一种基因编辑新冠疫苗载体的制备方法
阅读说明：本技术 一种基因编辑新冠疫苗载体的制备方法 (Preparation method of gene editing new corona vaccine vector ) 是由 翁炳焕 于 2020-11-22 设计创作，主要内容包括：一种基因编辑新冠疫苗载体的制备方法,其特征在于,以新冠病毒易感受体ACE2基因编辑、SV40LT和/或hTERT基因转染的方法将原本弃用的产前诊断后剩余羊水细胞、新生儿脐血、脐带、胎盘等组织细胞改造为兼具干细胞天然治疗功能、无限传代的永生化功能、新冠病毒ACE2受体缺失特性的可再生利用的新冠疫苗载体,专用于制备个体化治疗COVID-19的疫苗,可按姓名、ABO血型或HLA分型长期预存于-196℃干细胞库,当新冠病毒传染病流行或某个体需要使用时,可选择自身或同型的基因编辑永生干细胞系传代扩增后进行干细胞治疗或疫苗制备,以消除、减少传统干细胞治疗和疫苗使用中的免疫排斥反应。(A method for preparing a gene editing new crown vaccine vector is characterized in that tissue cells such as remaining amniotic fluid cells after prenatal diagnosis, newborn umbilical blood, umbilical cord, placenta and the like which are abandoned originally are transformed into a renewable new crown vaccine vector which has the natural treatment function of stem cells, the immortalization function of infinite passage and the deletion characteristic of a new crown virus ACE2 receptor by a method of gene editing of a new crown virus susceptible receptor ACE2 gene and transfection of SV40LT and/or hTERT gene, and is specially used for preparing a vaccine for individualized treatment of COVID-19, can be pre-stored in a stem cell bank at the temperature of 196 ℃ below zero for a long time according to the name, ABO blood type or HLA type, when a new coronavirus infectious disease is epidemic or a certain body needs to be used, the self or homotypic gene editing immortalized stem cell line can be selected for carrying out stem cell therapy or vaccine preparation after passage expansion so as to eliminate and reduce the immunological rejection reaction in the traditional stem cell therapy and vaccine use.)
技术领域
本发明涉及一种基因编辑新冠疫苗载体的制备方法，属生物医学领域的传染病防治技术。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)已对全球公众健康构成严重威胁。SARS-CoV-2的主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)。其中S蛋白在感染过程中被宿主蛋白酶切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，S1亚基由N端的结构域(S1-NTD)和受体结合域(S1-RBD)组成，S1-RBD负责识别并结合宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2)，S2亚基介导病毒包膜和宿主细胞膜之间的融合，使病毒进入细胞引起感染。N蛋白为RNA合成所必需，在病毒组装和RNA转录中起着至关重要的作用，同时也参与宿主细胞对病毒感染的反应。M和E蛋白在病毒装配中起重要作用。
目前的新冠病毒疫苗主要以S蛋白或其RBD为靶点设计开发。在新冠病毒载体疫苗的制备中，人腺病毒5型(Ad5)是应用最广泛的病毒载体。人腺病毒含有26-45kb的双链线性DNA基因组，基因组中含有4个早期转录基因区(E1-E4)和1个晚期转录基因区，两端各有1段约100bp的反向未端重复序列(ITR)。第一代腺病毒载体删除了E1和E3区基因，第二代腺病毒载体删除了E1-E4区基因，Ad5为第三代腺病毒载体，删除了所有病毒编码基因，仅保留5’和3’端ITR及包装信号，可容纳36kb外源基因。虽然Ad5的细胞毒性和免疫源性减弱，外源基因表达时效提高，可感染的细胞多而应用广，但易引起非特异性感染而不适用于靶向治疗，临床应用中易产生副作用。Ad5不与宿主细胞DNA整合，虽较安全但使目的基因表达不稳定，进入宿主细胞后易被网状内皮细胞吞噬而失去作用。同时由于Ad5无法复制，会使体内重组病毒越来越少，所以不适用于临床慢性疾病的长期治疗。Ad5本质为病毒，仍具有免疫源性和细胞毒性，宿主对病毒载体的免疫应答会干扰对目的抗原的免疫应答，大多数正常人已受过腺病毒感染，对病毒载体的预存免疫也会干扰疫苗的免疫效果。
目前用于临床治疗的干细胞，国内外主要聚焦在间充质干细胞(MSCs)和自然杀伤细胞(NK)，其中应用最多的是MSCs。MSCs来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，能迁移到损伤的确切部位，定向分化为肺组织细胞和毛细血管内皮细胞等多种细胞系，产生多种细胞因子和分泌大量的含有miRNA的外泌体、囊泡，通过影响PI3K/AKT、NF-КB等信号通路来治疗肺损伤，通过调节免疫、抗纤维化、抑制炎性因子风暴等机制修复受损器官。干细胞具有非常强的抗病毒能力，能在病毒感染局部幸存并发挥作用，已初步表明MSCs在重症新冠肺炎治疗中的安全性和有效性，具有良好的临床应用前景。但尚未见以进一步改造的干细胞取代腺病毒载体制备新冠病毒载体疫苗的文献报道。
通常间充质干细胞在体外传代至15-30代就会出现衰老或死亡，而经猿猴病毒40大T抗原基因(SV40LT)转染的细胞系可在体外培养350代以上，并能基本保留原始细胞的分化表型和生物学特性，已广泛应用于人源性肝细胞、血管纹边缘细胞、软骨干细胞等的永生化。这为干细胞体外培养寿命的改良和产业化扩增提供了依据。文献报道，SARS-CoV能在ACE2转染的293T细胞中复制，但不能在模拟转染的293T细胞中复制。目前报道SARS-CoV-2也通过ACE2受体感染宿主细胞，所以本发明通过基因编辑技术将干细胞中的ACE2基因敲除。
发明内容
基于目前治疗用干细胞和传统疫苗载体的问题，本发明人提出了本发明。
本发明的目的是要提供一种敲除新冠病毒易感基因hACE2、转染永生化基因hTERT和/或SV40LT的基因编辑新冠疫苗载体，所述基因编辑新冠疫苗载体具有干细胞天然治疗功能、无限传代功能和新冠病毒感染受体hACE2缺失特性。
本发明的目的通过以下技术方案实施：
首先，获得间充质干细胞。例如，从产前诊断后剩余的样本中分离羊水成纤维细胞，制备所需的干细胞；或从干细胞样本库中获得间充质干细胞，诱导所需的干细胞。
进而，给干细胞装配永生化基因。例如，构建携带hTERT和/或SV40LT的重组载体，转染干细胞，使干细胞DNA整合上hTERT和/或SV40LT基因，从而获得能永久生存、无限传代的永生化干细胞系，可再经鉴定或诱导获得肺干细胞系。
进而，基因编辑干细胞的hACE2基因。例如，从GenBank检索人ACE2核酸序列，下载其FASTA文件，进入www.genome-engeering.org，上传文件并筛选出评分较高的单导向RNA(sgRNA)序列，在每条sgRNA序列F链5’端添加CACC序列，R链5’端添加AAAC序列，与pX330质粒经Fast Diget Bbs I酶切后的粘性末端互补，合成sgRNA寡链核苷酸(oligo)序列，以T4连接酶将双链sgRNA与pX330载体进行连接，然后转染干细胞，以敲除hACE2基因。
进而，制成一种敲除hACE2基因、装配永生化基因的基因编辑干细胞系。
进而，将基因编辑干细胞系作为新冠病毒疫苗载体，替换现有技术的腺病毒载体，制备干细胞载体疫苗。例如，根据GenBank分析SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸序列(RBD氨基酸为Gly319～Asn541)，采用氨基酸密码子同义置换，合成RBD肽段对应核酸的全基因(序列两端分别插入HindIII和Xho I的酶切位点)，将合成的RBD基因构建重组质粒(pGC-FU-RBD)，将重组质粒和包装质粒共转染293FT细胞，包装携带RBD的慢病毒，将慢病毒转染基因编辑干细胞，使干细胞DNA整合上RBD，以获得能表达RBD蛋白和抗体的干细胞载体疫苗。
本发明的有益效果在于：
本发明将原本弃用的组织细胞改造为一种基因编辑新冠疫苗载体，用于替换传统的腺病毒载体，应用于制备新型冠状病毒的干细胞载体疫苗。
本发明因装配了永生化基因(SV40LT和/或hTERT)而解决了超低温永久保存问题、可再生利用问题、需无限扩增的商业化问题。
本发明因敲除hACE2基因而使新冠病毒难以通过hACE2受体感染干细胞，从而增强了干细胞对新冠病毒的抗感染能力。
敲除ACE2基因的基因编辑新冠疫苗载体可抵抗病毒进入干细胞内，可以替换具有免疫原性的腺病毒载体、可以选用与患者同型的疫苗载体，外源基因不进入宿主细胞内，所以用本发明的疫苗载体制备的疫苗使用较安全，而且还具有干细胞自身治疗的作用。
附图说明
图1是本发明所述的以G418和嘌呤霉素筛选得到的永生化干细胞克隆示意图。
图2是本发明所述的被SV40LT和hTERT转染的永生化干细胞克隆的传代培养示意图。
图3是本发明所述的被SV40LT和hTERT转染的永生化干细胞与分离的新冠病毒共培养72小时的细胞生长状态示意图。
图4是本发明ACE2基因敲除的基因编辑永生干细胞系与分离的新冠病毒共培养72小时的细胞生长状态示意图。
在图1中，因被SV40LT和hTERT转染的永生化细胞不会被G418和嘌呤霉素杀死而存活，存活的单个细胞生长后形成细胞克隆。
在图2中，被SV40LT和hTERT转染的细胞在传代中呈梭形贴壁生长，生长旺盛。
在图3中，细胞呈圆形、漂浮、死亡状态，说明病毒在细胞内繁殖、致细胞较快死亡。
在图4中，细胞仍呈梭形贴壁生长，说明敲除ACE2基因的基因编辑永生干细胞系对新冠病毒具有较强的抵抗力。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方法作详细的描述，但这些范例性的描述并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
1.间充质干细胞的采集
1.1.羊水间充质干细胞的采集
从各单位日常产前诊断后剩余的羊水细胞中分离间充质干细胞。羊水细胞为约19孕周胎儿的呼吸系统、消化系统等组织的脱落细胞，富含肺间充质干细胞和ips细胞。这些细胞经进一步的永生化后，寿命和活力更好，可制备成本发明的肺干细胞系。
具体方法如下：按各单位日常产前诊断流程采集待检孕妇的羊水细胞，进行常规细胞培养、实验诊断和结果报告。继续培养诊断结果为正常的剩余的羊水细胞，在倒置显微镜下筛选出梭形贴壁生长的成纤维羊水细胞或羊水间充质干细胞。
1.2.脐带间充质干细胞的采集
从液氮罐中取出冻存的脐带，置37℃水浴快速解冻，以无菌PBS清洗，去除残留的血迹，将脐带剪成大小约1mm3的组织块，置于铺有胎牛血清的培养皿中，在37℃放置6h后，加入10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃5％CO2培养箱中培养，3d后换液，1周后再次换液，此后每隔3d换液，观察贴壁组织周围的细胞生长情况，当细胞达到80％-90％融合度时，用胰酶消化传代，并将组织转移到新的培养瓶中，继续培养，获得间充质干细胞。
1.3.肺间充质干细胞的采集
无菌取流产胎儿肺脏组织，机械离散，0.25％胰蛋白酶消化后，用孔径为100um的纱布过滤，1 000r/min离心5min，弃上清液，添加DMEM培养液(0.1umolβ-巯基乙醇，100UI/mL青链霉素，10％胎牛血清)。在37℃、5％CO2条件下培养。45min后换液，以去除尚未贴壁的细胞，后每48h换液。待细胞汇合度达80％后，0.25％胰蛋白酶消化传代。
1.4.干细胞诱导
参照有关文献，将羊水细胞、羊膜组织细胞、骨髓细胞、脐带血细胞、脐带组织或胎盘组织细胞诱导为所需的干细胞。
2.间充质干细胞的永生化性能改良
本发明将有限寿命的干细胞改良为无限传代的干细胞系，以体外产业化扩增干细胞。
2.1.SV40LT/pLXSN的构建
以SV40 DNA(strain 766)为模板，上游引物为5’-GCCCAGGATCCTTAACAACAACAACAAT-3’，下游引物为5’-ACGCTGAATTCCCTCTGAGCTAT-3’，进行SV40 LT高保真长片段的PCR扩增；SV40 LT的PCR产物与pLXSN反转录病毒载体均经EcoR I/BamH I酶切、连接、转化、筛选和测序验证，获得含SV40LT/pLXSN重组反转录病毒载体。
2.2.hTERT/pLPCX的构建
用EcoR I酶切PIRES2-EGFP-hTERT质粒得到hTERT cDNA片段，去磷酸化后亚克隆到pLPCX反转录病毒载体EcoR I位点，用T4DNA连接酶置22℃条件下连接，转化至感受态E.coliDH5-alpha大肠埃希氏菌，37℃培养过夜，挑选无色菌落接种，纯化重组质粒，经酶切和测序鉴定后，扩大培养含hTERT的大肠埃希氏菌，用Endotoxin-Free的质粒纯化pLPCX-hTERT重组克隆。
2.3.永生干细胞系的建立
将待转染的间充质细胞配成约8×105个细胞浓度接种，置5％CO2和37℃培养，24h后用含SV40LT基因的重组逆转录病毒感染(Polybrene浓度为8ug/mL)，1周后用500ug/mL的G418筛选4周，待细胞克隆出现后，再用含hTERT基因的重组逆转录病毒感染(Polybrene浓度为8ug/mL)，1周后用2ug/mL的嘌呤霉素筛选，挑取细胞克隆接种于6孔板，扩大培养。筛选的细胞克隆和传代培养细胞分别见图1和图2。
2.4.永生干细胞系的鉴定
细胞系生物学特性：①细胞系为梭形、成纤维状。②Western检测可见分别在相对分子质量为120000和93000处出现白色条带。③细胞系的生长曲线呈典型的“S”生长特征。④细胞系的染色体核型为二倍体。⑤细胞系不能在软琼脂中生长。⑥裸鼠致瘤试验结果呈阴性。
细胞系永生性试验：本发明从产前诊断后剩余的羊水细胞中分离间充质干细胞，经SV40LT基因转染后获得永生化细胞，已在体外传代至35代，未见细胞衰老现象。
干细胞性质鉴定：用流式细胞仪检测细胞膜表面分子，检测的阳性分子包括CD73-APC、CD90-FITC、CD44-PE、CD105-Cy5.5，阴性分子包括CD11b-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE。通过鉴定，获得能在体外永久传代、无限扩增的永生化间充质干细胞系。
肺干细胞系鉴定：包括①相差显微镜观察，呈梭形生长，排列成漩涡或栏栅状。②流式细胞仪检测细胞表面标志物CD45、CD11a、CD14、CD90、CD34、CD71、CD25、CD105、CD117、CD166和CD44，结果为阳性。③共聚焦技术检测为角蛋白表达呈阴性，四个干性相关因子(c-Myc、Oct4、Nanog和Nestin)呈阳性；④间接免疫荧光检测示波形蛋白、III型胶原、纤维连接蛋白表达呈阳性，而表面活性蛋白C前体、血管性血友病因子。
3.永生干细胞系的hACE2基因编辑
3.1.用于hACE2基因编辑的CRISPR-Cas9质粒构建
3.1.1.sgRNA序列设计与合成
从GenBank检索人ACE2核酸序列，下载其FASTA文件，进入www.genome- engeering.org，上传文件并筛选出3组评分较高的单导向RNA(single guide RNA，sgRNA)序列(分别命名为oligo1，oligo2，oligo3，表1)。为了与pX330(pHBLV-U6-gRNA-EF1-cas9-PURO)质粒经Fast Diget Bbs I酶切后的粘性末端形成互补，在每条sgRNA序列F链5’端添加CACC序列，R链5’端添加AAAC序列(如果F链5’端第1个碱基不是G，则在5’端CACC后面添加1个碱基G，相应的在5’端AAAC后面添加1个碱基C)。sgRNA寡链核苷酸(oligo)序列送公司合成。
表1 用于编辑hACE2基因的sgRNA序列
3.1.2.sgRNA退火形成互补双链
分别将合成的单链oligo1、oligo2、oligo3溶解，等比例混合互补链，于PCR扩增仪95℃退火5min；自然降至室温，形成用于敲除靶基因的互补双链。
3.1.3.酶切验证和胶回收质粒
以Fast Diget Bbs I酶切pX330和上述互补双链(37℃，1～16h)，使其线性化。以1％琼脂糖凝胶电泳进行pX330质粒的酶切验证。对酶切后的pX330进行回收，获得具有粘性未端的质粒。以超微量核酸蛋白测定仪(ND-2000，Thermo，美国)检测质粒浓度。
3.1.4.px330与编辑序列的连接及产物转化
以T4连接酶将线性化的pX330载体分别与双链sgRNA(oligo1，oligo2，oligo3)进行连接(37℃，16h)，获得3个重组质粒，分别命名为pX330-ACE2-1、pX330-ACE2-2、pX330-ACE2-3。
将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。取100μL菌液涂布于含Amp的LB固体培养板，37℃过夜培养。次日挑取培养板上的单克隆菌落，转入新鲜的含Amp的LB液体培养基，37℃振摇12h，作为菌种于4℃保存。
3.1.5.细菌扩增及质粒提取
连接成功的产物具有Amp抗性，挑取单菌落进行培养，菌种保存于4℃冰箱；取100μL扩大培养，按照无内毒素质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取并测序。测序正确的质粒用于转染永生化干细胞系。
3.2.制备hACE2基因编辑干细胞系(hACE2基因敲除干细胞系)
3.2.1.永生干细胞系的质粒转染
按照Lipo3000操作手册，首先将Lipo3000转染试剂与Opti-MEM混合、重组质粒pX330-ACE2-1/2/3分别与Opti-MEM混合，室温孵育3min；然后混合上述2组混合物，室温孵育5min。将(永生化)干细胞接种于6孔板，待细胞生长至60％融合时，加入上述混合物。6h后换液，进行正常培养，48h后进行细胞消化与传代，接种于有玻片和无玻片的6孔板。待无玻片6孔板中的细胞长满后，提取细胞总蛋白用于Western blot检测；待有玻片6孔板中的细胞生长至40％融合时，将细胞固定，用于免疫荧光染色。
3.2.2.干细胞系ACE2基因编辑效果鉴定
Western blot检测：对于对照和转染pX330-ACE2-1/2/3的干细胞，以RIPA裂解细胞并提取总蛋白。以GAPDH作为内参，进行常规Western blot检测，比较未敲除和敲除干细胞的ACE2蛋白表达差异。
免疫荧光染色：对培养于6孔板中玻片上的对照和转染pX330-ACE2-1/2/3的干细胞，通过免疫荧光染色观察ACE2的分布，具体方法参照有关文献。
4.ACE2基因编辑干细胞的抗病毒功能检测
4.1.体外抗病毒功能检测
4.1.1.样本采集
取COVID-19确诊患者的咽拭，按100∶1的比例加入双抗(10000IU的青霉素和10000μg的链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100IU和100μg，置4℃过夜，备用。
4.1.2.病毒培养和分离
将Vero-E6接种至含(10％胎牛血清)DMEM培养液的12.5cm2培养瓶中，置36℃、5％CO2培养箱中培养成30％汇合度的单层细胞，吸去培养液，用DMEM清洗细胞2遍，然后在培养瓶中加入0.5mL经过双抗处理的COVID-19患者样本，置36℃、5％CO2培养箱中吸附90min后，吸去样本，加入3.5mL DMEM培养液(10％胎牛血清)，每天观察细胞病变效应(CPE)，经培养5～7d后，取病变细胞上清液蔗糖梯度超速离心，分离新冠病毒，用培养液配成103～105TCID50/ml病毒液(同时用于后述的动物试验)。
4.1.3.hACE2基因编辑干细胞与病毒共培养
设立(hACE2)基因编辑干细胞组、永生干细胞系组和空载体转染干细胞组，每组接种12孔板，使每孔含有2×105个细胞、2mL DMEM培养液(10％胎牛血清)，置36℃、5％CO2培养箱中培养至30％汇合度时，每孔各加病毒液0.5mL，然后分别于培养1、6、24、72小时后每组各取3孔的上清液，混合后以1∶4、1∶12、1∶36、1∶108、1∶324、1∶972、1∶2916、1∶8748倍稀释，进行RT-PCR检测。
4.1.4.实时荧光RT-PCR检测病毒RNA
核酸提取试剂盒(批号：2019004)、2019新型冠状病毒(ORF1ab/N)核酸检测试剂盒(批号：20200123)和DA3200核酸提取仪，购自中山大学达安基因股份有限公司，ABI 7500型PCR仪器购自美国Thermo Fisher Scientific。按试剂盒说明书操作，扩增反应条件为：50℃15min；95℃15min；94℃15s；55℃45s；共45个循环，在55℃采集荧光信号。
根据试剂盒说明，结果判断标准如下：①如果检测样本在ORF1ab和N基因通道无扩增曲线或Ct值＞38，判为SARS-CoV-2阴性；②如果检测样品在ORF1ab和N基因通道Ct值≤38，且有明显的扩增曲线，判为SARS-CoV-2阳性；③如果检测样品在ORF1ab或者N基因通道Ct值≤38，另一通道无扩增曲线，复检结果与原来结果一致，判为SARS-CoV-2阳性。
4.1.5.病毒RNA检测结果
检测结果见表2～7。如表2所示，基因编辑干细胞组、永生干细胞系组和空载体转染干细胞组分别培养1小时的培养液RNA检测结果的阳性滴度均为1∶4，被认为是外源加入病毒含量。如表3～7所示，上述3组干细胞分别培养6、24、72h后，其培养液及干细胞内病毒RNA检测结果的阳性滴度随着培养时间的延长而增高，当培养时间为72h时，其阳性滴度分别为1∶12、1∶972、1∶972，其中基因编辑干细胞组与另外2组均有显著性差异(p＜0.01)，表明hACE2基因编辑能增强干细胞的抗病毒能力。
表2 干细胞与分离的新冠病毒共培养1小时培养液中病毒RNA检测结果
表3 干细胞与分离的新冠病毒共培养6小时的培养液病毒RNA检测结果
表4 干细胞与分离的新冠病毒共培养6小时的细胞内病毒RNA检测结果
表5 干细胞与分离的新冠病毒共培养24小时培养液的病毒RNA检测结果
表6 干细胞与分离的新冠病毒共培养72小时培养液的病毒RNA检测结果
表7 干细胞与分离的新冠病毒共培养72小时的细胞内病毒RNA检测结果
4.2.基因编辑干细胞与病毒共培养的生长特点
未作基因编辑的永生化干细胞与分离的病毒共培养72小时后，细胞变圆、漂浮、死亡(图3)。而敲除hACE2的基因编辑干细胞与分离的病毒共培养72小时后，细胞仍呈梭形贴壁生长，说明基因编辑干细胞对病毒有较强的抵抗力(图4)。
5.基因编辑干细胞的应用
以hACE2基因编辑干细胞替代腺病毒载体，制备基因编辑干细胞载体新冠疫苗。
5.1.基因编辑干细胞的RED基因装配
6.1.1.RBD基因的合成
参照GenBank登录号(MN908947.3)对SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸序列进行分析，其RBD氨基酸为Gly319～Asn541，采用氨基酸密码子同义置换，对RBD肽段对应的核酸进行全基因组合成。合成前进行密码子优化，目的是提高基因组中G+C％的含量，增加mRNA在哺乳动物细胞中的稳定性或mRNA输入细胞质的速率，避免稀有tRNAs的损耗，增强蛋白表达效率，提高免疫原性。具体方法如下：统计分析NC_045512.2株病毒密码子和人类密码子的使用频率(http：www.kazusa.or.jp/codon)，使用人类偏好密码子对NC045512.2株病毒的S1-RBD基因进行密码子优化，使其密码子使用频率与人类一致，同时在基因5’末端添加EcoRI的酶切识别序列GAATTC，在3’末端添加XhoI酶切识别序列CTCGAG。优化基因的G+C％由48％提高至70％，密码子第三位的G+C％则由39％提高到100％。优化的RBD基因序列765bp：ATGAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGTAA。
5.1.2.携带RBD基因的慢病毒表达载体构建
以T4连接酶将合成的S1-RBD基因与线性化的慢病毒表达载体进行连接，构建慢病毒表达载体(pGC-FU-RBD或pHBLV-RBD)，然后转化感受态E.coli DH5α，将其涂布于含50μg.mL-1氨苄青霉素的LB平板抗性培养，筛选出阳性克隆，提取质粒，进行PCR、酶切或测序鉴定，扩增培养测序正确的阳性克隆，按质粒抽提试剂盒抽提重组质粒。同理将能刺激宿主产生抗体的其他核酸序列构建慢病毒表达载体，制备相应的载体疫苗。
本发明涉及的载体还包括过表达载体如pHBLV-CMV-IRES-ZsGreen、pHBLV-CMV-EF1-RFP、、pHBLV-CMV-IRES-Puro、pHBLV-IRES-ZsGreen-PGK-puro、pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-Puro、pHBLV-CMVIE-RFP-T2A-Puro、pHBLV-CMVIE-Luc-T2A-Puro、pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-Luc。
5.1.3.携带RBD基因的慢病毒包装
取对数生长期的293FT细胞，以5×106cell·mL-1的密度接种于培养瓶。将慢病毒表达载体(pGC-FU-RBD)、包装质粒(pHelper 1.0和pHelper 2.0)分别进行高纯度无内毒素抽提，按Invitmgen公司upofectamine 2000使用说明进行共转染293FT细胞。同时将DGC-FU(含GFP基因)、包装质粒(pHelper 1.0和pHelper 2.0)共转染另一组293FT细胞，所获得的仅携带GFP基因的空载体(kntiviml～GFP)作为对照。转染8h后更换为完全培养基，继续培养48h，收集富含慢病毒的上清液，4℃，4000g离心10min，再以0.45μm滤器过滤，得到高滴度的慢病毒，分装，置于-80℃保存。
5.1.4.携带RBD基因的慢病毒滴度检测
①孔稀释法计数荧光细胞：取慢病毒原液10μL，用10％FBS的DMEM培养液10倍稀释为3-5个梯度，将293 FT细胞按每孔3×104个细胞的密度接种于96孔板，37℃5％CO2培养24h后，每孔更换为10％FBS的DMEM培养液150μL继续培养48h，用荧光显微镜计数荧光细胞，计算病毒滴度。结果在重组质粒pGC-FU-RBD转染293 FT细胞后，被包装成慢病毒颗粒，在荧光显微镜下293 FT细胞内呈现绿色荧光。②Real time定量PCR法测定：以10％FBS的DMEM培养液培养293 FT细胞，以待测定的慢病毒原液感染，然后根据Invitrogen公司的TRIZOL操作说明书抽提RNA，以做RT-qPCR测定所抽提RNA的浓度。
5.1.5.携带RBD基因的慢病毒转染基因编辑干细胞
以每孔1×106个细胞密度将生长状态良好的基因编辑干细胞接种于6孔板，待细胞融合至30％时，试验组细胞分别加入5倍稀释的慢病毒原液，同时设立阴性对照组(仅转染慢病毒载体)和空白对照组(未转染慢病毒载体)。上述细胞培养24h后更换10％FBS的DMEM液，并加入最佳筛选浓度的氨苄青霉素(2.50μg·mL-1)，维持氨苄青霉素浓度(氨苄青霉素筛选pGC-FU-RBD、嘌呤霉素筛选筛选pHBLV-RBD)，隔天换液，直至空白对照组细胞完全死亡。未被杀死的细胞即为已被重组慢病毒转染并已在DNA上整合了新冠病毒S1-RBD的基因编辑干细胞，即所述的基因编辑干细胞载体疫苗。
5.1.6.基因编辑干细胞的RBD基因检测
①RT-PCR检测RBD基因的mRNA转录
取基因编辑干细胞载体疫苗，以1×106个细胞密度接种于6孔板，培养4d后，应用RT-PCR检测RBD基因的转录水平。RT-PCR扩增RBD的引物序列为：RBD上游：5’-GATTACTCATTCATTCGATATTAC-3’；下游：5’-ATATGCAACAGATGATCGGAAC-3’；β-actin上游：5’-TGGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’；下游：5’-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3’。RT-PCR检测结果与对照组相比，显示1条额外的RBD转录的409bp条带。
②Western-Blot检测RBD基因的蛋白表达
抽提基因编辑干细胞裂解液的蛋白，BAC法蛋白定量，每组设置3个随机复孔。用10％SDS-PAGE分离样品蛋白质，电转至硝酸纤维素膜上，以1∶400稀释的抗VDR抗体为一抗，用ECL化学发光试剂盒显像，用凝胶图像分析系统确定各蛋白条带的相对灰度值。Western-Blot检测到基因编辑干细胞组RBD基因的蛋白表达明显增加。
③免疫荧光检测RBD基因的蛋白表达
制备基因编辑干细胞抗原片，以兔抗SARS-COV-2多克隆特异抗体作为第一抗体，以FITC标记的羊抗兔IgG作为第二抗体进行间接免疫荧光(IFA)检测，基因编辑干细胞中可以观察到SARS-COV-2特异荧光颗粒，表明RBD基因在细胞中得到了表达，称基因编辑干细胞载体新冠疫苗或基因编辑新冠疫苗。
5.2.基因编辑干细胞载体新冠疫苗的免疫功能检测
5.2.1.基因编辑新冠疫苗的准备
取装配了S1-RBD的基因编辑干细胞接种于10％FBS的DMEM完全培养液中进行细胞培养，待细胞铺满瓶底约90％时，0.25％胰酶消化，进行传代、扩增培养。
5.2.2.实验动物的准备
选择6-8周龄、40克左右的SPF级雌性BALB/c小鼠，随机分为基因编辑干细胞载体疫苗组、基因编辑干细胞载体对照组(以空载体转染基因编辑干细胞)，每组10只。
5.2.3.动物接种及标本采集
在各组小鼠的腹腔注射5％水合氯醛溶液(0.006mL/g或0.6mg/g)，肌肉松弛后固定于板上；颈部皮肤备皮，碘伏擦拭消毒，颈部皮肤剪开约1cm小口，组织镊子分离肌肉及结缔组织，暴露气管；将干细胞缓慢注入小鼠气管，复位组织、缝合皮肤；每天观察小鼠的临床症状，采集接种后1、2、4、6周的静脉血，3,000g离心10min，分离的血清于-20℃保存，用于测定SARS-CoV-2特异性抗体IgG和IgM。
5.2.4.检测方法
①ELISA检测IgG：按试剂盒操作：每孔加入1∶10稀释的100μl待检血清，放37℃温箱孵育30min，用洗涤液充分洗涤；加入100μl HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶500)，放37℃温箱孵育30min，用洗涤液充分洗涤；加入底物液，放37℃温箱孵育10min，最后加入终止液50μl，在450nm波长下测定OD值。
②ELISA检测IgM：按试剂盒操作：每孔加入1∶10稀释的100μl待检血清，放37℃温箱孵育30min，用洗涤液充分洗涤；加入100μl HRP标记的羊抗鼠IgM(1∶500)，放37℃温箱孵育30min，用洗涤液充分洗涤：加入底物液，放37℃温箱孵育10min，最后加入终止液50μl，在450nm波长下测定OD值。
③中和抗体的测定：取抗体阳性血清标本100μl，56℃水浴30min灭活，以排除非特异性反应因素。将试验血清用0.22μm的过滤器过滤后进行倍比稀释，使之成为1∶2，1∶4，1∶8……。然后将病毒稀释成每个细胞孔1/2接种量中含100TCID50(计算病毒稀释倍数的公式为：TCID50/0.2ml的对数减中和试验要求病毒含量/0.1ml的对数减病毒滴定时每孔细胞接种量与中和试验时每孔细胞接种病毒量之间倍数的对数，所得对数的反对数即为病毒应稀释的倍数)。将稀释好的病毒按每管200μl加入等量的稀释好的血清，充分混匀后，37℃水浴作用120min。每个样品4个复孔接种VeroE6细胞，除阴性细胞对照孔外，每孔100μl病毒-血清混合物。阳性细胞对照：50μl病毒稀释液+50μl病毒+100μl细胞。阴性细胞对照：加100μl病毒稀释液。37℃，5％CO2培养箱孵育，逐日观察细胞病变效应(CPE)。
5.2.5.检测结果
①特异性抗体检测结果：基因编辑干细胞载体疫苗组在接种后1、2、4、6周的IgG和IgM检测结果见表8。检测结果表明，经基因编辑干细胞载体疫苗接种的小鼠外周血IgG、IgM阳性及其同时阳性的例次分别为14、16和7例，对照组的阳性例次分别为3、4和1例，说明基因编辑干细胞载体疫苗组在接种后有较多例次产生了特异性抗体。
表8 基因编辑干细胞载体疫苗组在接种小鼠后的特异性抗体检测结果
②中和抗体检测结果：将接种后第4周血清IgG阳性的5例小鼠血清，按本发明所述的中和抗体检测方法操作，结果阳性(对照组)的VeroE6细胞在培养3-5天内全部发生细胞病变效应(CPE)；而阴性(对照组)细胞呈贴壁生长(+)，均未发生CPE；5例小鼠血清在1∶16～128倍稀释后仍能抑制病毒对VeroE6细胞的攻击，但随着稀释倍数的增大，不能抑制病毒对细胞的攻击，使VeroE6细胞出现CPE。说明5例小鼠血清样本中的IgG具有中和病毒的作用，进而说明基因编辑干细胞载体疫苗能刺激小鼠产生中和抗体，其效价为1∶16～128(表9)。
表9 基因编辑干细胞载体疫苗的中和抗体致VeroE6细胞半数感染的试验结果
6.3.hACE2基因编辑干细胞载体新冠疫苗的收藏和应用
将基因编辑干细胞载体疫苗按姓名、ABO和/或HLA分型冻存于-196℃干细胞库，当某个体需要使用时，按自身、ABO或HLA同型、异型的次序选用干细胞载体疫苗。
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