具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。以下实施例中所用试剂或其他实验材料若未经特殊说明，均能从商业渠道购买获得。

甲病毒

本发明中，术语“甲病毒”应广泛地理解，并包括具有甲病毒特征的任何病毒颗粒。甲病毒的特征包括存在(+)链RNA，其编码适于在宿主细胞中复制的遗传信息，包括复制酶等。许多甲病毒的更多特征描述于例如Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页；Gould等，2010，Antiviral Res.，第87卷，第111-124页；Jonathan Rupp等，2015，J.Gen.Virology，第96卷，第2483-2500页；Kathryn Carpentier等，Curr OpinVirol，2018年，第28卷，第53-60页；Luis Carrasco等，Viruses，2018年，第10卷，第70页；Rebecca Brown等，Viruses，2018年，第10卷，第89页；Autumn Holmes等，PLoS Pathog，2020年，第16卷，e1008876等文献中。术语“甲病毒”包括自然界发现的甲病毒及其任何变体或衍生物。

在自然界中发现的甲病毒优选选自：赛姆利基森林病毒复合体包括塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)、巴马森林病毒(Barmah forest virus)、基孔肯尼雅病毒(Chikungunya virus)、欧尼恩病毒(O’nyong-nyong virus)、罗斯河病毒(Ross rivervirus)、贝巴鲁病毒(Bebaru virus)、盖他病毒(Getah virus)、鹭山病毒(Sagiyamavirus)、马雅罗病毒(Mayaro virus)及其亚型乌纳(Una virus)病毒；委内瑞拉马脑炎复合体包括委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、卡巴斯欧病毒(Cabassou virus)、沼泽地病毒(Everglades virus)、穆坎布病毒(Mucambo virus)、图那特病毒(Tonate virus)、皮克苏纳病毒(Pixuna virus)、莫索·达斯·佩德拉斯病毒(Mosso das pedras virus)、内格罗河病毒(Rio Negro virus)；西部马脑炎复合体包括西部马脑炎病毒(Western equine encephalitis virus)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、奥拉病毒(Aura virus)、瓦塔罗阿病毒(Whataroa)、高地J病毒(Highlands J virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)及其亚型博吉河病毒(Creek virus)；东部马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus)、米德尔堡病毒(Middelburg virus)、图那特病毒(Trocara virus)、孜拉加奇病毒(Kyzylagach virus)、恩杜姆病毒(Ndumu virus)、巴班肯病毒(Babanki virus)、挪威鲑鱼甲病毒(Norwegian salmonid alphavirus)、鲑鱼胰腺病病毒(Salmon pancreatic disease virus)、睡病病毒(Sleeping disease virus)和南方象海豹病毒(Southern elephant seal virus)等。

更优选地，甲病毒选自赛姆利基森林病毒复合体(包括如上所述的病毒类型，包括赛姆利基森林病毒)、西部马脑炎复合体(包括如上所述的病毒类型，包括辛德毕斯病毒)、委内瑞拉马脑炎复合体(包括如上所述的病毒类型，包括委内瑞拉马脑炎病毒)。

在本发明实施例中，甲病毒不是自然界中发现的甲病毒，例如：通过基因工程改造的甲病毒。通常，在自然界中未发现的甲病毒是自然界中发现的甲病毒的变体或衍生物，其与自然界中发现的甲病毒的区别在于核苷酸序列(即基因组RNA)至少存在一个突变。与自然界中发现的甲病毒相比，核苷酸序列中的突变可以选自一个或更多个核苷酸的插入、替换或缺失。核苷酸序列中的突变可以与核苷酸序列编码的多肽或蛋白质中的突变相关或不相关。例如，Erkuden Casales等人利用嘌呤霉素筛选到SFV表达载体复制酶R649H/P718T双突变体，其表达的β-半乳糖水平与亲本载体相似，且能够在至少10代传代过程中保持稳定的高表达水平(Erkuden Casales等，Virology，2008年，第376卷，第242-251页)。ToeyNivitchanyong等人利用非结构蛋白(nsP)P726S点突变，构建了两株Sindbis病毒株TE和633的非细胞病变且具有复制活性病毒，感染幼仓鼠肾(BHK)细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞后可持续地表达异源基因(Toey Nivitchanyong等，Virus Res.，2009年，第141卷，第1-12页)。

复制酶构建体的表征

甲病毒的基因组共有2个开放阅读框，5’末端的前2/3部分编码4种非结构蛋白(nsP1-4)，称为非结构区，在感染细胞过程中5’末端的非结构蛋白首先翻译成一种大的多聚蛋白，产生RNA复制和转录所需要的复制酶复合体，利用基因组RNA作为模板合成负链，该过程发生在细胞感染后的3-4小时内，之后将只会合成正链RNA。

本发明中的顺式RNA构建体中包含编码甲病毒复制酶的开放阅读框(ORF)。在本发明中，“非结构蛋白”是指甲病毒来源的任意一种或更多种单独的非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)，或包含多于一种甲病毒来源的非结构蛋白的多肽序列的多聚蛋白，例如nsP1234。在实施例中，“非结构蛋白”是指nsP123。

nsP1是一种鸟嘌呤-7-甲基转移酶(也被称为病毒帽子酶)，具有甲基转移酶和鸟苷酰基转移酶活性，以及复制复合物的膜锚定功能。其甲基转移酶结构域催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基基团添加到GTP分子中，形成共价m7GMP-nsP1中间产物，待nsP2去除正链RNA分子上的5’-γ-磷酸后，通过nsP1的鸟苷基转移酶活性将m7GMP部分转移到RNA分子上，形成0型帽状结构，即m7GpppA(Leevi&Tero Ahola，2002年，第71卷，第187-222页；Maija等，2017年,第234卷，第44-57页；Autumn T.LaPointe等，mBio.，2018年，第9卷，第e02342-18页)。

nsP2是最大的复制酶蛋白，是RNA结合蛋白，具有核酸水解酶(NTPase)、RNA解旋酶(RNA helicase)与蛋白酶活性，能打开RNA双链，辅助nsP1蛋白完成加帽的过程。nsP2的蛋白酶活性在复制酶分解为非结构蛋白过程中也发挥重要作用(Ellen G.Strauss等，Virology，1992，第191卷，第932-940页；M Gomez de Cedrón等，FEBS Lett，1999，第448卷，第19-22页；Leevi&Tero Ahola，2002年，第71卷，第187-222页；Maija等，2017年,第234卷，第44-57页)。

nsP3是一种磷酸化蛋白，该蛋白由三个结构域组成：具有磷酸酶活性和核酸结合能力的N端保守结构域、甲病毒独特结构域(AUD)和C端高变域(HVD)(Farhana Abu Bakar等，Viruses.，2018年，第10卷，第71页)。nsP3的功能了解较少，被称为nsPs中比较神秘的一个。近年来发现，nsP3与几种宿主蛋白质相互作用，包括应激颗粒相关蛋白、DEAD-box家族蛋白、热休克蛋白和激酶，并可能调节蛋白质蛋白质多聚/单-ADP核糖基化(Tyler Lark等，Front Microbiol，2017年，第8卷，第2652页；Maija等，2017年,第234卷，第44-57页；Benjamin等，Viruses，2018年，第10卷，第105页)。此外，nsP3还可能与与旧大陆甲病毒(如SFV)的神经毒力有关(Benjamin等，Viruses，2018年，第10卷，第105页)。

nsP4在C末端包含RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)结构域，是甲病毒中最保守的蛋白质。nsP4作为甲病毒复制复合体的主要催化核心，与宿主蛋白和其他nsP(如nsP123+nsP4)一起形成复制复合体(RC)，以病毒(+)链为模板合成(-)链RNA。nsP123裂解为nsP1、nsP2和nsP3后，可与nsP4形成四聚体，其不再具有合成负链RNA的功能，但它可利用负链RNA为模板参与复制基因组RNA和转录26S亚基因组RNA。纯化的nsP4还具有末端腺苷酸转移酶活性，可能在基因组3’端产生poly(A)尾(Maija等，2017年,第234卷，第44-57页；FarhanaAbu Bakar等，Viruses.，2018年，第10卷，第71页)。

复制酶的来源不限于任何特定的甲病毒。在一个优选的实施方案中，甲病毒复制酶来自赛姆利基森林病毒(SFV)，包括天然存在的赛姆利基森林病毒或变异体。在一个作为替代的优选实施方案中，复制酶来自辛德毕斯病毒(SINV)，包括天然存在的辛德毕斯病毒或变异体。在一个作为替代的优选实施方案中，复制酶来自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)，包括天然存在的VEEV或变异体。

UTR

术语“非翻译区”或“UTR”涉及转录但不翻译成氨基酸序列的区域，或RNA分子(例如mRNA分子)中的相应区域。甲病毒属的5’UTR和3’UTR含有不同的核心启动子元件，用于负链和正链RNA合成。甲病毒属加帽的5’UTR包含启动子元件、翻译调节序列及先天性免疫防御的结构(Jennifer L.Hyde等，Virus Research，2015，第206卷，第99-107页)。

甲病毒5’UTR包含核心启动子元件，这些元件与下游和3’UTR内的其他顺式作用元件一起作用，以调节正链和负链的合成(Kulasegaran Shylini等人，2009年，J Virol.，第8327-8339页)。甲病毒属的腺苷酸化3’UTR含有高度保守的病毒复制序列元件、决定细胞趋向性元件及影响病毒RNA稳定性保守结合区域(Jennifer L.Hyde等，Virus Res，2015年，第99-107页)。其中，聚poly(A)末端的19个核苷酸的共同保守序列(CSE)是负链合成的启动子(Kuhn等人，J Virol，1990年，第1465-1476页)，聚poly(A)尾与CSE共同支持负链合成和高效翻译，是病毒复制的必要步骤。

Poly(A)序列

本发明中所述的顺式RNA构建体中包含3’poly(A)序列。在甲病毒复制过程中，复制复合物和poly(A)尾之间通过poly(A)结合蛋白(PABP)相互作用，因此poly(A)尾部至少需要11-12个残基才能有效地产生负链RNA。负链合成在poly(A)尾部含有25或34个腺苷酸残基的RNA模板上复制效率相当；但是，当尾部尺寸减小到20个残基时，负链合成效率显著降低(>70％)。当尾部的尺寸减少到10个残基时，效率再次下降。3’poly(A)尾的缺失严重抑制了负链RNA的产生。一个没有3’poly(A)尾的模板RNA的负链RNA合成仅为含有25个3’末端腺苷酸残基的模板RNA的4％(Hardy and Rice，2005年，J Virol，第79卷，第4630-4639页)。

此外，poly(A)序列还会影响转染的真核细胞中RNA稳定性和蛋白质翻译的功能。据文献报道，约120个A核苷酸的3’poly(A)序列对转染的真核细胞中的RNA水平以及3’poly(A)序列上游的开放阅读框翻译的蛋白质水平具有有益影响(Nadine Bangel-Ruland，JGene Med，2013，第15卷，第414-426页)。此外，采用分段poly(A)，如poly(A)2×60_G或poly(A)2×60_T，可以显著减少质粒在大肠杆菌中的重组，而不会对mRNA半衰期和蛋白质表达产生任何负面影响。这种poly(A)尾的特征在于，它由至少两个含A的元素组成，每个元素被定义为由40-60个腺苷酸组成的核苷酸序列，由不同长度的间隔元件隔开。与传统的同质poly(A)尾相比，分段化poly(A)尾在重组质粒和产生的mRNA性能(半衰期和翻译效率)方面具有更高的潜力(Zeljka Trepotec等人；RNA，2019年，第25卷，第507-518页)。

根据本发明，在一个实施方案中，3’poly(A)序列包含以下或基本上由以下或由以下组成：至少11个、优选至少25个、优选至少34个、优选至少69个、优选至少100个，且优选至多500个、优选至多400个、优选至多300个、优选至多200个、特别是至多150个A核苷酸，特别是约120个A核苷酸。在本发明中，poly(A)序列中至少50％，优选至少75％，是A核苷酸，但允许剩余的核苷酸是除A核苷酸外的核苷酸，例如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鸟苷酸)、C核苷酸(胞苷酸)，以便形成分段化poly(A)尾。

密码子优化

mRNA使用3个字母的密码子意味着64个可能的密码子编码20个氨基酸和翻译停止信号。遗传密码的简并性是指编码同一氨基酸的几个三联体遗传密码中，一、二位碱基大多是相同的，只是第三位不同。同一氨基酸有多个密码子，由于tRNAs对核糖体A位点内的密码子进行随机识别，根据从tRNAs的细胞质池中选择合适的同源tRNA的效率，密码子可以被定义为最优。生物界中使用的密码子频率是不一样的，密码子偏差与大肠埃希菌、酿酒酵母、秀丽隐杆线虫、果蝇和真核生物中的tRNA水平相关(Gavin Hanson等，Nat Rev Mol CellBiol.，2018年，第19卷，第20-30页)。密码子优化的主要策略是通过克服与密码子利用率和tRNA丰度的物种特异性差异相关的限制来提高翻译延伸率。利用偏爱密码子，避开利用率低的稀有密码子，同时简化基因转录后mRNA的二级结构，去除不利于高效表达的基序(Motif)，加入有利于高效表达的基序，调整GC含量等这些方法重新设计基因编码。除了密码子的偏好性外，还需要考虑密码子的组合使用效率。在大部分情况下，仅用高频密码子的效果并不会最好，考虑到高频和次高频密码子的组合使用效果会更佳(Vincent P Mauro等，BioDrugs.，2018年，第32卷，第69-81页)。在本发明的一些实施方案中，由RNA分子包含的开放阅读框的密码子与开放阅读框起源的相应密码子可能不同，会根据不同的物种进行优化，称为“密码子优化”。综上，可以分别对编码本发明的复制酶、表达的外源蛋白的开放阅读框进行密码子的优化。

保守序列元件

本发明中，术语“保守序列元件”或“CSE”是指在甲病毒RNA中发现的核苷酸序列。这些序列元件称为“保守的”，因为直系同源物存在于不同甲病毒的基因组中，并且不同甲病毒的直系同源CSE优选地共享高百分比的序列和/或相似的二级或三级结构。在甲病毒基因组中发现了四个保守序列元件(CSE)，这些元件在病毒RNA复制过程中执行特定的功能。在一个实施方案中，根据本发明的复制子包含一种或更多种保守序列元件(CSE)(Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页)。例如在辛德毕斯病毒中，正链5’UTR前44个核苷酸形成一个保守的茎环结构，其互补序列位于负链的3’端，是以负链RNA为模板合成正链RNA的启动子。CSE2是nsPl蛋白编码序列前端51个核苷酸形成的保守茎环结构，是以正链RNA为模板合成负链RNA的共启动子。CSE3是位于nsP4蛋白末端的24个核苷酸，是转录亚基因组mRNA的启动子。CSE4是RNA 3’末端的19个核苷酸，是以正链RNA为模板合成负链RNA的启动子(Hardy和Rice，J.Virol.，2005，第79卷，第4630-4639页)。

在一个实施方案中，甲病毒5’复制识别序列和甲病毒3’复制识别序列能够在复制酶的存在下指导根据本发明的RNA复制子的复制。因此，当单独存在或优选地共同存在时，这些识别序列在复制酶的存在下指导RNA复制子复制。不希望受到任何特定理论的束缚，应理解甲病毒保守序列元件是在复制酶的存在下指导RNA复制子复制的识别序列。在该实施方案中，复制子识别序列通常指CSE1和2。此外，在一个作为替选的实施方案中，复制酶和保守序列元件可以来自不同的甲病毒属。

亚基因组启动子

本发明中，术语“亚基因组启动子”或“SGP”是指核酸序列(例如：编码序列)上游5’的核酸序列，其通过提供复制酶的识别和结合位点来控制所述核酸序列的转录。在特定实施方案中，根据本发明的RNA复制子包含亚基因组启动子。

优选地，本复制子编码的复制酶是能够识别亚基因组启动子的甲病毒复制酶。

优选地，根据本发明的亚基因组启动子是甲病毒结构蛋白的启动子，包含甲病毒中高度保守的CSE3，即最少包含非结构蛋白nsP4末端的24个核苷酸(以辛德毕斯病毒为例)，可以有效启动亚基因组RNA的转录。在一些实施方案中，SGP与CSE3相同或与CSE3重叠或包含CSE3。

异源核酸序列

在一个实施方案中，顺式复制子RNA包含至少一种不来源于甲病毒的核酸序列。根据本发明，术语“异源”或“外源”是指核酸序列不与甲病毒基因组核酸序列同源的情况。优选地，异源核酸序列受到甲病毒亚基因组启动子的控制。更优选地，异源核酸序列位于亚基因组启动子的下游。甲病毒亚基因组启动子非常有效，因此适合于高水平的异源基因表达(Kenneth Lundstrom，Molecules，2018年，第23卷，第3310页)。

目的蛋白

在一个实施方案中，根据本发明的RNA复制子包含编码目的肽或目的蛋白的开放阅读框。优选地，目的蛋白由异源核酸序列编码。优选地，目的基因受到亚基因组启动子的控制。更优选地，目的基因位于亚基因组启动子的下游。

本发明提供的复制子可以编码单个或多个蛋白。多个蛋白可以编码为融合表达的蛋白或者分开表达的蛋白。对于分开表达的蛋白，则可以向这些蛋白中的一个或更多个提供上游IRES，或在复制子中构建多个蛋白的开放阅读框，保持每个开放阅读框都受到亚基因组启动子的控制。另外，也可以向这些蛋白中加入自催化蛋白酶(例如：口蹄疫病毒2A蛋白)来隔开(Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页)。

本发明的复制子编码的目的蛋白也可以是免疫原性化合物或抗原表位或细胞因子，作为治疗性或保护性的目的。术语“抗原”或“免疫原”指能引起抗体生成的物质，是任何可诱发免疫反应的物质。抗原优选来源于天然存在的抗原的产物，例如来源于变应原、病毒、细菌、真菌、寄生虫和其他感染因子和病原体以及肿瘤抗原。术语“细胞因子”指由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，例如白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。

本发明实施例的安全特征

优选地，本发明的系统不包含任何甲病毒结构蛋白，例如：衣壳蛋白C、膜糖蛋白E1、E2、E3以及6K蛋白等。

优选地，在用本发明的顺式复制子RNA接种宿主细胞后，宿主细胞不产生病毒颗粒，例如：子代病毒颗粒。

优选地，复制子不驱动复制酶自身的复制，而只驱动目的基因RNA的复制。

本发明的DNA

本发明提供了DNA，其编码本发明提供的复制子。在一个优选的实施方案中，本发明提供的DNA是质粒。如本文所用，术语“质粒”指的是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体(或拟核)以外的DNA分子，具有自主复制能力，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子。

制备RNA的方法

根据本发明的任何RNA分子，都可以通过体外转录获得。体外转录RNA(IVT-RNA)可通过从核酸分子(特别是DNA分子)在体外转录获得。5’帽可以由帽-类似物添加到体外转录反应中获得，poly(A)尾部则由DNA模板上的聚(dT)序列编码。或者，也可以在获得转录产物后，通过酶促反应实现加帽和加poly(A)尾。体外转录方法是本领域技术人员已知的，各种体外转录试剂盒均是商品化的试剂盒。

疫苗佐剂

在一些实施方案中，mRNA的免疫刺激特性可以通过加入佐剂来提高mRNA疫苗的效力。这些方法包括传统的佐剂以及利用mRNA固有的免疫原性或其编码免疫调节蛋白的新方法。本发明的组合物可包含一种或更多种佐剂。

可以在疫苗中加入佐剂以刺激免疫系统的反应。示例性佐剂包括但不限于以下：生物性佐剂如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-12、干扰素-γ等；无机佐剂如氢氧化铝、明矾、磷酸铝等；人工合成佐剂如双链多聚肌苷酸、胞苷酸、双链多聚腺苷酸等；油剂如花生油乳化佐剂、矿物油、植物油、羊毛脂等；免疫激活蛋白如CD70、CD40L和TLR4等。

RNA药物递送系统

细胞膜主要由两性离子和带负电荷的磷脂的脂质双层组成，其中磷脂的极性头指向水性环境，疏水尾形成疏水核。各种离子泵和离子通道有助于在细胞膜上维持负电势(-40至-80mV)以控制大多数必需的金属离子(例如K⁺，Na⁺，Ca²⁺和Mg²⁺)的平衡。RNA必须穿过细胞膜才能到达细胞质，而跨细胞膜的负电位给高度带负电荷的RNA分子创建了强大的屏障。除了细胞膜屏障，RNA还面临着皮肤和血液中大量存在的细胞外核糖核酸降解的问题。裸露的RNA分子在生物体中迅速降解，在全身性给药后不会积聚在目标组织中，即使它们到达目标组织也无法穿透目标细胞，因此需要借助递送系统。

在一个实施方案中，本发明的RNA药物组合物包含至少一种含阳离子的复合物中。根据本发明的药物组合物可以包封在阳离子聚合物(Polyplexes,PP)、脂质体复合物(lipoplex，LP)、脂质体纳米粒(lipid nanoparticle，LNP)、阳离子纳米乳(cationicnanoemulsion，CNE)中。

在本发明的一个优选实施方案中，聚合物(Polymers)，例如聚乙烯亚胺(PEI)与带负电核酸的静电相互作用形成的阳离子聚合物(PP)。PEI是一组线性或支链的聚乙烯亚胺聚合物，对核酸有很强的亲和力，并具有促进内体逃逸的质子海绵效应，保护核酸不受酶降解的影响(Thomas Démoulins等，Nanomedicine，2016年，第12卷，第711-722页)。

在本发明的一个优选实施方案中，带负电荷的mRNA与带正电荷的阳离子脂质体经静电作用聚集形成多层囊状复合物即脂质体复合物(LP)中，复合物中包封的mRNA不易被RNase降解，能被成功递送至细胞内。DOTAP(1，2-二烯丙基-3-三甲基铵丙烷)、DOPE(1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)和DOTMA(N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)是已被证实有效的递送载体。阳离子脂质通常用于mRNA疫苗接种，因为它们不仅可以包裹mRNA，而且本身也可以用作免疫原，被认为是疫苗的佐剂(Yasmin Granot等，Seminarsin Immunology，2017年，第34卷，第68-77页)。

在本发明的一个优选实施方案中，mRNA存在于脂质体纳米粒(LNP)中，所述脂质体通常包含以下：(1)可电离的或阳离子的脂质或聚合材料，带有叔胺或季胺，可促进自组装成病毒大小(～100nm)的颗粒，用来封装聚阴离子mRNA，并允许内体释放mRNA到细胞质中；(2)辅助磷脂一般采用两性离子脂质，如DSPC(1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)，DOPE(1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)或POPE(1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)。辅助磷脂作为脂质体的骨架，类似于细胞膜中的脂质，有助于脂质双层形成和破坏，促进内体逃逸。一些磷脂具有多态性特征，在进入内涵体时能由层状转变为六角相，促进mRNA从脂质体中释放；(3)胆固醇，以稳定LNP的脂质双层,提高颗粒稳定性，增强了颗粒的稳定性，促进膜融合；(4)脂质连接的聚乙二醇(PEG)，使纳米颗粒具有水合层，提高胶体稳定性，可减少与血清蛋白的非特异性相互作用，绕过网状内皮系统的吸收并延长制剂的半衰期(Norbert Pardi等，2018年，Nat Rev Drug Discov.，第17卷，第261-279页；PiotrS.Kowalski等，Mol Ther，2019年，第27卷，第710-728页)。

在本发明的一个优选实施方案中，mRNA存在于一种由角鲨烯、非离子山梨醇酐酯表面活性剂、山梨醇酐三油酸酯(Span 85)或山梨醇酐单硬脂酸盐(Span 60)、阳离子脂质DOTAP等制成的阳离子纳米乳液(CNE)中，可以用于疫苗的制备(Jesse H.Erasmus等，MolTher.，2018年，第26卷，第2507-2522页)。

产生蛋白质的方法

本发明提供了在细胞中产生蛋白质的方法，其包括以下步骤：获得用于表达外源蛋白的RNA构建体，其包含用于驱动所述复制酶翻译的5’帽和增强mRNA稳定性的3’poly(A)，包含编码所述外源蛋白质的开放阅读框，将所述RNA构建体转染到所述细胞中。

在本发明的方法中，可以使用根据本发明的任何系统，或根据本发明的试剂盒，或根据本发明的药物组合物。RNA可以以药物组合物的形式使用，或者以裸RNA使用，例如：用于电穿孔或者脂质体转染等。

本发明提供了在生物体中产生蛋白质的方法，其包括以下步骤：获得用于表达外源蛋白的RNA构建体，其包含用于驱动所述复制酶翻译的5’帽和增强mRNA稳定性的3’poly(A)，包含编码所述外源蛋白质的开放阅读框，向所述对象施用该RNA构建体。本发明的药物可用于治疗对象的预防性以及治疗性方法。

疫苗接种

术语“免疫接种”或“疫苗接种”通常是指出于治疗或预防原因而治疗对象的过程。治疗，特别是预防性治疗，优选是或旨在包括旨在诱导或增强对象的针对一种或更多种抗原的免疫应答的治疗。根据本发明，如果期望通过使用如本文所述的RNA诱导或增强免疫应答，则可以通过RNA引发或增强免疫应答。在一个实施方案中，本发明提供预防性治疗，其优选地是或包括对对象进行疫苗接种。本发明的一个实施方案特别适用于疫苗接种，其中复制子编码作为目的蛋白的药学活性肽或蛋白质，它们是免疫活性化合物或抗原。本发明的药物可以施用于对象，例如，用于治疗对象，包括对象的疫苗接种。术语“对象”涉及脊椎动物，特别是哺乳动物包括人。

施用方式

根据本发明的药物可以以任何合适的途径施用于对象。

例如：药物可以全身性施用，可以以多种方式实现给药，例如静脉内、皮下、皮内、肌肉或吸入等。施用于肌肉组织或皮肤的替代方案包括但不限于：皮内、鼻内、眼内、腹膜内、静脉内、间质、经颊、透皮或舌下施用等。

实施例

一、材料与方法

(1)制备编码顺式复制子的DNA

顺式复制子的DNA序列(SEQ ID NO:1)送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成后，利用同源重组插入哺乳动物表达载体pVAX1(购自Invitrogen公司)中，此时聚合酶启动子变为CMV/T7，构建成pVAX1-SFV顺式复制子质粒。

(2)将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)或者荧光素酶报告基因(Luc)同源重组到顺式复制子的亚基因组启动子3’端的多克隆位点区域，分别构建成pVAX1-SFV-EGFP/pVAX1-SFV-Luc。

(3)将新冠病毒(SARS-CoV-2)刺突蛋白(Spike)中的受体结合域(RBD)同源重组到(1)构建的载体中，插入亚基因组启动子3’端的多克隆位点区域，分别构建成pVAX1-RBD/pVAX1-SFV-RBD。

(4)对(1)-(3)所述构建好的表达载体pVAX1-RBD/pVAX1-SFV-RBD，以及pVAX1-SFV-EGFP/pVAX1-SFV-Luc使用NEB公司的HiScribe^TM T7 ARCA mRNA Kit(with Tailing)(New England Biolabs，MA，USA)，按照说明书进行体外转录后，通过Nanodrop 2000超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)检测RNA浓度。

(5)RNA转染及蛋白表达检测

本实施例中所有细胞培养基、胎牛血清(FBS)、抗生素和其他补充剂均由美国Thermo Fisher Scientific公司提供。体外转录的pVAX1-RBD/pVAX1-SFV-RBD的mRNA转染人肾上皮细胞系(293T)(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库购得)，使用转染试剂Lipofectamine Messenger MAX(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)，按照制造商的说明书进行mRNA脂质体转染。新冠病毒RBD的表达情况通过Western Blot检测分析，抗体采用北京义翘神州科技有限公司生产的新冠病毒RBD抗体。

(6)萤光素酶测定

为了评价萤光素酶在转染细胞中的表达，将转染细胞接种到96孔白色微孔板(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)中。用Bright-Glo(Promega，Madison，USA)检测试剂检测萤火虫萤光素酶，使用EnSpire多功能酶标仪(PerkinElmer，MA，USA)测量生物发光。数据以相对萤光素酶单位[RLU]表示，使用萤光素酶阴性细胞以减去背景信号。

(7)假病毒中和实验

采用假型慢病毒荧光素酶报告系统，评价接种动物血清对SARS-CoV-2的中和能力。

具体地，SARS-CoV-2假型病毒是由慢病毒包装质粒pCMV delta R8.2、编码荧光素酶报告基因的表达质粒pCDH-CMV-luc以及一个表达新冠病毒Spike蛋白的质粒pcDNA3.1-Spike(购自Addgene)共转染293T细胞而产生，比例为1：1.5：1。通过离心法收集含病毒培养基，并在转染72小时后，通过0.45μm的膜过滤，随后在-70℃下储存。

对于中和试验，首先对热灭活血清进行连续稀释，并与SARS-CoV-2假型病毒一起培养1小时，然后将血清-病毒混合物转移到预先接种好的293T-hACE2细胞中。48小时后裂解细胞，用Bright-Glo(Promega，Madison，USA)检测试剂测定荧光素酶活性。然后使用GraphPad Prism(version 8.4)计算IC₅₀中和滴度。

(8)小鼠免疫

6-8周龄的BALB/c小鼠购买自河南省实验动物中心并在SPF级别动物实验室中饲养，所有实验均由郑州大学生命科学伦理审查委员会批准。

对小鼠用脂质体包裹的pVAX1-RBD及pVAX1-SFV-RBD质粒的mRNA(实验组)进行肌肉注射，并在初次免疫后第14、28天用等剂量的质粒mRNA进行增强免疫。初免后35天收集血清标本，56℃热灭活30min，-70℃保存。免疫小鼠的对照组采用的是PBS或脂质体包裹的pVAX1质粒的mRNA。实验组和对照组均采用5只小鼠，实验结果用平均值±SEM表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验，通过GraphPad Prism(version 8.4)软件进行统计分析。

二、结果与分析

1、将顺式复制子质粒pVAX1-SFV-EGFP及传统质粒pVAX1-EGFP体外转录为mRNA，通过Lipofectamine MessengerMAX^TM等物质的量转染到24孔板的BHK21细胞中48小时后，通过自扩增mRNA与传统mRNA表达外源蛋白(EGFP荧光蛋白)的比较。

结果如图2所示，构建的顺式复制子mRNA载体表达目的蛋白的表达效果远优于传统质粒。

2、将顺式复制子质粒pVAX1-SFV-Luc及传统质粒pVAX1-Luc体外转录为mRNA，通过Lipofectamine MessengerMAX^TM等物质的量转染到24孔板的BHK21细胞中48小时后，通过自扩增mRNA与传统mRNA表达外源蛋白(Luc作为报告基因)的比较，用Bright-Glo荧光素酶测定系统测定荧光素酶活性。实验结果用平均值±SEM表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。

结果如图3所示，构建的顺式复制子mRNA载体中表达目的基因更有效，自扩增mRNA载体表达效果远优于传统质粒(P＜0.05)。

3、使用转染试剂Lipofectamine Messenger MAX，将体外转录的pVAX1-RBD/pVAX1-SFV-RBD的mRNA转染293T 48小时后检测表达量。

Western Blot结果如图4所示，与传统表达载体相比，构建的顺式复制子mRNA载体中表达外源蛋白RBD的量更大。

4、用体外转录的100ng的pVAX1-SFV-RBD及pVAX1-RBD的mRNA经脂质体包裹后免疫小鼠，并在初次免疫后第14、28天用等剂量的质粒mRNA进行增强免疫，初免后35天收集血清标本，用ELISA法测定血清中抗RBD的IgG滴度(包被抗原为重组RBD蛋白)。对照组采用PBS或体外转录的pVAX1 mRNA免疫小鼠。实验结果用三次独立实验的平均值±SEM进行比较，组间比较采用Mann-Whitney U检验。ELISA实验中，对测试的最低稀释度(1：20)时没有任何反应的抗血清，其滴度指定为10用于统计学分析。

结果如图5所示，表明实验组pVAX1-SFV-RBD及pVAX1-RBD的mRNA免疫小鼠后，均产生了针对新冠病毒受体结合域(RBD)蛋白的IgG抗体，且顺式复制子pVAX1-SFV-RBD组的抗体滴度明显高于传统质粒pVAX1-RBD组(P＜0.05)。

5、用体外转录的100ng的pVAX1-SFV-RBD及pVAX1-RBD的mRNA经脂质体包裹后免疫小鼠，并在初次免疫后第14、28天用等剂量的质粒mRNA进行增强免疫，初免后35天收集血清标本，用假病毒中和实验来测定血清中和效价。对照组采用PBS或体外转录的pVAX1 mRNA免疫小鼠。实验结果用三次独立实验的平均值±SEM进行比较，组间比较采用Mann-Whitney U检验。中和实验中，在测试的最低稀释度(1：8)时未显示任何反应的抗血清，其滴度指定为4用于统计学分析。

结果如图6所示，表明在体外假病毒中和实验中，实验组pVAX1-SFV-RBD及pVAX1-RBD的mRNA免疫小鼠后，血清中均产生了中和抗体，提供了对细胞的保护。同时，顺式复制子pVAX1-SFV-RBD组的抗体效价明显高于传统质粒pVAX1-RBD组(P＜0.05)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 郑州大学

<120> 一种高效表达目的蛋白的顺式复制子RNA构建体

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9061

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actcttctgg tccccacaga ctcagagaga acccaccatg gccgccaaag tgcatgttga 60

tattgaggct gacagcccat tcatcaagtc tttgcagaag gcatttccgt cgttcgaggt 120

ggagtcattg caggtcacac caaatgacca tgcaaatgcc agagcatttt cgcacctggc 180

taccaaattg atcgagcagg agactgacaa agacacactc atcttggata tcggcagtgc 240

gccttccagg agaatgatgt ctacgcacaa ataccactgc gtatgcccta tgcgcagcgc 300

agaagacccc gaaaggctcg tatgctacgc aaagaaactg gcagcggcct ccgggaaggt 360

gctggataga gagatcgcag gaaaaatcac cgacctgcag accgtcatgg ctacgccaga 420

cgctgaatct cctacctttt gcctgcatac agacgtcacg tgtcgtacgg cagccgaagt 480

ggccgtatac caggacgtgt atgctgtaca tgcaccaaca tcgctgtacc atcaggcgat 540

gaaaggtgtc agaacggcgt attggattgg gtttgacacc accccgttta tgtttgacgc 600

gctagcaggc gcgtatccaa cctacgccac aaactgggcc gacgagcagg tgttacaggc 660

caggaacata ggactgtgtg cagcatcctt gactgaggga agactcggca aactgtccat 720

tctccgcaag aagcaattga aaccttgcga cacagtcatg ttctcggtag gatctacatt 780

gtacactgag agcagaaagc tactgaggag ctggcactta ccctccgtat tccacctgaa 840

aggtaaacaa tcctttacct gtaggtgcga taccatcgta tcatgtgaag ggtacgtagt 900

taagaaaatc actatgtgcc ccggcctgta cggtaaaacg gtagggtacg ccgtgacgta 960

tcacgcggag ggattcctag tgtgcaagac cacagacact gtcaaaggag aaagagtctc 1020

attccctgta tgcacctacg tcccctcaac catctgtgat caaatgactg gcatactagc 1080

gaccgacgtc acaccggagg acgcacagaa gttgttagtg ggattgaatc agaggatagt 1140

tgtgaacgga agaacacagc gaaacactaa cacgatgaag aactatctgc ttccgattgt 1200

ggccgtcgca tttagcaagt gggcgaggga atacaaggca gaccttgatg atgaaaaacc 1260

tctgggtgtc cgagagaggt cacttacttg ctgctgcttg tgggcattta aaacgaggaa 1320

gatgcacacc atgtacaaga aaccagacac ccagacaata gtgaaggtgc cttcagagtt 1380

taactcgttc gtcatcccga gcctatggtc tacaggcctc gcaatcccag tcagatcacg 1440

cattaagatg cttttggcca agaagaccaa gcgagagtta atacctgttc tcgacgcgtc 1500

gtcagccagg gatgctgaac aagaggagaa ggagaggttg gaggccgagc tgactagaga 1560

agccttacca cccctcgtcc ccatcgcgcc ggcggagacg ggagtcgtcg acgtcgacgt 1620

tgaagaacta gagtatcacg caggtgcagg ggtcgtggaa acacctcgca gcgcgttgaa 1680

agtcaccgca cagccgaacg acgtactact aggaaattac gtagttctgt ccccgcagac 1740

cgtgctcaag agctccaagt tggcccccgt gcaccctcta gcagagcagg tgaaaataat 1800

aacacataac gggagggccg gccgttacca ggtcgacgga tatgacggca gggtcctact 1860

accatgtgga tcggccattc cggtccctga gtttcaagct ttgagcgaga gcgccactat 1920

ggtgtacaac gaaagggagt tcgtcaacag gaaactatac catattgccg ttcacggacc 1980

gtcgctgaac accgacgagg agaactacga gaaagtcaga gctgaaagaa ctgacgccga 2040

gtacgtgttc gacgtagata aaaaatgctg cgtcaagaga gaggaagcgt cgggtttggt 2100

gttggtggga gagctaacca accccccgtt ccatgaattc gcctacgaag ggctgaagat 2160

caggccgtcg gcaccatata agactacagt agtaggagtc tttggggttc cgggatcagg 2220

caagtctgct attattaaga gcctcgtgac caaacacgat ctggtcacca gcggcaagaa 2280

ggagaactgc caggaaatag tcaacgacgt gaagaagcac cgcggactgg acatccaggc 2340

aaaaacagtg gactccatcc tgctaaacgg gtgtcgtcgt gccgtggaca tcctatatgt 2400

ggacgaggct ttcgcttgcc attccggtac tctgctagcc ctaattgctc ttgttaaacc 2460

tcggagcaaa gtggtgttat gcggagaccc caagcaatgc ggattcttca atatgatgca 2520

gcttaaggtg aacttcaacc acaacatctg cactgaagta tgtcataaaa gtatatccag 2580

acgttgcacg cgtccagtca cggccatcgt gtctacgttg cactacggag gcaagatgcg 2640

cacgaccaac ccgtgcaaca aacccataat catagacacc acaggacaga ccaagcccaa 2700

gccaggagac atcgtgttaa catgcttccg aggctgggta aagcagctgc agttggacta 2760

ccgtggacac gaagtcatga cagcagcagc atctcagggc ctcacccgca aaggggtata 2820

cgccgtaagg cagaaggtga atgaaaatcc cttgtatgcc cctgcgtcgg agcacgtgaa 2880

tgtactgctg acgcgcactg aggataggct ggtgtggaaa acgctggccg gcgatccctg 2940

gattaaggtc ctatcaaaca ttccacaggg taactttacg gccacattgg aagaatggca 3000

agaagaacac gacaaaataa tgaaggtgat tgaaggaccg gctgcgcctg tggacgcgtt 3060

ccagaacaaa gcgaacgtgt gttgggcgaa aagcctggtg cctgtcctgg acactgccgg 3120

aatcagattg acagcagagg agtggagcac cataattaca gcatttaagg aggacagagc 3180

ttactctcca gtggtggcct tgaatgaaat ttgcaccaag tactatggag ttgacctgga 3240

cagtggcctg ttttctgccc cgaaggtgtc cctgtattac gagaacaacc actgggataa 3300

cagacctggt ggaaggatgt atggattcaa tgccgcaaca gctgccaggc tggaagctag 3360

acataccttc ctgaaggggc agtggcatac gggcaagcag gcagttatcg cagaaagaaa 3420

aatccaaccg ctttctgtgc tggacaatgt aattcctatc aaccgcaggc tgccgcacgc 3480

cctggtggct gagtacaaga cggttaaagg cagtagggtt gagtggctgg tcaataaagt 3540

aagagggtac cacgtcctgc tggtgagtga gtacaacctg gctttgcctc gacgcagggt 3600

cacttggttg tcaccgctga atgtcacagg cgccgatagg tgctacgacc taagtttagg 3660

actgccggct gacgccggca ggttcgactt ggtctttgtg aacattcaca cggaattcag 3720

aatccaccac taccagcagt gtgtcgacca cgccatgaag ctgcagatgc ttgggggaga 3780

tgcgctacga ctgctaaaac ccggcggcag cctcttgatg agagcttacg gatacgccga 3840

taaaatcagc gaagccgttg tttcctcctt aagcagaaag ttctcgtctg caagagtgtt 3900

gcgcccggat tgtgtcacca gcaatacaga agtgttcttg ctgttctcca actttgacaa 3960

cggaaagaga ccctctacgc tacaccagat gaataccaag ctgagtgccg tgtatgccgg 4020

agaagccatg cacacggccg ggtgtgcacc atcctacaga gttaagagag cagacatagc 4080

cacgtgcaca gaagcggctg tggttaacgc agctaacgcc cgtggaactg taggggatgg 4140

cgtatgcagg gccgtggcga agaaatggcc gtcagccttt aagggagaag caacaccagt 4200

gggcacaatt aaaacagtca tgtgcggctc gtaccccgtc atccacgctg tagcgcctaa 4260

tttctctgcc acgactgaag cggaagggga ccgcgaattg gccgctgtct accgggcagt 4320

ggccgccgaa gtaaacagac tgtcactgag cagcgtagcc atcccgctgc tgtccacagg 4380

agtgttcagc ggcggaagag ataggctgca gcaatccctc aaccatctat tcacagcaat 4440

ggacgccacg gacgctgacg tgaccatcta ctgcagagac aaaagttggg agaagaaaat 4500

ccaggaagcc atagacatga ggacggctgt ggagttgctc aatgatgacg tggagctgac 4560

cacagacttg gtgagagtgc acccggacag cagcctggtg ggtcgtaagg gctacagtac 4620

cactgacggg tcgctgtact cgtactttga aggtacgaaa ttcaaccagg ctgctattga 4680

tatggcagag atactgacgt tgtggcccag actgcaagag gcaaacgaac agatatgcct 4740

atacgcgctg ggcgaaacaa tggacaacat cagatccaaa tgtccggtga acgattccga 4800

ttcatcaaca cctcccagga cagtgccctg cctgtgccgc tacgcaatga cagcagaacg 4860

gatcgcccgc cttaggtcac accaagttaa aagcatggtg gtttgctcat cttttcccct 4920

cccgaaatac catgtagatg gggtgcagaa ggtaaagtgc gagaaggttc tcctgttcga 4980

cccgacggta ccttcagtgg ttagtccgcg gaagtatgcc gcatctacga cggaccactc 5040

agatcggtcg ttacgagggt ttgacttgga ctggaccacc gactcgtctt ccactgccag 5100

cgataccatg tcgctaccca gtttgcagtc gtgtgacatc gactcgatct acgagccaat 5160

ggctcccata gtagtgacgg ctgacgtaca ccctgaaccc gcaggcatcg cggacctggc 5220

ggcagatgtg catcctgaac ccgcagacca tgtggacctc gagaacccga ttcctccacc 5280

gcgcccgaag agagctgcat accttgcctc ccgcgcggcg gagcgaccgg tgccggcgcc 5340

gagaaagccg acgcctgccc caaggactgc gtttaggaac aagctgcctt tgacgttcgg 5400

cgactttgac gagcacgagg tcgatgcgtt ggcctccggg attactttcg gagacttcga 5460

cgacgtcctg cgactaggcc gcgcgggtgc atatattttc tcctcggaca ctggcagcgg 5520

acatttacaa caaaaatccg ttaggcagca caatctccag tgcgcacaac tggatgcggt 5580

cgaggaggag aaaatgtacc cgccaaaatt ggatactgag agggagaagc tgttgctgct 5640

gaaaatgcag atgcacccat cggaggctaa taagagtcga taccagtctc gcaaagtgga 5700

gaacatgaaa gccacggtgg tggacaggct cacatcgggg gccagattgt acacgggagc 5760

ggacgtaggc cgcataccaa catacgcggt tcggtacccc cgccccgtgt actcccctac 5820

cgtgatcgaa agattctcaa gccccgatgt agcaatcgca gcgtgcaacg aatacctatc 5880

cagaaattac ccaacagtgg cgtcgtacca gataacagat gaatacgacg catacttgga 5940

catggttgac gggtcggata gttgcttgga cagagcgaca ttctgcccgg cgaagctccg 6000

gtgctacccg aaacatcatg cgtaccacca gccgactgta cgcagtgccg tcccgtcacc 6060

ctttcagaac acactacaga acgtgctagc ggccgccacc aagagaaact gcaacgtcac 6120

gcaaatgcga gaactaccca ccatggactc ggcagtgttc aacgtggagt gcttcaagcg 6180

ctatgcctgc tccggagaat attgggaaga atatgctaaa caacctatcc ggataaccac 6240

tgagaacatc actacctatg tgaccaaatt gaaaggcccg aaagctgctg ccttgttcgc 6300

taagacccac aacttggttc cgctgcagga ggttcccatg gacagattca cggtcgacat 6360

gaaacgagat gtcaaagtca ctccagggac gaaacacaca gaggaaagac ccaaagtcca 6420

ggtaattcaa gcagcggagc cattggcgac cgcttacctg tgcggcatcc acagggaatt 6480

agtaaggaga ctaaatgctg tgttacgccc taacgtgcac acattgtttg atatgtcggc 6540

cgaagacttt gacgcgatca tcgcctctca cttccaccca ggagacccgg ttctagagac 6600

ggacattgca tcattcgaca aaagccagga cgactccttg gctcttacag gtttaatgat 6660

cctcgaagat ctaggggtgg atcagtacct gctggacttg atcgaggcag cctttgggga 6720

aatatccagc tgtcacctac caactggcac gcgcttcaag ttcggagcta tgatgaaatc 6780

gggcatgttt ctgactttgt ttattaacac tgttttgaac atcaccatag caagcagggt 6840

actggagcag agactcactg actccgcctg tgcggccttc atcggcgacg acaacatcgt 6900

tcacggagtg atctccgaca agctgatggc ggagaggtgc gcgtcgtggg tcaacatgga 6960

ggtgaagatc attgacgctg tcatgggcga aaaaccccca tatttttgtg ggggattcat 7020

agtttttgac agcgtcacac agaccgcctg ccgtgtttca gacccactta agcgcctgtt 7080

caagttgggt aagccgctaa cagctgaaga caagcaggac gaagacaggc gacgagcact 7140

gagtgacgag gttagcaagt ggttccggac aggcttgggg gccgaactgg aggtggcact 7200

aacatctagg tatgaggtag agggctgcaa aagtatcctc atagccatgg ccaccttggc 7260

gagggacatt aaggcgttta agaaattgag aggacctgtt atacacctct atggaggacc 7320

ccgtctagta aggtgaatgg cggatgtgtg acatacacga cgccaaaaga ttttgttcca 7380

gctcctgcca cctccgctac gcgagagatt aaccacccac gatggccgcc aaagtgcatg 7440

ttgatattga ggctgacagc ccattcatca agtctttgca gaaggcattt ccgtcgttcg 7500

aggtggagtc attgcaggtc acaccaaatg accatgcaaa tgccagagca ttttcgcacc 7560

tggctaccaa attgatcgag caggagactg acaaagacac actcatcttg gatatcggca 7620

gtgcgccttc caggagaatg atgtcgacat gaaacgagat gtcaaagtca ctccagggac 7680

gaaacacaca gaggaaagac ccaaagtcca ggtaattcaa gcagcggagc cattggcgac 7740

cgcttacctg tgcggcatcc acagggaatt agtaaggaga ctaaatgctg tgttacgccc 7800

taacgtgcac acattgtttg atatgtcggc cgaagacttt gacgcgatca tcgcctctca 7860

cttccaccca ggagacccgg ttctagagac ggacattgca tcattcgaca aaagccagga 7920

cgactccttg gctcttacag gtttaatgat cctcgaagat ctaggggtgg atcagtacct 7980

gctggacttg atcgaggcag cctttgggga aatatccagc tgtcacctac caactggcac 8040

gcgcttcaag ttcggagcta tgatgaaatc gggcatgttt ctgactttgt ttattaacac 8100

tgttttgaac atcaccatag caagcagggt actggagcag agactcactg actccgcctg 8160

tgcggccttc atcggcgacg acaacatcgt tcacggagtg atctccgaca agctgatggc 8220

ggagaggtgc gcgtcgtggg tcaacatgga ggtgaagatc attgacgctg tcatgggcga 8280

aaaaccccca tatttttgtg ggggattcat agtttttgac agcgtcacac agaccgcctg 8340

ccgtgtttca gacccactta agcgcctgtt caagttgggt aagccgctaa cagctgaaga 8400

caagcaggac gaagacaggc gacgagcact gagtgacgag gttagcaagt ggttccggac 8460

aggcttgggg gccgaactgg aggtggcact aacatctagg tatgaggtag agggctgcaa 8520

aagtatcctc atagccatgg ccaccttggc gagggacatt aaggcgttta agaaattgag 8580

aggacctgtt atacacctct acggcggtcc tagattggtg cgttaataca cagaattctg 8640

attatagcgc actattatag caccatcgat atgcatttat aaggatcccc taggcgatcg 8700

gttagggtag gcaatggcat tgatatagca agaaaattga aaacagaaaa agttagggta 8760

agcaatggca tataaccata actgtataac ttgtaacaaa gcgcaacaag acctgcgcaa 8820

ttggccccgt ggtccgcctc acggaaactc ggggcaactc atattgacac attaattggc 8880

aataattgga agcttacata agcttaattc gacgaataat tggattttta ttttattttg 8940

caattggttt ttaatatttc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 9000

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 9060

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