200目筛网，再使用小鼠脾脏淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。吸取白膜层，使用PBS洗一次之后，使用1640培养基重悬细胞，计数，备用。
2.2 疫苗免疫小鼠诱导产生针对S抗原的特异性细胞免疫
分离的小鼠脾淋巴细胞使用免疫酶联斑点实验（ELISPOT）测定S抗原刺激的IFN-γ的分泌能力，具体操作如下：
1） 使用MabTech的预包被的ELISPOT的板，按照说明书操作，PBS洗板5次之后，加入1640全培孵育30分钟；
2）弃去1640全培，加入脾淋巴细胞，每孔50万细胞，加入终浓度为5μg/ml的S蛋白、RBD蛋白、P1（除去RBD的S蛋白多肽）或者P2（RBD多肽）分别刺激，阴性孔使用1640全培，阳性孔使用ConA刺激，均设置3个复孔，培养孵育36小时；
3）弃去上清，用1xPBS洗ELISPOT板5次，加入1μg/ml的anit-mouse-IFN-γ抗体，室温孵育2小时；
4）弃去上清，用1xPBS洗ELISPOT板5次，加入1μg/ml的碱性磷酸酯合成酶标记的链霉亲和素，室温孵育1小时；
5）弃去上清之后，用1xPBS洗ELISPOT板5次，每孔加入100μl显色液（BCIP/NBT-plus），室温显色约30min，使用纯水终止显色。使用酶联斑点成像系统（Cellμlar TechnologyLtd）进行斑点计数。
小鼠免疫四周后，不同剂量（107、108和109 PFU）的疫苗Sad23L-nCoV-S均诱导的针对S抗原的特异性细胞反应。如图4B所示， S多肽（除去RBD的S蛋白多肽）刺激脾淋巴细胞诱导产生最高水平的IFN-γ分泌，斑点数分别为450.2、559.3和898.4 SFCs/million cells，而且呈现滴度的依赖性（P<0.001）；其次是RBD多肽也诱导产生高水平的IFN-γ分泌，斑点数分别为64.4、119和224 SFCs/million cells，而且呈现滴度的依赖性（P<0.001）；S蛋白也诱导特异性的IFN-γ分泌，斑点数分别为92.3、81.5和246.8 SFCs/million cells，而且呈现滴度的依赖性（P<0.001）；但是RBD蛋白刺激脾脏淋巴细胞特异性的IFN-γ分泌水平很低，斑点数并没有高于对照组。
实施例3 新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗Ad49L-nCoV-S在小鼠模型上的免疫评价
1. 重组腺病毒疫苗Ad49L-nCoV-S诱导特异性体液免疫的评价
1.1 疫苗免疫的接种滴度及部位
SPF级雌性的5周龄的C57BL/6小鼠购于南方医科大学动物中心，饲养于南方医院动物中心。所有动物饲养和实验都符合国家和机构有关动物福利的规定。注射体积是每只100μl，免疫四周后取眼球血，分离血清测定结合抗体和中和抗体水平。小鼠的分组，免疫如表2所示：
表2：Ad49L-nCoV-S免疫小鼠分组，免疫剂量和接种部位
1.2 疫苗免疫小鼠诱导的特异性针对S蛋白和RBD蛋白的结合抗体水平
适龄的C57BL/6小鼠免疫四周之后，眼球取血，分离血清，用ELISA的方法测定血清中S蛋白和RBD蛋白的特异性的结合抗体。具体方法如下：
1） S或者RBD蛋白包被：ELISA的板条，使用碳酸盐缓冲液稀释S或者RBD蛋白（义翘神州）至浓度为2μg/ml在4℃包被过夜；
2）封闭：弃去包被过夜的ELISA板条中液体，加入PBS配置的5%BSA的封闭液，200μl加入至ELISA板条中，在37℃封闭2小时；
3）孵育一抗（血清）：弃去封闭液，加入PBST(0.05%吐温)-BSA 3倍梯度稀释的免疫小鼠的血清，在37℃孵育1小时；
4）孵育二抗：用1xPBST洗ELISA板5次，加入PBST(0.05%吐温)-BSA以1:8000的比例稀释的酶标二抗（HRP-标记的羊抗鼠的二抗，北京鼎国生物），在37℃孵育30分钟；
5）显色：用1xPBST洗ELISA板5次，100μl每孔加入显色液（TMB）进行显色，在37℃孵育15分钟；
6）终止：显色结束之后加入50μl 2M浓度的盐酸，终止显色；
7）读板：将终止显色的ELISA板放置酶标仪（BIO-R）读取OD值（A450）。血清的抗体滴度定义为大于2倍空白孔的稀释度的倒数，用Log10来表示。
小鼠免疫后四周血清中针对S和RBD蛋白的结合抗体水平如图5A所示，不同剂量（107、108和109 PFU）的疫苗Ad49L-nCoV-S免疫小鼠诱导针对S蛋白特异性的结合抗体水平分别为399.94、459.20和1054.39，针对RBD抗原特异性的结合抗体水平分别为229.61、174.18和264.24。此疫苗诱导特异性的结合抗体，而且跟免疫对照组相比，不同剂量的Ad49L-nCoV-S组均诱导产生高水平的抗体滴度（P<0.001）。
2. 新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗Ad49L-nCoV-S诱导的细胞免疫反应
2.1小鼠脾淋巴细胞的分离
小鼠免疫四周之后，分离脾脏，研磨之后，过200目筛网，再使用小鼠脾脏淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。吸取白膜层，使用PBS洗一次之后，使用1640全培重悬细胞，计数，备用。
2.2 疫苗免疫小鼠诱导产生针对S抗原的特异性细胞免疫
分离的小鼠脾淋巴细胞使用免疫酶联斑点实验（ELISPOT）测定S抗原刺激的IFN-γ的分泌能力，具体操作如下：
1）使用MabTech的预包被的ELISPOT的板，按照说明书操作，PBS洗板5次之后，加入1640全培孵育30分钟；
2）弃去1640全培，加入脾淋巴细胞，每孔50万细胞，加入终浓度为5μg/ml的S蛋白、RBD蛋白、P1（除去RBD的S蛋白多肽）或者P2（RBD多肽）分别刺激，阴性孔使用1640全培，阳性孔使用ConA刺激，均设置3个复孔，培养孵育36小时；
3）弃去上清，用1xPBS洗ELISPOT板5次，加入1μg/ml的anit-mouse-IFN-γ抗体，室温孵育2小时；
4）弃去上清，用1xPBS洗ELISPOT板5次，加入1μg/ml的碱性磷酸酯合成酶标记的链霉亲和素，室温孵育1小时；
5）弃去上清之后，用1xPBS洗ELISPOT板5次，每孔加入100μl显色液（BCIP/NBT-plus），室温显色约30min，使用纯水终止显色。使用酶联斑点成像系统（Cellμlar TechnologyLtd）进行斑点计数。
小鼠免疫四周后，不同剂量（107、108和109 PFU）的疫苗Ad49L-nCoV-S均诱导的针对S抗原的特异性细胞反应。如图5B所示， S多肽（除去RBD的S蛋白多肽）刺激脾淋巴细胞诱导产生最高水平的IFN-γ分泌，斑点数分别为300、396.4和615.4 SFCs/million cells，而且呈现滴度的依赖性（P<0.001）；其次S蛋白也诱导特异性的IFN-γ分泌，斑点数分别为106.2、82.8和232 SFCs/million cells，而且呈现滴度的依赖性（P<0.001）；但是RBD多肽和RBD蛋白刺激脾脏淋巴细胞特异性的IFN-γ分泌水平很低，斑点数并没有高于对照组。
实施例4 新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗Sad23L-nCoV-S初次免疫（prime）小鼠，四周之后疫苗Ad49L-nCoV-S加强免疫（boost），四周后评价此疫苗免疫策略的免疫效果
1. 新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗Sad23L-nCoV-S（prime）&Ad49L-nCoV-S（boost）诱导的特异性体液免疫的评价
1.1 疫苗免疫的接种剂量及部位
SPF级雌性的5周龄的C57BL/6小鼠购于南方医科大学动物中心，饲养于南方医院动物中心。所有动物饲养和实验都符合国家和机构有关动物福利的规定。注射体积是每只100μl，免疫四周后取眼球血，分离血清测定结合抗体和中和抗体水平。小鼠的分组，免疫如表3所示：
表3：新型冠状病毒肺炎疫苗Sad23L-nCoV-S（prime）&Ad49L-nCoV-S（boost）免疫小鼠分组、免疫剂量和接种部位
1.2 疫苗免疫小鼠诱导的特异性针对S蛋白和RBD蛋白的结合抗体水平
适龄的C57BL/6小鼠免疫四周之后，眼球取血，分离血清，用ELISA的方法测定血清中S蛋白和RBD蛋白的特异性的结合抗体。具体方法如下：
1)S或者RBD蛋白包被：ELISA的板条，使用碳酸盐缓冲液稀释） S或者RBD蛋白（义翘神州）至浓度为2μg/ml在4℃包被过夜；
2)封闭：弃去包被过夜的ELISA板条中液体，加入PBS配置的5%BSA的封闭液，200μl加入至ELISA板条中，在37℃封闭2小时；
3)孵育一抗（血清）：弃去封闭液，加入PBST(0.05%吐温)-BSA 3倍梯度稀释的免疫小鼠的血清，在37℃孵育1小时；
4)孵育二抗：用1xPBST洗ELISA板5次，加入PBST(0.05%吐温)-BSA以1:8000的比例稀释的酶标二抗（HRP-标记的羊抗鼠的二抗，北京鼎国生物），在37℃孵育30分钟；
5)显色：用1xPBST洗ELISA板5次，100μl每孔加入显色液（TMB）进行显色，在37℃孵育15分钟；
6) 终止：显色结束之后加入50μl 2M浓度的盐酸，终止显色；
7)读板：将终止显色的ELISA板放置酶标仪（BIO-R）读取OD值（A450）。血清的抗体滴度定义为大于2倍空白孔的稀释度的倒数，用Log10来表示。
新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗Sad23L-nCoV-S（prime）&Ad49L-nCoV-S（boost）免疫小鼠，诱导产生针对S和RBD蛋白的特异性的结合抗体，如图6A所示，此新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗免疫小鼠诱导产生了针对S的结合抗体水平为64268.77，针对RBD蛋白特异性的结合抗体水平为18578.04，跟对照组相比，免疫组诱导产生高水平的抗体滴度（P<0.001）。
2. 新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗Sad23L-nCoV-S（prime）&Ad49L-nCoV-S（boost）免疫小鼠诱导的细胞免疫反应
2.1小鼠脾淋巴细胞的分离
小鼠免疫四周之后，分离脾脏，研磨之后，过200目筛网，再使用小鼠脾脏淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。吸取白膜层，使用PBS洗一次之后，使用1640全培重悬细胞，计数，备用。
2.2 疫苗免疫小鼠诱导产生针对S抗原的特异性细胞免疫
分离的小鼠脾淋巴细胞使用免疫酶联斑点实验（ELISPOT）测定S抗原刺激的IFN-γ的分泌能力，具体操作如下：
1)使用MabTech的预包被的ELISPOT的板，按照说明书操作，PBS洗板5次之后，加入1640全培孵育30分钟；
2)弃去1640全培，加入脾淋巴细胞，每孔50万细胞，加入终浓度为5μg/ml的S蛋白、RBD蛋白、P1（除去RBD的S蛋白多肽）或者P2（RBD多肽）分别刺激，阴性孔使用1640全培，阳性孔使用ConA刺激，均设置3个复孔，培养孵育36小时；
3)弃去上清，用1xPBS洗ELISPOT板5次，加入1μg/ml的anit-mouse-IFN-γ抗体，室温孵育2小时；
4)弃去上清，用1xPBS洗ELISPOT板5次，加入1μg/ml的碱性磷酸酯合成酶标记的链霉亲和素，室温孵育1小时；
5)弃去上清之后，用1xPBS洗ELISPOT板5次，每孔加入100μl显色液（BCIP/NBT-plus），室温显色约30min，使用纯水终止显色。使用酶联斑点成像系统（Cellular TechnologyLtd）进行斑点计数。
新型冠状病毒肺炎COVID-19疫苗Sad23L-nCoV-S（prime）&Ad49L-nCoV-S（boost）免疫小鼠诱导产生高水平的针对S抗原的特异性细胞反应。如图6B所示， S多肽（除去RBD的S蛋白多肽）刺激脾淋巴细胞诱导产生最高水平的IFN-γ分泌，斑点数达到840.8 SFCs/million cells；RBD多肽刺激脾淋巴细胞诱导产生的IFN-γ的斑点数达到146.6 SFCs/million cells；S蛋白也诱导特异性的IFN-γ分泌，斑点数为284.3 SFCs/million cells；但是RBD蛋白刺激脾脏淋巴细胞特异性的IFN-γ分泌水平很低，斑点数并没有高于对照组（P>0.05）。
本发明开发了三种新型冠状病毒肺炎的疫苗：Sad23L-nCoV-S、Ad49L-nCoV-S和初免疫苗Sad23L-nCoV-S&加强疫苗Ad49L-nCoV-S，基于构建的重组腺病毒载体Sad23L和Ad49L，将密码子优化的新型冠状病毒的S蛋白基因分别克隆至载体Sad23L和Ad49L。经过体外，真核鉴定外源蛋白的表达，重组腺病毒Sad23L-nCoV-S和Ad49L-nCoV-S的纯化，最后在小鼠模型上进行免疫评价，发现COVID-19疫苗Sad23L-nCoV-S能够诱导产生特异性针对S抗原的结合抗体，而且产生了特异性的针对新型冠状病毒抗原S的细胞反应。COVID-19疫苗Ad49L-nCoV-S能够诱导产生特异性针对S抗原的结合抗体，而且产生了特异性的针对新型冠状病毒抗原S的细胞反应。COVID-19疫苗Sad23L-nCoV-S（prime）&Ad49L-nCoV-S（boost），能够诱导小鼠产生更高水平特异性针对S抗原的结合抗体，而且产生了更高水平的特异性的针对新型冠状病毒抗原S的细胞反应。
因此，三种新型冠状病毒肺炎疫苗：Sad23L-nCoV-S、Ad49L-nCoV-S和Sad23L-nCoV-S（prime）&Ad49L-nCoV-S（boost）具有很高的实际应用价值，可以应用于紧急预防新型冠状病毒感染的候选疫苗，尤其是Sad23L-nCoV-S（初次免疫）&Ad49L-nCoV-S（加强免疫）的新型冠状病毒肺炎疫苗能够诱导产生更高水平的特异性体液和细胞免疫反应，也许能够完全预防新型冠状病毒的感染。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广州佰芮慷生物科技有限公司
<120> 基于新型腺病毒载体Sad23L和/或Ad49L的新型冠状病毒肺炎疫苗
<141> 2020-07-14
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3828
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccaccatgt tcgtgttcct ggtgctgctg cctctggtga gcagccaatg tgtgaacctg 60
accaccagga cacaactgcc tcctgcctat accaacagct tcaccagggg cgtgtattac 120
cctgacaagg tgttcaggag cagcgtgctg cacagcaccc aagacctttt tctgcctttc 180
ttcagcaacg tgacctggtt ccacgccatc cacgtgagcg gaacaaatgg cacaaagagg 240
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gacattctga gcaggctgga caaggtggag gccgaggtgc aaattgacag gctgattacc 3000
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agggtggatt tctgcggaaa gggctaccac ctgatgagct tccctcagag cgcccctcat 3180
ggagtggtgt ttctgcacgt gacatacgtg cctgcccagg aaaaaaactt caccaccgcc 3240
cctgccatct gccacgatgg aaaagctcat ttccctaggg agggcgtgtt cgtgagcaac 3300
ggcacacatt ggtttgtgac ccagaggaac ttctacgagc ctcagatcat caccaccgac 3360
aacaccttcg tgagcggcaa ctgcgacgtg gtgattggca ttgtgaacaa caccgtgtac 3420
gaccctctgc agcctgagct ggatagcttt aaggaggagc tggacaagta cttcaagaac 3480
cacaccagcc ctgacgtgga cctgggcgat attagcggaa ttaatgccag cgtggtgaac 3540
atccagaagg agatcgacag gctgaacgag gtggccaaga acctgaacga gagcctgatc 3600
gacctgcagg agctgggcaa atacgagcag tatatcaagt ggccttggta catctggctg 3660
ggcttcatcg ccggcctgat cgctattgtg atggtgacca ttatgctgtg ctgcatgacc 3720
agctgctgca gctgcctgaa aggctgttgt agctgtggaa gctgctgcaa gttcgatgag 3780
gacgacagcg agcctgtgct gaagggcgtt aagctgcatt atacctga 3828