具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1 SARS-CoV-2 S RBD编码基因优化与表达

SARS-CoV-2的糖刺突蛋白S RBD(Spike protein RBD，S RBD)的氨基酸序列位置为aa319-aa541，详见UniProt-P0DTC2(SPIKE_SARS2)所示，表达SARS-CoV-2刺突蛋白S RBD的天然核苷酸序列如下(SEQ ID NO:1)。

AGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAA CTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTA TGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCC TATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTA CTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAA TTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGAT TGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGC TTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCT GTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTT CAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGT TTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGT GTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACAT GCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTC

真核细胞转录的mRNA前体能够通过不同剪接方式产生不同的mRNA剪接异构体的过程，最终导致同一个基因序列产生的不同的蛋白质。这对蛋白的表达是非常不利的。通过对SARS-Cov-2 S RBD野生型的天然核酸序列进行密码子优化，保证了蛋白表达的唯一性，减少了蛋白后续纯化的难度。优化得到的命名为BRP2，核酸具体序列如下(SEQ ID NO:2)：

AGAGTGCAGCCCACCGAGTCCATCGTGAGGTTTCCCAACATCACCAA CCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTTAACGCCACCAGATTCGCCTCCGTGT ACGCCTGGAACAGGAAGAGGATCTCCAACTGTGTGGCCGATTACTCCGTG CTGTACAATAGCGCCTCCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCT ACCAAGCTGAACGACCTGTGTTTCACCAATGTGTACGCCGATTCCTTCGT GATCAGAGGCGATGAGGTGAGACAGATCGCCCCCGGCCAGACAGGCAAG ATCGCCGACTACAATTACAAGCTGCCCGATGACTTCACAGGCTGTGTGAT CGCCTGGAATTCCAATAACCTGGATAGCAAGGTGGGCGGCAATTACAATT ACCTGTACAGACTGTTCAGAAAGTCCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGAGAC ATCTCCACAGAGATCTACCAGGCCGGCTCCACCCCCTGCAATGGCGTGGA GGGCTTCAATTGTTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCTACAAA CGGCGTGGGCTACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGTCCTTCGAGCTGC TGCACGCCCCTGCCACAGTGTGTGGCCCTAAGAAGTCCACAAACCTGGTGAAGAATAAGTGCGTGAATTTC

其编码的氨基酸序列列如下(SEQ ID NO:3)：

RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVL YNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADY NYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIY QAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF

对天然核苷酸序列和经过密码子优化后的核苷酸序列分别进行蛋白表达，使用ELISA方法分别包被2种重组蛋白，使用市售的可识别RBD区域表位 SARS-2 S1单克隆抗体(40150-R007，北京义翘神州)作为一抗进行检测，使用1:20000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG(Fc特异性识别)作为酶标二抗进行检测，使用TMB进行显色，50μL/well，避光显色15min；使用1M H2SO4进行终止， 50μL/well。于酶标仪处读取OD450的吸光值。

检测结果见图1，结果表明SARS-2 S1单克隆抗体识别优化后的核苷酸序列表达SRBD蛋白EC50为4.96ng/mL，优化前的核苷酸序列表达S RBD蛋白EC50 为29ng/mL，证明优化后的S RBD蛋白核苷酸序列表达的蛋白特异性优于优化前的S RBD蛋白核苷酸序列表达的蛋白。

实施例2 SARS-Cov-2 S RBD重组蛋白的表达与纯化

SEQ ID NO:2表达蛋白的C末端连接人IgG1(P01857)Fc片段，用于纯化及后续检测。

合成BRP2基因片段，将BRP2基因片段连接到上pBV载体(百凌生物)上，并转化进大肠杆菌中37℃进行扩增16h。

次日裂解提取BRP2质粒。按照常规方法，利用阳离子脂质体，分别将50μg 的pBV-BRP2转染50mL 293-6E细胞，转染6天后，收集细胞和上清，收集的细胞裂解后制备得到细胞裂解液。收集转染后的上清，使用镍柱进行重组蛋白纯化后置换缓冲液为PBS。纯化后的样品存于4℃。

实施例3 SARS-CoV-2 S RBD重组蛋白的鉴定

分别使用ELISA、SDS-PAGE、Western blot对SARS-CoV-2 S RBD重组蛋白进行鉴定，具体鉴定方法如下：

1.ELISA方法鉴定

1)包被胞外区ACE2重组蛋白(带有His标签)受体(货号：ACE-HM401，上海恺佧生物)，碳酸盐缓冲液稀释ACE2重组蛋白浓度为2μg/mL， 50μL/孔包被酶标板，4℃包被过夜。

2)次日，使用0.01M，pH7.4 PBST将包被好的酶标板置于洗板机上洗板3 次，250μL/孔。

3)每孔加入100μL 3％BSA/PBST溶液，30℃封闭孵育1h-2h。

4)洗板后，每孔加入从4μg/mL起始，4倍倍比稀释的SARS-CoV-2 S RBD 重组蛋白配体，50μL/孔。30℃孵育约1h。

5)洗板后，加入1:4000辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(Fc特异性识别) 二抗(ab98624，abcam)，50μL/孔。30℃孵育约1h。

6)显色：每孔加入50μL TMB显色液，30℃避光显色15min。

7)终止：每孔加入50μL 1M硫酸终止反应。

8)于酶标仪处读取450nm波长下的吸光值。

ACE2重组蛋白受体与SARS-CoV-2 S RBD重组蛋白配体ELISA结合的曲线见图2。

从图2中可知，制备得到的SARS-CoV-2 S RBD重组蛋白与ACE2重组蛋白有较好的结合活性，其EC50为7.79ng/mL，表明本发明制备的SARS-CoV-2 S RBD重组蛋白有灵敏的结合活性。

2.SDS-PAGE方法鉴定

1)使用制备的10μL(浓度：1mg/mL)SARS-CoV-2 S RBD重组蛋白与10μL 还原的上样缓冲液混合，100℃煮沸10min，制备蛋白裂解液。

2)用步骤(1)获得的蛋白裂解液进行SDS-PAGE跑胶，浓缩胶80V，跑40 分钟，分离胶120V，跑90分钟。

3)电泳结束后，使用考马斯亮蓝对胶进行染色，室温染色1h。

4)染色结束后，加入适量脱色液进行脱色，期间换脱色液4-6次,待凝胶上脱色完成后，将胶放入凝胶成像系统中拍照。

SARS-CoV-2 S RBD重组蛋白SDS-PAGE结果鉴定见图3，SARS-CoV-2 S RBD重组蛋白(hFc)在65kD附近有单一条带，分子量大小符合要求。

3.Western blot方法鉴定

1)使用制备的5μL(浓度：1mg/mL)SARS-CoV-2 S RBD重组蛋白与5μL 还原loadingbuffer混合，100℃煮沸10min，制备蛋白裂解液。

2)用步骤(1)获得的蛋白裂解液进行SDS-PAGE跑胶，浓缩胶80V，跑40 分钟，分离胶120V跑90分钟。

3)电泳结束后，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上。

4)转膜结束后，次日进行Western blot实验流程。

5)封闭：使用5％脱脂奶粉的TBST溶液进行膜封闭，室温条件下孵育1h。

6)一抗：使用SARS-CoV-2 S1兔单克隆抗体(40150-R007，北京义翘神州)，稀释1000倍后，室温孵育1h。

7)二抗：使用TBST洗膜后，滴加1:4000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG(货号：31460，Thermo)，室温孵育1h。TBST洗膜3次，每次10min。

8)显色：配制显色液，滴加1mL显色液在膜上，显色5min后置于凝胶成像系统中进行曝光，并拍照。

Western blot鉴定SARS-CoV-2 S RBD结果见图4。

从图4可知，使用本发明制备的SARS-CoV-2 S RBD重组蛋白，可识别商品化的抗SARS-CoV-2 S1兔单克隆抗体。

实施例4监测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)单克隆抗体的制备及其可变区氨基酸序列

使用上述实施例制备的SARS-CoV-2 S RBD重组蛋白免疫兔之后，采用百凌生物抗体开发技术平台-重组兔单抗技术进行制备、生产，具体地取免疫后的兔血清，分离培养B细胞，获得阳性克隆后，提取阳性克隆的mRNA，进行克隆重组，获得的轻重链基因片段转染293细胞进行抗体表达，然后对表达的转染上清进行proteinA纯化，共得到3种抗体。

抗SARS-CoV-2 S RBD抗体1运用Kabat在线软件分析包含以下多肽序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3：

(1)CDR-H1氨基酸序列包括：NQYVMC(SEQ ID NO:4)。

(2)CDR-H2氨基酸序列包括：CMETDDSRTWYASWAKG(SEQ ID NO: 5)。

(3)CDR-H3氨基酸序列包括；DFYLSQAL(SEQ ID NO:6)。

(4)CDR-L1氨基酸序列包括：QASPNIYKNNYLA(SEQ ID NO:7)。

(5)CDR-L2氨基酸序列包括：RASTLAS(SEQ ID NO:8)。

(6)CDR-L3氨基酸序列包括：LGEFSCDSGDCFA(SEQ ID NO:9)。

抗SARS-CoV-2 S RBD抗体2运用Kabat在线软件分析包含以下多肽序列的 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3：

(1)CDR-H1氨基酸序列包括：NNGMN(SEQ ID NO:10)。

(2)CDR-H2氨基酸序列包括：YIYPGSGNTYYASWAKG(SEQ ID NO: 11)。

(3)CDR-H3氨基酸序列包括；MSL(SEQ ID NO:12)。

(4)CDR-L1氨基酸序列包括：QASQSVFSNNYLA(SEQ ID NO:13)。

(5)CDR-L2氨基酸序列包括：KASTLDS(SEQ ID NO:14)。

(6)CDR-L3氨基酸序列包括：LGSYDCKRADCNV(SEQ ID NO:15)。

抗SARS-CoV-2 S RBD抗体1与抗SARS-CoV-2 S RBD抗体2为经筛选后得到的抗体对；抗SARS-CoV-2 S RBD抗体1为包被抗体，抗SARS-CoV-2 S RBD 抗体1为检测抗体。该抗体对可用于检测SARS-CoV-2 S RBD抗原，该抗体对可开发成ELISA检测试剂盒(双抗体夹心法)、免疫层析试纸条等检测方法。

抗SARS-CoV-2 S RBD抗体3运用Kabat在线软件分析包含以下多肽序列的 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3：

(1)CDR-H1氨基酸序列包括：DYWMT(SEQ ID NO:16)。

(2)CDR-H2氨基酸序列包括：VIATSGRAYYASWAKG(SEQ ID NO:17)。

(3)CDR-H3氨基酸序列包括；GASIGL(SEQ ID NO:18)。

(4)CDR-L1氨基酸序列包括：QSSQSLYEYNWCS(SEQ ID NO:19)。

(5)CDR-L2氨基酸序列包括：GASILDS(SEQ ID NO:20)。

(6)CDR-L3氨基酸序列包括：QGGYSGNICP(SEQ ID NO:21)。

该抗SARS-CoV-2 S RBD抗体3为可阻止SARS-CoV-2 S RBD与ACE2蛋白的结合，故抗SARS-CoV-2 S RBD抗体3为新冠病毒的中和抗体。

筛选抗新冠病毒和SARS病毒的广谱中和抗体不仅可以用于当前 COVID-19的潜在治疗，也可用于治疗未来SARS相关的冠状病毒感染。

实施例5监测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)保护性疫苗的免疫层析装置及其应用

所述的监测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)保护性疫苗的胶体金免疫层析装置包括依次相连的样品垫1、金标结合垫2、反应垫3、吸水垫5和PVC底板5。样品垫1、金标结合垫2、反应垫3和吸水垫4从左到右分别搭接组装在PVC底板5 上。其中样品垫1右侧叠加一部分压在金标结合垫2左侧上，金标结合垫2右侧叠加一部分压在反应垫3左侧上，吸水垫4左侧叠加一部分压在反应垫3右侧上。其中在反应垫3上分别划有检测线31(T线)和质控线32(C线)，检测线31靠近金标结合垫2，质控线32靠近吸水垫4。图5A为免疫层析装置组装示意图。具体制备方法如下：

1.制备胶体金；

2.胶体金偶联上述SARS-CoV-2 S RBD重组蛋白

采用常规偶联方法：静电吸附法；

胶体金偶联兔IgG，方法同胶体金偶联SARS-CoV-2 S RBD重组蛋白；

3.免疫层析装置的组装：

1)在金标结合垫2上喷涂0.5-1mg/mL胶体金偶联SARS-CoV-2 S RBD重组蛋白和胶体金偶联兔IgG混合物，烘干后待组装；

2)在反应垫1(这里为硝酸纤维素膜)上喷涂检测线31(T线)和质控线32 (C线)。其中T线为ACE2蛋白(货号：ACE-HM401型号，上海恺佧生物)，C线为羊抗兔IgG二抗(货号：111005003，Jackson Immuno Research)，烘干后待组装。

3)结合图5A的示意图，分别将样品垫1、金标结合垫2、反应垫3和吸水垫 4从左到右分别搭接组装在PVC底板5上。

4)将步骤3)中的试纸条切割成等宽(约5mm)的小试纸条，并装进检测卡中，干燥保存待用。

加入待测样本至样本垫1上，室温放置10min后判定结果，结果判定标准如下(如图5B所示)：

①仅质控线32(C线)呈现一个条带(红色)，为阳性；

②质控线32(C线)和检测线31(T线)均呈现条带(红色)，为阴性；

③质控线32(C线)未呈现条带，表明此试剂条已失效，应当更换新的试纸条重新检测。

取实施例4制备的具有中和活性的抗SARS-CoV-2 S1兔单克隆抗体3，将其分别稀释至50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、 1.5625ng/mL、0.78125ng/mL、0.390625ng/mL、0ng/mL，分别滴加在同一批次制备的胶体金试纸条上，观察T线呈现条带情况，检测结果见图6，结果可知：在滴加0.78125ng/mL浓度样品时，出现T线呈现条带情况，代表了其检测灵敏度为0.78125ng/mL。

滴加阴性血清样本1(未感染SARS-CoV-2)，检测其特异性：取1-2滴阴性样本滴加到监测SARS-CoV-2保护性疫苗的胶体金免疫层析试纸条上；滴加阳性血清样本2(在阴性血清样本中滴加SARS-CoV-2表达的S RBD重组蛋白)，检测其特异性：取1-2滴阴性样本滴加到监测SARS-CoV-2保护性疫苗的胶体金免疫层析试纸条上；根据检测线31和质控线32的条带呈现情况，判断血液样本中是否含有SARS-CoV-2中和抗体。其判断方法如下：

1)阳性：检测线31(T线)不呈现条带，质控线32(C线)呈现条带，说明血液样品中含有针对于SARS-CoV-2含S RBD区域的中和抗体，可实现预防机体感染新冠病毒。该抗体与金标结合垫2上的胶体金标记的SARS-CoV-2 S RBD区域结合后，导致胶体金标记的SARS-CoV-2 S RBD区域重组蛋白不可与反应垫3上的ACE2蛋白结合，故在反应垫3上检测线31(T线)不呈现条带，而金标结合垫2上的胶体金标记的兔IgG经层析后可与质控线32(C线)上的羊抗兔IgG发生特异性结合而呈现条带。阳性结果如表1、图7所示。

2)阴性：检测线31(T线)和质控线32(C线)均呈现条带，说明血液样品中不含有针对于SARS-CoV-2 S RBD区域的中和抗体。即金标结合垫2上的胶体金标记的SARS-CoV-2含SRBD区域的重组蛋白与反应垫3上的ACE2蛋白发生结合，从而使得反应垫3上检测线(T线)呈现条带。同时，金标结合垫2上的胶体金标记的兔IgG经层析后可与质控线32(C线)上的羊抗兔IgG发生特异性结合而呈现条带。阴性结果如表1、图8所示。

3)失效：质控线32(C线)不呈现条带，说明该试纸条已失效。

检测结果见表1。

表1样本检测结果

实施例6监测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)保护性疫苗的ELISA中和检测法应用

包被：使用碳酸盐缓冲液(0.05M，pH9.6 CBS)稀释ACE2(His tag)重组蛋白(货号：ACE-HM401，上海恺佧生物)至2μg/mL，50μL/well包被酶标板，4℃包被过夜。

封闭：次日，使用0.01M PBST洗液洗板3次，每次250μL/well洗液。洗好的酶标板每孔加入150μL 5％脱脂奶粉，于30℃封闭1h。

一抗稀释及孵育：将实施例4制备的抗SARS-CoV-2 S RBD抗体3预稀释至 4μg/mL，随后在稀释板上进行4倍倍比稀释，共10个梯度。将SARS-CoV-2 S RBD (hFc tag)重组蛋白稀释至30ng/mL，将待检样品分别稀释1:0、1:2、1:4共3个梯度。在一洁净的稀释板上分别加50μL/well已稀释好的SARS-CoV-2 S RBD (hFc tag)重组蛋白，再加入50μL/well抗SARS-CoV-2 S RBD抗体3梯度稀释样品和50μL/well不同梯度稀释的待检样品，同时设置0孔和阴性孔。30℃孵育 30min后。清洗封闭的酶标板中加入50μL/well上述孵育后的样品。30℃孵育1h 左右。

二抗孵育：一抗孵育结束后，每孔加入1:4000HRP标记的羊抗人(Fc specific)，30℃孵育1h左右。

显色：每孔加入50μL/well TMB显色液，30℃避光显色15min左右。

终止：使用1M硫酸进行终止反应。

检测：于酶标仪处读取OD450的值。

使用制备的SARS-CoV-2 S RBD重组蛋白及抗SARS-CoV-2 S RBD抗体3的 ELISA中和检测标曲结果见图9，结果显示：SARS-CoV-2 S RBD中和抗体3的中和竞争活性的IC50为12.1ng/mL，明显优于市售的SARS-CoV-2 S RBD(货号： Cat#DA035，上海近岸生物)的竞争活性，其说明书IC50为0.56μg/mL。

实施例7双抗体夹心法检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原S RBD

使用实施例4制备的抗SARS-CoV-2 S RBD抗体1与抗SARS-CoV-2 S RBD 抗体2组成的抗体对，可实现2019-新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原S RBD的检测。检测方法如下：

捕获抗体包被：使用磷酸盐缓冲液(0.05M，pH9.6)稀释抗SARS-CoV-2 S RBD抗体1至1μg/mL，50μL/well包被酶标板，4℃包被过夜。

封闭：次日，使用0.01M PBST洗液洗板3次，每次250μL/well洗液。洗好的酶标板每孔加入150μL 5％脱脂奶粉，于30℃封闭1h。

加标准品：将自制的SARS-CoV-2 S RBD重组蛋白预稀释至500ng/mL，随后在稀释板上进行3倍倍比稀释，共10个梯度。30℃孵育反应1h。

加检测抗体：标准品孵育结束后洗板。每孔加1μg/mL的生物素(biotin) 标记的抗SARS-CoV-2 S RBD抗体2，30℃孵育反应1h。

加亲和素标记的辣根过氧化物酶(SA-HRP)：洗板后加1:5000稀释的 SA-HRP，30℃孵育反应40min-60min。

显色：每孔加入50μL/well TMB显色液，30℃避光显色15min左右。

终止：使用1M硫酸进行终止反应后于酶标仪处读取OD450的值。

使用上述SARS-CoV-2单克隆抗体对检测SARS-CoV-2 S RBD的标曲如图 10所示，从结果可得所述抗体对检测SARS-CoV-2 S RBD的灵敏度为 0.335ng/mL。

由此可见，该抗体对可开发成2019-新冠病毒及具有相同RBD的其他冠状病毒的抗原检测试剂盒。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 杭州百凌生物科技有限公司

<120> 一种SARS-CoV-2病毒S蛋白受体结合区域编码基因、抗体及应用

<130> AJ2010198

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtccaac caacagaatc tattgttaga tttcctaata ttacaaactt gtgccctttt 60

ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca tctgtttatg cttggaacag gaagagaatc 120

agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta tataattccg catcattttc cacttttaag 180

tgttatggag tgtctcctac taaattaaat gatctctgct ttactaatgt ctatgcagat 240

tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt 300

gctgattata attataaatt accagatgat tttacaggct gcgttatagc ttggaattct 360

aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat tataattacc tgtatagatt gtttaggaag 420

tctaatctca aaccttttga gagagatatt tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca 480

ccttgtaatg gtgttgaagg ttttaattgt tactttcctt tacaatcata tggtttccaa 540

cccactaatg gtgttggtta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta 600

catgcaccag caactgtttg tggacctaaa aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt 660

gtcaatttc 669

<210> 2

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtgcagc ccaccgagtc catcgtgagg tttcccaaca tcaccaacct gtgccccttc 60

ggcgaggtgt ttaacgccac cagattcgcc tccgtgtacg cctggaacag gaagaggatc 120

tccaactgtg tggccgatta ctccgtgctg tacaatagcg cctccttcag caccttcaag 180

tgctacggcg tgtcccctac caagctgaac gacctgtgtt tcaccaatgt gtacgccgat 240

tccttcgtga tcagaggcga tgaggtgaga cagatcgccc ccggccagac aggcaagatc 300

gccgactaca attacaagct gcccgatgac ttcacaggct gtgtgatcgc ctggaattcc 360

aataacctgg atagcaaggt gggcggcaat tacaattacc tgtacagact gttcagaaag 420

tccaacctga agcccttcga gagagacatc tccacagaga tctaccaggc cggctccacc 480

ccctgcaatg gcgtggaggg cttcaattgt tacttccccc tgcagtccta cggcttccag 540

cctacaaacg gcgtgggcta ccagccctac agggtggtgg tgctgtcctt cgagctgctg 600

cacgcccctg ccacagtgtg tggccctaag aagtccacaa acctggtgaa gaataagtgc 660

gtgaatttc 669

<210> 3

<211> 223

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

210 215 220

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asn Gln Tyr Val Met Cys

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Cys Met Glu Thr Asp Asp Ser Arg Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Phe Tyr Leu Ser Gln Ala Leu

1 5

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Ala Ser Pro Asn Ile Tyr Lys Asn Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Leu Gly Glu Phe Ser Cys Asp Ser Gly Asp Cys Phe Ala

1 5 10

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Asn Asn Gly Met Asn

1 5

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Tyr Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Ser Leu

1

<210> 13

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gln Ala Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Lys Ala Ser Thr Leu Asp Ser

1 5

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Lys Arg Ala Asp Cys Asn Val

1 5 10

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Asp Tyr Trp Met Thr

1 5

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Val Ile Ala Thr Ser Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Gly Ala Ser Ile Gly Leu

1 5

<210> 19

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Gln Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Glu Tyr Asn Trp Cys Ser

1 5 10

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Gly Ala Ser Ile Leu Asp Ser

1 5

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Gln Gly Gly Tyr Ser Gly Asn Ile Cys Pro

1 5 10