具体实施方式

为让本领域的技术人员更加清晰直观地了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。

实施例1干扰素刺激基因ISG四环素诱导稳定过表达细胞系的建立和鉴定

(1)SARS-CoV-2假病毒感染靶细胞模型—ISG四环素诱导过表达细胞系建立

将ISG防御分子基因序列克隆至诱导表达载体pcDNA^TM 5/FRT/TO expressionvector，利用人胚肾293细胞系(Flp-In^TM T-REx^TM-293)建立Flp-In T-REx-293-ISG四环素诱导表达细胞系，利用四环素诱导蛋白的表达。通过控制四环素浓度，可间接调控其表达水平。该ISG防御分子被四环素诱导表达的同时，瞬时转染SARS-CoV-2感染受体hACE2分子，从而构建出稳定可靠的感染靶细胞模型。(具体方法在下文实施例中详细说明)

(2)ISG防御分子诱导表达系统的鉴定

利用上述建好的Flp-In T-REx-293-ISG四环素诱导表达细胞系，在四环素诱导24h后，裂解细胞提取总蛋白，通过Western Bloting法鉴定ISG防御分子的表达情况。

实施例2 SARS-CoV-2 S蛋白表达质粒的构建及假病毒的包装与体外感染模型的建立(如图2所示)

(1)S蛋白表达质粒的构建

SARS-CoV-2(MN908947)C末端缺失19个氨基酸的S蛋白在不改变氨基酸序列的前提下，进行密码子优化，克隆至pSecTag2/HygroA载体中，转化、扩增、纯化回收。(2)SARS-CoV-2假病毒的包装

包含S蛋白的真核表达质粒通过与Env缺失的、带有荧光素酶报告基因的骨架质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染293T细胞，获得重组假病毒。(具体方法在下文实施例中详细说明)

(3)建立SARS-CoV-2假病毒体外感染模型

ISG防御分子诱导表达细胞系接种至6孔板，12h后转染hACE2，使得细胞在转染时丰度约80％。转染hACE2受体分子24h后，将其接种至96孔细胞培养板，次日，利用四环素诱导防御分子表达，四环素(终浓度1μg/mL)，诱导24h后，感染SARS-CoV-2假病毒颗粒，感染后48-72h检测细胞的荧光素酶活性。

实施例3防御分子LY6E诱导过表达细胞系T Rex 293-LY6E的建立和鉴定(1)建立Flp-In T-REx-293-LY6E四环素诱导表达细胞系

1.准备Flp-In^TM T-REx^TM-293细胞。

复苏一盘状态良好的Flp-In^TM T-REx^TM-293，接种于10cm细胞培养皿，待细胞长满后，使用12mL PBS润洗一遍，去掉残存培养基血清，用1mL 0.05％胰蛋白酶消化Flp-In^TM T-REx^TM-293细胞3-5分钟，用12mL体系的含10％FBS的高糖培养基DMEM重悬细胞，按4～8×10⁵/cm²的密度接种于六孔板中，补充含10％FBS的新鲜DMEM培养基，使其终体积为2mL。放置37℃，5％CO₂细胞孵育箱中过夜培养。

2.转染。

第二天，待细胞密度达到80％-90％时，采用Lipofectamine 2000转染试剂盒的转染方法共转染LY6E/pcDNA^TM 5/FRT/TO expression vector质粒和pOG44质粒，同时共转染CAT/pcDNA^TM 5/FRT/TO expression vector质粒和pOG44质粒作为阴性对照。6-8小时后，补充2mL含10％FBS的新鲜DMEM培养基。

3.分传10cm细胞培养皿。

转染24h后，用0.5mL 0.05％胰蛋白酶消化六孔板中细胞3-5分钟，用1mL含10％FBS的新鲜DMEM培养基中和重悬细胞。并将其接种至直径100mm的大皿中继续培养，补充新鲜培养基至12mL。

待细胞贴壁24h后，吸去大皿中的培养基，并加入12mL选择性培养基(含10％FBS、250μg/mL hygromycin B，及10μg/mL blasticidin的DMEM高糖培养基)。每隔三天更换一次选择性培养基，密切关注细胞状态，大约5-6天后，细胞开始死亡，大约2-3周后，有明显克隆细胞团块在有抗生素的选择培养基中稳定生长，LY6E/pcDNA^TM 5/FRT/TO及CAT/pcDNA^TM 5/FRT/TO诱导表达细胞株基本建成，待细胞长满后，传代或-80℃冰箱冻存细胞。

(2)Western bloting实验检测目的蛋白LY6E的表达。

1.复苏细胞：复苏状态良好的LY6E/pcDNA^TM 5/FRT/TO及CAT/pcDNA^TM 5/FRT/TO诱导表达细胞株，接种在10cm细胞培养皿，置于37℃培养箱中过夜培养。

2.分12孔板：将10cm细胞培养皿的LY6E/pcDNA^TM 5/FRT/TO及CAT/pcDNA^TM 5/FRT/TO诱导表达细胞株，用12mL PBS润洗细胞，洗去残存培养基和血清，使用1.5mL 0.05％的胰蛋白酶消化3-5分钟，按密度接种于12孔板中，补充新鲜的含10％FBS的高糖培养基DMEM至体积1mL，置于37℃培养箱中过夜培养。

3.TET四环素诱导：需要1μg/mL TET诱导24h，首先配置3μg/mL TET溶液，加入50μl浓度为3μg/mL TET溶液于12孔板中，最终使其工作浓度为1μg/mL TET。

4.收蛋白：a)诱导24h后，吸去培养基，PBS缓冲液洗涤3次，最后一次将PBS吸净。b)每孔加入300μL 2×SDS(1％SDS，2.5％β-巯基乙醇，0.001％溴甲酚蓝，5％甘油，0.25mmol/L Tris HCl，pH6.8)，置于摇床上80rpm室温摇晃15min。c)待细胞充分裂解后，用微量移液器吹打混匀，移至洁净的1.5mLEP管中。d)100℃煮沸10min，使蛋白变性。e)离心：14680r/min离心5min(离心半径r＝8.4cm)。吸取上清，即为细胞总蛋白(已变性)。

5.Western bloting：a)配置1×MOPS电泳液(若电泳小分子蛋白，采用MES缓冲液)，并按说明书组装电泳装置。b)电泳：取15μL上述变性蛋白样品及6μL蛋白Marker按照预定顺序进行上样。然后设置80V恒压电泳，待指示剂溴酚蓝跑至预制胶底部时，停止电泳。c)转膜(湿转)。①按照转膜液配方配置转膜液。②裁切预制胶。取出电泳后的预制胶，根据目的蛋白所在的范围，按需裁切，置于1×转膜液中平衡，同时浸泡转膜过程中所需的海绵、滤纸等。③活化PVDF膜。将裁剪好的与待转胶相匹配的PVDF膜置于无水甲醇中浸泡15s，然后置于1×转膜液中浸泡2min，洗去膜上残存甲醇。④组装。准备1×转膜液，将转膜夹的负极面放置其中，并按照“转膜夹负极面-海绵-滤纸-预制胶-PVDF膜-滤纸-海绵-转膜夹正极面”的顺序组装，注意避免PVDF膜和预制胶的干燥，且每层之间要排除气泡。闭合转膜夹，按其正确的电极顺序放入转膜槽中，加入1×转膜液，使其没过转膜夹顶部。⑤转膜。将上述转膜槽置于冰盒上，恒流350mA,转膜1h30 min。d)封闭。提前配置好封闭液(含5％脱脂牛奶的TBS溶液)，然后将已经可以清晰观察到蛋白Marker条带的PVDF膜取出转移到封闭液中。放置室温摇床上摇1h。e)孵育一抗。使用一抗稀释液将兔来源的anti-LY6E抗体按照1:200的比例进行稀释，和鼠来源的anti-βactin抗体按照1:2000的比例进行稀释，将封闭后的PVDF膜转至其中，置于4℃摇床过夜孵育，为了重复使用一抗，将封闭后的PVDF膜用TBS洗3遍，每遍5分钟，去除残存脱脂牛奶后再孵育一抗。f)洗膜。回收一抗，使用1×TBST进行洗膜，洗3次，5min/次。g)孵育二抗。根据一抗种属来源选择相应的800cm二抗。使用封闭液将其按照1:10000的比例进行稀释。将PVDF膜转移至其中，室温摇床上避光孵育1h。h)洗膜。回收二抗，使用TBST进行洗膜，洗3次，5min/次。最后将其浸泡在1×TBS中。i)置于奥德赛近红外扫描成像仪中采图(结果如图1所示)。

实施例4基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白的假病毒颗粒的包装以及感染模型的建立

(1)S蛋白表达质粒的构建

对SARS-CoV-2(MN908947)S蛋白C末端去掉19个氨基酸，在不改变氨基酸序列的前提下，进行密码子优化，克隆至pSecTag2/Hygro A载体，转化、扩增、纯化回收。

(2)包含S蛋白的假病毒的包装

包含S蛋白的真核表达质粒通过与Env缺失的、带有荧光素酶报告基因的骨架质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染293T细胞，获得重组假病毒。

以5×10⁶个293T细胞接种10cm细胞培养皿，过夜培养后汇合度达到80％。

将包含S蛋白的表达质粒2.5μg和骨架质粒pNL4-3.Luc.R-E-7.5μg按照1：3(w/w)的比例加入含有500μL无抗生素无血清DMEM的1.5mL离心管中混匀。

加入30μL FuGENE HD(DNA与转染试剂1:3，w/v)，混匀后室温静置15-30min。将质粒-转染试剂混合液全部逐滴加入10cm细胞培养皿中，轻摇混匀。置于37℃，CO₂培养箱培养。

培养48-72h后收获包含假病毒的培养上清，补加FBS至终浓度达到20％。使用0.45μm滤器过滤病毒液，分装后冻存于-80℃冰箱保存备用。

(3)建立SARS-CoV-2假病毒体外感染模型

a)复苏细胞和分传六孔板。

复苏状态良好的LY6E/pcDNA^TM 5/FRT/TO及CAT/pcDNA^TM 5/FRT/TO诱导表达细胞系，接种于10cm细胞培养皿，接种前用8-10mL胶原平衡一下细胞培养皿，有利于细胞贴壁和舒展地生长。待10cm细胞培养皿的细胞生长密度约90％时，用10mL含钙、镁的PBS缓冲液润洗一遍细胞，目的为了去除残存血清和其他培养基成分利于胰蛋白酶的消化，加入1.5mL胰蛋白酶，放置37℃，5％CO₂细胞恒温孵育箱消化3-5分钟后，用12mL体系的含10％FBS的新鲜DMEM培养基重悬细胞，并按4-8×10⁵/cm²密度接种要求，接种LY6E/pcDNA^TM 5/FRT/TO及CAT/pcDNA^TM 5/FRT/TO诱导表达细胞系至六孔板，使其第二天达到转染密度要求，密度约80％-90％，放置于37℃，5％CO₂细胞恒温孵育箱中过夜培养。

b)转染ACE2受体、DPP4受体和APN受体。

第二天,待六孔板中的细胞密度达到80％-90％时，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书的要求转染ACE2/pcDNA3.1质粒、DPP4/pcDNA3.1质粒和APN/pcDNA3.1质粒，同时转染pcDNA3.1空载体质粒作为阴性对照。转染6～8h后，补充含10％FBS的新鲜DMEM培养基2mL。

c)分传96孔板。

转染24h后，用1mL PBS洗一遍细胞，去掉残存血清和其他培养基成分，用0.5mL胰蛋白酶，放置37℃，5％CO₂细胞恒温孵育箱消化3-5分钟后，用1mL含10％FBS的新鲜DMEM培养基重悬细胞，将细胞悬液加入至15mL无菌离心管中，补充10％FBS的新鲜DMEM培养基9.5mL，配成12mL体系，轻轻吹匀5-6次，每孔100μL接种至96孔黑色细胞培养板中，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中过夜培养。

d)感染假病毒。

待96孔板中的细胞密度达到90％时，甩板，弃去培养基，将要感染的假病毒原液与含10％FBS的新鲜DMEM培养基按照1：1稀释，吹混匀后，100μL每孔加入相应96孔板中。感染24小时后，每孔补入100μL含10％FBS的新鲜DMEM培养基。

e)检测荧光素酶活性。

感染48小时后，甩板，弃掉96孔板中的病毒液。按照荧光素酶报告基因检测试剂盒的说明书要求，每孔加入细胞裂解液30μL，置于室温摇床上摇15min，待细胞充分裂解，每孔加入50μL荧光素酶底物，混匀后迅速置于荧光素发光仪上读数。本实验以所测得的荧光素酶活性代表假病毒侵入细胞的能力(结果如图4所示)。

结果说明：

本研究利用上述方法建立的四环素诱导稳定表达细胞系Flp-In T-REx293-LY6E，结合HIV/Luc(NL4-3 R-E-Luc)报告基因载体包装假病毒颗粒技术构建的SARS-CoV-2假病毒感染系统，已经成功地筛选鉴定出抵抗SARS-CoV-2入侵的重要限制性因子LY6E。以LY6E数据为例展示如下：通过免疫印迹实验验证LY6E蛋白在不同浓度四环素(Tet)诱导下均可在建立的Flp-In T-REx293-LY6E诱导表达细胞系中稳定表达(图3左)。并且，通过检测荧光素酶报告基因的表达量以实现病毒的定量检测，可以有效评价LY6E对SARS-CoV-2感染的抑制率达到70％，对MERS-CoV、HCoV-229E和HCoV-NL63的抑制率高达80％以上，对HCoV-OC43感染抑制率甚至高达90％以上(图3右)。因此，本研究所发明的以建立稳定过表达细胞系为基础，与假病毒感染系统相结合为一体的技术平台，可以高效的筛选鉴定宿主细胞抵抗新冠病毒侵入的防御分子并评估其防御功能水平。

上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。