PDCoV全长基因的构建方法及引物

文档序号：1884814 发布日期：2021-11-26 浏览：16次 >En<

阅读说明：本技术 PDCoV全长基因的构建方法及引物 (Construction method and primer of PDCoV full-length gene ) 是由易宏波谢永生王丽蒋宗勇于 2021-08-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于构建PDCoV全长基因的引物,其包括15组引物对,其序列如SEQ ID No.1～30所示。本发明还公开了PDCoV全长基因的构建方法、用于检测PDCoV的试剂盒。本发明中的引物具有良好的特异性,可高效地构建PDCoV全长基因,为PDCoV的全基因组测序、致病机理研究、抗PDCoV的疫苗/药物的研制提供良好的基础。(The invention discloses a primer for constructing a PDCoV full-length gene, which comprises 15 groups of primer pairs, wherein the sequence of the primer pairs is shown as SEQ ID No. 1-30. The invention also discloses a construction method of the PDCoV full-length gene and a kit for detecting PDCoV. The primer has good specificity, can efficiently construct the PDCoV full-length gene, and provides a good basis for the whole genome sequencing of PDCoV, the research of pathogenic mechanism and the development of anti-PDCoV vaccine/medicament.)

PDCoV全长基因的构建方法及引物

技术领域

本发明涉及猪德尔塔冠状病毒技术领域，尤其涉及一种PDCoV全长基因的构建方法及引物。

背景技术

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)是δ冠状病毒属中新发现的一种猪肠道冠状病毒，2012年由中国香港研究者在一项冠状病毒的分子流行病学监测研究中首次发现。随后各国的流行病学监测结果显示，在美国、加拿大、墨西哥、韩国、中国、泰国、老挝、日本等国家的商品化养猪场中均发现了PDCoV的感染，表明该病毒已成为世界流行的趋势。PDCoV是当前引起仔猪出现腹泻症状的第二大猪冠状病毒，可引起新生仔猪和保育仔猪出现严重腹泻、呕吐、脱水和小肠绒毛的大面积萎缩，导致消化吸收不良，从而出现死亡。由于PDCoV的全基因长度在25kb以上，且较易发生突变与重组，一直以来使用PCR方法扩增PDCoV 的全基因时，都会面临引物的特异性差、成功率低，扩增不同基因片段之间的引物往往因退火温度差异大而无法同时进行PCR反应等诸多问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种用于构建PDCoV全长基因的引物，其可有效提升全长基因的构建效率。

本发明还要解决的技术问题在于，提供一种PDCoV全长基因的构建方法，其构建效率高。

本发明还要解决的技术问题在于，提供一种用于检测PDCoV的试剂盒。

本发明还要解决的技术问题在于，提供一种质粒。

本发明还要解决的技术问题在于，提供一种上述引物的在制备抗PDCoV疫苗或药物中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于构建PDCoV全长基因的引物，其包括15组引物对，其序列如SEQ ID No.1～30所示。

上述15组引物对可在相同的退火温度和相同的延伸时间下进行PCR反应，且具有良好的特异性，可有效提升全长基因的构建效率。

相应的，本发明还公开了一种PDCoV全长基因的构建方法，其包括将上述的引物进行扩增的步骤。

作为上述技术方案的改进，包括：

提取PDCoV病毒RNA；

以提取得到的PDCoV病毒RNA为模板，利用上述的引物对进行PCR扩增， PCR扩增产物经测序后拼接即得PDCoV全长基因。

作为上述技术方案的改进，PCR反应体系为：PrimeScript 1Step Enzyme Mix 0.5～1.5μL，2×1Step Buffer 20～28μL，上下游引物各1～3μL，模板2～4μL， RNase-freeH₂O 16～20μL；

PCR反应条件为：

50～55℃预变性25～35min；

90～95℃变性15～40s，50～55℃退火20～35s，70～75℃延伸2～3min，重复30～40 个循环；

70～75℃延伸10～15min。

作为上述技术方案的改进，PCR反应体系为：PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μL，2×1Step Buffer 25μL，上下游引物各2μL，模板3μL，RNase-free H₂O 17μL；

PCR反应条件为：

50℃预变性30min；

94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸2.5min，重复35个循环；

72℃延伸10min。

相应的，本发明还公开了一种用于检测PDCoV的试剂盒，其包括上述的引物。

作为上述技术方案的改进，还包括上述的PCR反应体系。

相应的，本发明还公开了一种质粒，其由上述的任一引物经PCR扩增，与载体连接后所得。

作为上述技术方案的改进，所述载体为pMD19-T载体。

相应的，本发明还公开了上述的用于构建PDCoV全长基因的引物在制备抗 PDCoV疫苗或药物中的应用。

实施本发明，具有如下有益效果：

本发明的所提供的引物，其PCR反应体系相同、退火温度相同且延伸时间也相同，可大幅提升PCR反应的效率。此外，本发明中的引物还具有良好的特异性，可高效地构建PDCoV全长基因，为PDCoV的全基因组测序、致病机理研究、抗PDCoV的疫苗/药物的研制提供良好的基础。

附图说明

图1是本发明中引物PCR扩增产物的电泳鉴定图，其中，M为DL5000 DNA Marker，1～15为第1～15对引物的阳性条带，16为阴性对照。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

传统的用于构建PDCoV的全长基因的引物具有特异性差、成功率低的缺点，且由于退火温度差异大，导致无法同时进行PCR反应。为此，本发明提供了一种用于构建PDCoV全长基因的引物，其包括15组引物对，其序列如下表所示：

表1用于构建PDCoV全长基因的引物

上述引物对都可在相同的退火温度和相同的延伸时间下进行PCR反应，并使用同一PCR反应体系，大幅提升了PDCoV全长基因的构建效率。同时，上述引物的特异性良好，构建成功率高。

相应的，本发明还提供了一种PDCoV全长基因组的构建方法，其包括：

(1)提取PDCoV病毒RNA；

具体的，可采用本领域常用的试剂盒进行提取，示例性的如Viral DNA/RNAMiniprep Kit试剂盒，但不限于此。提取方法可根据试剂盒的具体操作说明进行。

(2)以提取得到的PDCoV病毒RNA为模板，利用上述的引物对进行PCR 扩增，PCR扩增产物经测序后拼接即得PDCoV全长基因。

具体的，步骤2包括：

(2.1)以提取得到的PDCoV病毒RNA为模板，利用上述的引物对进行PCR 扩增，得到扩增产物；

其中，可分别对各引物对进行PCR扩增反应，亦可同时对15组引物对进行扩增反应。优选的，15组引物对同时进行PCR扩增反应。

其中，PCR反应体系包括：PrimeScript 1Step Enzyme Mix、2×1Step Buffer 20～28μL、上游引物(F)、下游引物(R)、模板和RNase-free H₂O。每组引物对的PCR反应体系的总体积为50μL。

具体的，PCR体系中各组分的含量为：PrimeScript 1Step Enzyme Mix为 0.5～1.5μL，示例的为0.5μL、0.7μL、1μL、1.2μL或1.4μL；2×1Step Buffer 20～28μL，示例性的为20μL、22μL、24μL、26μL或28μL；上下游引物各2～4μL，示例性的为2μL、2.5μL、3μL或4μL；RNase-free H₂O 16～20μL，示例性的为17μL、 18μL、19μL或20μL。

其中，PCR反应条件为：

50～55℃预变性25～35min；

90～95℃变性15～40s，50～55℃退火20～35s，70～75℃延伸2～3min，重复30～40 个循环；

70～75℃延伸10～15min。

优选的，PCR反应条件为：

50℃预变性30min；

94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸2.5min，重复35个循环；

72℃延伸10min。

(2.2)将扩增产物经纯化、克隆、测序后连接，即得PDCoV全长基因。

其中，扩增产物的纯化步骤为：将扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，将阳性条带回收后纯化。

克隆、测序步骤为：将纯化后的扩增产物克隆入质粒载体中，构建质粒。并将重组质粒转化入感受态细胞，并将感受态细胞培养，培养后菌落经鉴定为阳性菌落后采用Omega公司的质粒小提试剂盒提取重组质粒，进行测序。

具体的，质粒载体可选用pMD19-T载体，但不限于此。感受态细胞可选用 DH5α感受态细胞，但不限于此。

其中，连接的步骤包括：采用DNAstar软件对测序结果进行拼接处理，即获得PDCoV全长基因序列。

相应的，本发明还公开了一种用于检测PDCoV的试剂盒，其包括上述的引物，还包括上述的PCR反应体系。

相应的，本发明还公开了一种质粒，其由上述的引物经PCR扩增后，扩增产物与在载体连接所得。

具体的，其制备方法为：将引物扩增产物纯化后克隆至pMD19-T载体中，构建质粒。并将质粒转化入DH5α感受态细胞，转化后的DH5α感受态细胞均匀的涂在氨苄抗性平板上，放入37℃恒温培养箱，24h后挑选单个菌落；经PCR 鉴定为阳性的单菌落继续扩大培养后，用质粒小提试剂盒提取重组质粒。可采用该重组质粒转染细胞，进而构建PDCoV标记疫苗毒株，进而构建抗PDCoV 疫苗。

下面以具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1引物的设计

设计原则：将下载自GenBank中已发表的PDCoV标准全长序列(Accession:KJ584355、KJ620016、KR265851、KY354364、KY926512、LC260045、KU051641、 KX118627、KX834352、MN025260、KP757891、KU981059、MF948005、 MK625641、KU665558、KY065120、LC216914、MF095123、KX443143、 MK211169、MN942260、MK359104、MN173781)利用MegAlign软件进行基因比对分析，并找出基因的保守区域，随后在这些保守区域内设计引物，选择Tm值和GC含量等参数都相近的上下游引物，且尽量保证上下游引物之间无发夹结构、无引物二聚体，每对引物扩增的目的片段长度都在2500bp以内。最终设计并合成了2套可扩增PDCoV全长基因序列的引物组，第1套引物组共有15 对引物(如表2所示)，而第2套引物组共有16对引物。所述引物序列如表3 所示。

表2用于构建PDCoV全长基因的引物1

表3用于构建PDCoV全长基因的引物2

经验证，表2中各引物对的退火温度均为54℃，其延伸时间为2.5min，故可在此条件下同时进行PCR反应，大幅度提升了PCR反应效率。

而表3中引物对温度为51～56℃，某些引物对的退火温度之间相差较大，无法通过一次PCR反应扩增出全长基因，因此表3中的引物对需要在不同退火温度的PCR反应条件下进行扩增。

实施例2PDCoV全长基因的构建

1、实验材料及仪器

One-step RT-PCR kit、DL5000 DNA Marker、RNase-free H₂O等购自大连宝生物工程有限公司；DNA胶回收纯化试剂盒购自Omega公司；Viral DNA/RNA Miniprep Kit购自爱思进公司。

2、毒株来源

PDCoV阳性毒株由华南农业大学兽医学院预防兽医学传染病教研室分离并保存。

3、全长基因的构建

(1)病毒样品的DNA/RNA提取

取PDCoV毒株上清液200μL用于病毒核酸提取，使用Viral DNA/RNA Miniprep Kit(爱思进病毒基因组提取试剂盒)按操作说明书提取病毒RNA，获得RNA后，立即置于-80℃以备用。

(2)PCR扩增、纯化

使用Viral DNA/RNA Miniprep Kit试剂盒提取病毒RNA后，以其为模板，利用表2的15对特异性引物扩增PDCoV的全长基因。

具体的，使用Takara的一步法试剂盒进行PCR扩增，所有引物对的反应体积都为50μL；PCR反应体系为：PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μL，2×1Step Buffer 25μL，上下游引物(F和R)各2μL，RNA模板3μL，RNase-free H₂O 17μL。

PCR反应条件为：50℃30min，94℃2min；94℃30s，54℃30s，72℃延伸2.5min，35个循环；72℃终延伸10min。

PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，切下阳性条带用胶回收试剂盒纯化PCR 扩增产物。

(3)PCR产物的克隆与测序

将回收纯化后的PCR产物克隆入pMD19-T载体内，构建重组质粒。并将质粒转化入DH5α感受态细胞，转化后的DH5α感受态细胞均匀的涂在氨苄抗性平板上，放入37℃恒温培养箱，24h后挑选单个菌落；经PCR鉴定为阳性的单菌落继续扩大培养后，用质粒小提试剂盒提取重组质粒。并对重组质粒进行测序。测序后采用DNAStar软件进行拼接处理。

4、检测结果

(1)取扩增产物，在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，结果如图1所示，从图中可以看出，在图中的1至15泳道上分别出现了15条与预期大小一致的目的条带，表明15对引物都成功扩增出了相应的目的条带。

(2)基因测序获得了15对引物的测序结果，分析显示这些序列均是来自 PDCoV基因组的不同位置，与预期序列相一致。使用DNAStar软件对这15对引物的测序结果进行拼接处理，成功获得了1株全长为25kb的PDCoV全长基因序列(GenBank号为MH715491)。

以上所述的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 广东省农业科学院动物科学研究所

<120> PDCoV全长基因的构建方法及引物

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA