一种co和药物释放协同治疗剂及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种co和药物释放协同治疗剂及其制备方法和应用 (CO and drug release synergistic therapeutic agent and preparation method and application thereof ) 是由 汪洋 黄悠悠 姚勇 于 2021-03-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种CO和药物释放协同治疗剂及其制备方法和应用,属于医药技术领域。该协同治疗剂包括金属-有机骨架纳米颗粒Uio-66-SH-TPP和透明质酸,所述透明质酸作为外壳包裹在金属-有机骨架纳米颗粒Uio-66-SH-TPP外表面；所述金属-有机骨架纳米颗粒Uio-66-SH-TPP的骨架上通过配位键修饰有Fe-(3)(CO)-(12),在所述金属-有机骨架纳米颗粒Uio-66-SH-TPP的孔道内吸附有药物5-FU。本发明的协同治疗剂可以实现CO气体治疗和化疗的协同治疗,既提高对治疗病灶区的准确性又增强了治疗效果。(The invention discloses a CO and drug release synergistic therapeutic agent, and a preparation method and application thereof, and belongs to the technical field of medicines. The synergistic therapeutic agent comprises metal-organic skeleton nanoparticles Uio-66-SH-TPP and hyaluronic acidThe acid is used as a shell to wrap the outer surface of the metal-organic framework nano-particles Uio-66-SH-TPP; the skeleton of the metal-organic skeleton nanoparticle Uio-66-SH-TPP is modified with Fe through a coordination bond 3 (CO) 12 The drug 5-FU is adsorbed in the pore canal of the metal-organic framework nano-particle Uio-66-SH-TPP. The synergistic therapeutic agent of the invention can realize the synergistic treatment of CO gas treatment and chemotherapy, not only improve the accuracy of treating focal areas, but also enhance the treatment effect.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种线粒体靶向的CO和药物释放协同治疗剂及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是世界上最严重的公共健康问题之一，化疗、光动力疗法和光热疗法等直接疗法已被广泛用于癌症治疗。然而，这些疗法都面临一个共同问题，那就是对癌细胞杀伤力有限，并且对正常细胞具有毒副作用。这些缺点严重阻碍了这些疗法在癌症治疗中的有效使用。虽然CO是一种毒性气体，但是越来越多的研究表明，这种由血红素代谢生成的内源性气体是一种重要的生理气体信号分子，在细胞保护以及维持细胞内环境平衡上扮演着不可或缺的角色，可以对细胞内的各种信号通路，尤其是细胞凋亡以及炎症反应相关的过程，进行有效的调控。然而，CO和血红蛋白非常容易结合，使CO作为吸入式药剂使用时会出现诸如剂量控制、靶向递送等多方面问题。故而建立靶向药物递送体系及可控释放是提高CO气体治疗效果的关键之处。
化疗仍然是癌症治疗最重要的方法之一。然而，肿瘤微环境（Tumormicroenvironment ，TME）通常具有缺氧、过氧化氢浓度高、葡萄糖缺乏和pH值低的特征，在很大程度上直接影响了癌症的化疗效果。单一抗肿瘤药物的化疗模式可能诱导实体瘤产生耐药性和免疫抑制效应，而多种抗肿瘤药物联合的多重化疗模式表现出显著地增强化疗。研究表明，气体治疗是一种新兴的、且非常有应用前景的肿瘤治疗新策略，协同化疗可以显著增强癌症治疗的效果。因此，设计并构建一种生物相容性好，具有靶向运输和可控释放的药物递送体系是至关重要的。
因此，构建靶向肿瘤细胞的药物递送体系并利用TME的特性刺激响应CO气体和药物可控释放，实现气体治疗协同化疗提高肿瘤治疗效果，具有显著意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种TME响应的CO和药物释放协同治疗剂。
本发明的另一目的是提供上述协同治疗剂的制备方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种CO和药物释放协同治疗剂，包括金属-有机骨架纳米颗粒Uio-66-SH-TPP和透明质酸，所述透明质酸作为外壳包裹在金属-有机骨架纳米颗粒Uio-66-SH-TPP外表面；
所述金属-有机骨架纳米颗粒Uio-66-SH-TPP的骨架上通过配位键修饰有Fe3(CO)12，在所述金属-有机骨架纳米颗粒Uio-66-SH-TPP的孔道内吸附有药物5-FU。
上述CO和药物释放协同治疗剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将2,5-二巯基对苯二甲酸、(4-羧丁基)三苯基溴化膦、四氯化锆和冰醋酸加到N,N'-二甲基甲酰胺中，混合物采用溶剂热法合成Uio-66-SH-TPP；
步骤2，将Fe3(CO)12、Uio-66-SH-TPP加到四氢呋喃中，回流反应，得到修饰有Fe3(CO)12的Uio-66-SH-TPP；
步骤3，将修饰有Fe3(CO)12的Uio-66-SH-TPP分散在水中，再加入5-FU，经搅拌后得到吸附5-FU的纳米复合颗粒；
步骤4，将吸附5-FU的纳米复合颗粒分散在水中，加入透明质酸的PBS溶液，将混合物置于冰箱冷藏，取出后离心，即可得到所述TME响应的CO和药物释放协同治疗剂。
进一步地，步骤1中采用溶剂热法是将混合物置于聚四氟乙烯高压反应釜内120℃反应24h。
进一步地，步骤2中回流反应是在70℃加热冷凝回流1h。
进一步地，步骤3中搅拌条件为20-30℃、12h。
进一步地，步骤4中冷藏条件为4℃、2h。
上述制备方法得到的协同治疗剂，包括具有方形结构的Uio-66-SH-TPP纳米颗粒和骨架内修饰的Fe3(CO)12，材料孔道内吸附药物5-FU以及提高材料生物相容性表面包覆HA。
上述协同治疗剂在制备肿瘤治疗药物中的应用。
有益效果：本发明通过将H2DMBD作为金属-有机骨架(MOFs)材料的有机配体，以锆(Zr)作为金属源，Zr的末端羟基(-OH)基团可与配体上的羧基(-COOH)配位，在合成MOFs的同时引入线粒体靶向分子TPP；带巯基(-SH)的有机配体可以与Fe3(CO)12通过配位键S-Fe引入CO前药;在多孔纳米MOFs复合材料的孔道内吸附药物5-FU；在材料的表面包覆HA，构建得到具有可控CO及药物释放体系的协同治疗剂。本发明的治疗剂具有靶向运输和可控释放的特性，通过TME刺激响应控制实现气体治疗和化疗的协同治疗。采用上述协同治疗剂治疗肿瘤是一种绿色的治疗方式，本发明采用靶向肿瘤细胞表面和细胞器的逐级递送方式，同时设计能利用TME刺激释放CO和5-FU的药物递送体系，可以改善传统治疗中的气体和药物泄漏的缺点，增强肿瘤治疗效果。此外，本发明的治疗剂合成步骤比较简单，且产率较高；进一步地，由于合成方法简单，成本较低，因而适合大规模生产。
附图说明
图1为实施例1中Uio-66-SH-TPP纳米颗粒的SEM照片(a)、Zeta电位(b)、紫外-可见-近红外光谱(c)和红外光谱(d)。
图2为实施例1的[email protected] Fe3(CO)12在30 µM H2O2和硫酸亚铁七水合物的PBS溶液（即为30µM •OH）的环境下，利用牛血红蛋白还原法的紫外光谱时间变化曲线(a)和其在不同浓度•OH的PBS溶液环境下CO释放量的统计(b)。
图3为实施例1中不同浓度5-FU的紫外光谱(a)和根据(a)图拟合的5-FU标准曲线(R2=0.9967) (b)。
图4为实施例1的Uio-66-SH-TPP在水中常温搅拌负载5-FU不同时间间隔的水中5-FU的紫外吸光光谱(a)和根据(a)图计算的时间变化-药物负载量曲线(b)。
图5为实施例1的[email protected]在不同pH环境中5-FU释放的测定。
图6为实施例1中Uio-66-SH和Uio-66-SH-TPP（吸附能产生红色荧光的罗丹明B）与HeLa细胞培养，线粒体染色后的药物荧光和线粒体荧光图片。
图7为实施例1中不同浓度的Uio-66-SH-TPP、[email protected]3(CO)12、[email protected] Fe3(CO)12@5-FU、[email protected] Fe3(CO)12@[email protected]和 5-FU的细胞活性。
具体实施方式
为详细说明本发明的结构特征、技术手段以及所实现的目的及效果，以下结合实施方式并配合附图进行详细说明。
本发明提供了一种肿瘤微环境响应的CO和药物释放协同治疗剂，包括具有线粒体靶向性的Uio-66-SH-TPP纳米颗粒和骨架内修饰的Fe3(CO)12，Uio-66-SH-TPP纳米颗粒的孔道内吸附药物5-FU，同时，在Uio-66-SH-TPP纳米颗粒的表面还包覆有透明质酸（HA）以进一步增强给药系统的靶向性。
具体地，所述Uio-66-SH-TPP纳米颗粒是直径约为20 nm的方形结构。
本发明所用到的配体2,5-二巯基对苯二甲酸（H2DMBD），可以采用下述步骤制备，也可直接购买市售产品。
2,5-二巯基对苯二甲酸（H2DMBD）的制备方法，包括以下步骤：
(1) 2,5-二（甲基硫代氨基甲氧基）对苯二甲酸二乙酯的合成
将5g的2,5-二羟基对苯二甲酸二乙酯和9g的三乙烯二胺(DABCO)溶于50mL的N,N-二甲基乙酰胺(DMA) 中，冰浴冷却至0 °C；将 9.5g 的 N,N-二甲基硫代甲酰氯溶于25mL的DMA中，超声完全溶解后在氮气(N2)保护下用恒压滴液漏斗缓慢滴加到上一步溶液中，保持温度在0 °C；滴加完全后将混合液在室温下搅拌16h，产生白色沉淀，抽滤并大量水洗后在真空条下干燥，得到化合物2,5-二（甲基硫代氨基甲氧基）对苯二甲酸二乙酯。
(2) 2,5-二（甲基硫代氨基甲磺酰基）对苯二甲酸二乙酯的合成
在N2保护下，将合成的2,5-二（甲基硫代氨基甲氧基）对苯二甲酸二乙酯在230 °C加热搅拌1h，得到的棕色混合物缓慢冷却至70 °C，用恒压滴液漏斗加入20mL乙醇，慢慢冷却至室温得到淡棕色晶体，抽滤后干燥，最后化合物过柱子提纯后得到2,5-二（甲基硫代氨基甲磺酰基）对苯二甲酸二乙酯。
(3) 2,5-二巯基对苯二甲酸的合成
配制1.3mol·L-1KOH乙醇/水(1:1)溶液，并取20mL脱气1h；将反应得到的2,5-二（甲基硫代氨基甲磺酰基）对苯二甲酸二乙酯溶解在已脱气的KOH乙醇/水(1:1)溶液中，在N2保护下85 °C回流3h；反应混合物冷却至室温后在冰浴中下加入10mL浓盐酸，产生明黄色沉淀，抽滤、大量水洗后真空干燥，得到配体2,5-二巯基对苯二甲酸（H2DMBD）。
上述协同治疗剂的制备方法包括以下步骤：
步骤1，采用溶剂热的方法合成Uio-66-SH-TPP；
将9.6mg的四氯化锆(ZrCl4)、9.5mg的H2DMBD、5mg的(4-羧丁基)三苯基溴化膦（TPP）、750 µL的冰醋酸加到10mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将混合物超声分散后转入聚四氟乙烯高压反应釜内120 °C反应24h。反应结束冷却至室温后，用用DMF离心洗涤3次，再用无水乙醇离心洗涤3次，真空干燥得到Uio-66-SH-TPP。
制备Uio-66-SH的方法同制备Uio-66-SH-TPP的方法类似，仅把原料TPP去掉即可。
所述反应的最佳温度为120 °C，反应时间为24 h。得到的Uio-66-SH-TPP纳米颗粒直径约为20 nm。
步骤2，采用配位键合制备[email protected] Fe3(CO)12；
将25mg的Uio-66-SH-TPP、50 mg的Fe3(CO)12和50 mL的四氢呋喃加到圆底烧瓶中，超声分散后，将混合物在70 °C加热冷凝回流1h。最后，通过离心收集产物，用无水乙醇离心洗涤3次，真空干燥得到[email protected] Fe3(CO)12。
所述2,5-二羟基对苯二甲酸二乙酯，三乙烯二胺，N,N-二甲基硫代甲酰氯，ZrCl4，KOH，DMA和DMF等皆为常用的化学原料及下一步所用的5-FU和HA，可直接从试剂网上订购。
步骤3，采用常温搅拌的方法将5-FU吸附到[email protected] Fe3(CO)12纳米颗粒孔道内；
将5.5mg的[email protected] Fe3(CO)12分散在10mL的PBS中，加入14 mg的5-FU在室温下磁力搅拌过夜，离心收集并用水洗涤3次得到[email protected] Fe3(CO)12@5-FU。
制备[email protected]的方法同制备[email protected] Fe3(CO)12@5-FU的方法类似，仅把原料[email protected] Fe3(CO)12换成Uio-66-SH-TPP即可。
制备Uio-66-SH和Uio-66-SH-TPP吸附能产生红色荧光的罗丹明B(RB)的方法与同制备[email protected]的方法类似，仅把原料5-FU换成RB即可。
步骤4，制备[email protected] Fe3(CO)12@[email protected]；
将15mg的[email protected] Fe3(CO)12@5-FU分散在4mL水中，并逐渐加入15mg的透明质酸(HA)(溶解在6mL PBS溶液中)。将混合物放在4°C冰箱冷藏2h，然后离心收集并水洗2遍得到[email protected] Fe3(CO)12@[email protected]。
上述制备方法得到的协同治疗剂，包括具有方形结构的Uio-66-SH-TPP纳米颗粒和骨架内修饰的Fe3(CO)12，材料孔道内吸附药物5-FU以及提高材料生物相容性表面包覆HA。
所述Uio-66-SH-TPP纳米颗粒是直径约为20 nm，且骨架内引入Fe3(CO)12，孔道吸附5-FU和表面包覆HA的功能化修饰。
本发明的协同治疗剂具有CO气体治疗和化疗的协同治疗功能，本发明的[email protected] Fe3(CO)12具有线粒体靶向性且线粒体内•OH可触发CO的释放。所述协同治疗剂纳米材料含有的5-FU利用TME中的低pH可以刺激响应释放实现化疗。材料表面包覆的HA可以与肿瘤细胞表面过表达的受体通过配体-受体结合机制实现肿瘤靶向传递药物的目的，同时TPP靶向肿瘤细胞的线粒体内。如此便可以实现细胞靶向和细胞器（线粒体）靶向的逐级靶向效果，增强协同治疗剂的靶向性。因此，构建的给药系统可以实现CO气体治疗和化疗的协同治疗，既提高对治疗病灶区的准确性又增强了治疗效果。
上述制备得到的协同治疗剂能够作为治疗肿瘤的制剂的应用。
所述的治疗肿瘤的制剂为所述协同治疗剂在所述的刺激响应CO气体和药物释放的条件下的气体治疗协同化疗。
可以理解的，所述协同治疗能够抑制肿瘤细胞生长并杀死癌细胞，因此，本发明的协同治疗剂是一种高效、低毒、绿色的肿瘤治疗方式。
本发明的肿瘤协同治疗剂的制备方法，其合成原料价格低廉且制备工艺简单、易于大规模生产。此外，利用本发明制备方法得到的协同治疗剂具有良好的单分散性和稳定性、良好的生物相容性以及高的肿瘤靶向性和具有可控的CO和5-FU释放。
下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
(1) 制备配体H2DMBD
A. 2,5-二（甲基硫代氨基甲氧基）对苯二甲酸二乙酯的合成
将5g的2,5-二羟基对苯二甲酸二乙酯和9g的DABCO溶于50mL的DMA 中，冰浴冷却至0°C；将 9.5g 的 N,N-二甲基硫代甲酰氯溶于25mL的DMA中，超声完全溶解后在N2保护下用恒压滴液漏斗缓慢滴加到上一步溶液中，保持温度在0°C；滴加完全后将混合液在室温下搅拌16h，产生白色沉淀，抽滤并大量水洗后在真空条下干燥，得到化合物2,5-二（甲基硫代氨基甲氧基）对苯二甲酸二乙酯。
B. 2,5-二（甲基硫代氨基甲磺酰基）对苯二甲酸二乙酯的合成
在N2保护下，将合成的2,5-二（甲基硫代氨基甲氧基）对苯二甲酸二乙酯在230°C加热搅拌1h，得到的棕色混合物缓慢冷却至70°C，用恒压滴液漏斗加入20mL乙醇，慢慢冷却至室温得到淡棕色晶体，抽滤后干燥，最后化合物过柱子提纯后得到2,5-二（甲基硫代氨基甲磺酰基）对苯二甲酸二乙酯。
C. 2,5-二巯基对苯二甲酸的合成
配制1.3mol·L-1KOH乙醇/水(1:1)溶液，并取20mL脱气1h；将反应得到的2,5-二（甲基硫代氨基甲磺酰基）对苯二甲酸二乙酯溶解在已脱气的KOH乙醇/水(1:1)溶液中，在N2保护下85°C回流3h；反应混合物冷却至室温后在冰浴中下加入10mL浓盐酸，产生明黄色沉淀，抽滤、大量水洗后真空干燥，得到化合物2,5-二巯基对苯二甲酸。
(2) Uio-66-SH-TPP纳米颗粒;
将9.6mg的ZrCl4、9.5mg的H2DMBD、5mg的TPP、750μL的冰醋酸加到10mLDMF中，将混合物超声分散后转入聚四氟乙烯高压反应釜内120°C反应24h。反应结束冷却至室温后，用用DMF离心洗涤3次，再用无水乙醇离心洗涤3次，真空干燥得到Uio-66-SH-TPP。
制备Uio-66-SH的方法同制备Uio-66-SH-TPP的方法类似，仅把原料TPP去掉即可。
(3) 制备[email protected] Fe3(CO)12;
将25mg的Uio-66-SH-TPP、50 mg的Fe3(CO)12和50 mL的THF加到圆底烧瓶中，超声分散后，将混合物在70 °C加热冷凝回流1h。最后，通过离心收集产物，用无水乙醇离心洗涤3次，真空干燥得到[email protected] Fe3(CO)12。
(4) 制备[email protected] Fe3(CO)12@5-FU;
将5.5mg的[email protected] Fe3(CO)12分散在10mL的PBS中，加入14 mg的5-FU室温磁力搅拌过夜，离心收集并用水洗涤3次得到[email protected] Fe3(CO)12@5-FU。
制备[email protected]的方法同制备[email protected] Fe3(CO)12@5-FU的方法类似，仅把原料[email protected] Fe3(CO)12换成Uio-66-SH-TPP即可。
制备Uio-66-SH和Uio-66-SH-TPP吸附能产生红色荧光的罗丹明B(RB)的方法与同制备[email protected]的方法类似，仅把原料5-FU换成RB即可。
(5) 制备[email protected] Fe3(CO)12@[email protected];
将15mg的[email protected] Fe3(CO)12@5-FU分散在4mL水中，并逐渐加入15mg的HA(溶解在的6mL PBS溶液中)。将混合物放在冰箱冷藏2h，然后离心收集并水洗2遍得到[email protected] Fe3(CO)12@[email protected]。
性能测试：
1. Uio-66-SH-TPP纳米颗粒的形貌测定
图1是实施例1制备的Uio-66-SH-TPP纳米颗粒的SEM(a)、Zeta电位(b)、红外光谱(c)和紫外-可见-近红外光谱(d)。结果表明，图 (a)中能够观察到合成的Uio-66-SH-TPP纳米颗粒直径为20nm左右。图 (b)可以看出制备的[email protected] Fe3(CO)12的材料比Uio-66-SH-TPP纳米颗粒的Zeta电位的电位数值绝对值较大，说明其稳定性更好。图 (c)可以看出制备的Uio-66-SH-TPP纳米颗粒在真空紫外区区具有很好的光吸收。图 (d)可以看出制备的[email protected] Fe3(CO)12均有Uio-66-SH-TPP和Fe3(CO)12的特征峰。
2.测定[email protected] Fe3(CO)12在 •OH环境中 CO的释放
通过牛血红蛋白(Hb)与CO结合后为羰基血红蛋白(HbCO)，此过程有一个紫外吸收峰从430nm(Hb的吸收峰)向410nm(HbCO的吸收峰)的转化，通过这一变化用分光光度法间接检测CO的释放。
首先，将实施例1制备的[email protected] Fe3(CO)12配成浓度100 µg/mL的PBS溶 液，将新鲜制备的Hb(4.2μM)溶解在PBS(pH=7.4)溶液中，加入1.2mg的连二亚硫酸钠将其还 原，加入75μL配好浓度的材料，再加入不同浓度•OH的溶液中(30 µM，10µM，0µM H2O2和硫酸 亚铁七水合物的PBS溶液，pH=7.4)。立即将整个反应溶液(3mL)密封在4mL紫外石英试管中。 溶液的紫外吸收光谱(I= 350–600 nm)在紫外/可见分光光度计上收集。为了消除影响因素 和提高准确度，分别归因于HbCO和Hb的I= 410和430 nm的两条强吸附带被用于量化Hb向 HbCO的转化，得到图2(a)，然后通过计算公式(Cco代表CO 的浓度，I 410nm代表HbCO在I= 410nm处紫外吸光度值， I 430nm代表Hb在I= 430 nm处紫外吸光 度值)计算得到[email protected] Fe3(CO)12在30 µM •OH的PBS溶液中CO释放曲线图2(b)。从 图2(b)可以看出[email protected] Fe3(CO)12在不同浓度•OH条件下CO的释放量随着•OH浓度 的增高而增高。
3. 绘制5-FU的标准曲线
配制不同浓度5-FU的水溶液，分别为0.002mg/mL、0.004mg/mL、0.006mg/mL、0.008mg/mL、0.010mg/mL、0.012mg/mL、0.014mg/mL、0.016mg/mL、0.018mg/mL和0.020mg/mL。测定不同浓度5-FU的紫外吸收光谱，从图3(a)中可以看出在262nm处5-FU有最大吸收峰，且随着浓度的增加最大吸收峰值也随之增大。根据不同浓度在262nm处对应的紫外吸收值绘制标准曲线，从图3(b)中可以看出二者有很好的线性关系(R2=0.9967)，还可以得到浓度(X)-吸收值(Y)的函数关系：Y=47.44*X-0.003867。
4. [email protected]的药物负载量的测定
将5.5mg的[email protected] Fe3(CO)12分散在10mL的PBS中，加入14 mg的5-FU室温磁力搅拌。在0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、3.0h、4.0h、5.0h、6.0h、7.0h、8.0h、9.0h、10h、11h和12h的时间间隔下，取3mL的反应溶液，离心后取上清夜测量紫外吸收光谱。从图4(a)可以看出，随着反应时间的延长，上清液的吸光度值在不断降低，说明5-FU被吸附到材料的孔道内。根据5-FU的标准曲线计算出不同反应时间的上清夜中未被吸附的5-FU，间接计算出不同时间的药物负载量，其负载量的变化如图4(b)所示，随着反应时间的延长，5-FU逐渐吸附到材料中并达到吸附稳定。
5. 测定[email protected]在不同pH环境下药物释放
将实施例1制备的4mg/mL的[email protected]水溶液，分别加入10mL 的配成pH分别为4.6、5.5、6.5、7.4的PBS溶液，在2.0h、4.0h、6.0 h、8.0h、10h、12h和14h的时间间隔下，取3mL的反应溶液，离心后取上清夜测量紫外吸收光谱。根据5-FU的标准曲线计算出不同反应时间的上清夜中释放的5-FU,计算出每一个pH条件下不同时间的药物释放量，其释放量的变化如图5所示，从图中可以看出，随着pH的降低，5-FU的释放量不断增加，说明5-FU在酸性条件下刺激释放。
6.测定Uio-66-SH和Uio-66-SH-TPP的线粒体靶向性
与HeLa细胞培养线粒体染色后的药物荧光和线粒体荧光图片
将实施例1制备的Uio-66-SH和Uio-66-SH-TPP（吸附RB后）配制成320µg/mL(pH =7.4)PBS溶液，将HeLa细胞以105个/孔的密度接种到2个Ф20mm玻璃底细胞培养皿中，并在5% CO2下于37 °C孵育12h。除去旧的培养基，添加1.5mL新鲜培养基，分别加入500µL配好的材料，在5% CO2下于37 °C孵育4h。用PBS洗涤细胞皿以去除未摄取的颗粒，加入1.5mL新鲜培养基和500µL线粒体染色剂，在5% CO2下于37 °C孵育45分钟。用PBS洗涤细胞皿以去除未摄取的染色剂，加入500µL的4%多聚甲醛细胞固定液，固定20分钟后用用PBS洗涤细胞皿以去除多余固定液，各加入1mLPBS后用荧光显微镜观察二者的线粒体靶向性。从图6中可以看出红色荧光代表材料的位置，绿色荧光代表线粒体所在位置，从二者的荧光叠加图可以看出Uio-66-SH大多为红色，而Uio-66-SH-TPP中有许多红色和绿色叠加的黄色出现，说明Uio-66-SH-TPP比Uio-66-SH靶向线粒体的靶向性更强。
7. 不同浓度材料Uio-66-SH-TPP、[email protected]3(CO)12、[email protected]3(CO)12@5-FU、[email protected] Fe3(CO)12@[email protected]和 5-FU的细胞活性
通过使用噻唑蓝(MTT)测定法测定Hela 细胞的细胞生存力。将细胞以104个/孔的密度接种到96孔细胞培养板中，并在5% CO2下于37 °C孵育12h。然后，将加药组以每孔50µL的Uio-66-SH-TPP、[email protected]3(CO)12、[email protected] Fe3(CO)12@5-FU、[email protected] Fe3(CO)12@[email protected]和 5-FU分散在DMEM中，其浓度不同（5、10、20、40、80和160µg/mL）被添加到每个孔。将细胞在5% CO2下于37 °C再孵育24h。孵育后，去除旧培养基，并用PBS洗涤细胞孔以去除未摄取的颗粒，然后添加100µL新鲜培养基。然后向每个孔中加入10µL过滤灭菌的MTT试剂（PBS中5 mg/mL），并将板在37°C下孵育。再孵育4h后，除去培养基，并通过添加DMSO溶解沉淀的甲瓒晶体。使用酶标仪在450nm处测量每个孔中溶解的甲瓒晶体的吸收值。以未加药处理的细胞作为对照组，其细胞活性记为100%，计算出各浓度下的细胞存活率。所有样品均一式三份制备。
通过图7的细胞毒性的结果可以看出，Uio-66-SH-TPP的细胞活性在97%以上，说明其细胞毒性小，材料的生物相容性好；[email protected]3(CO)12低于Uio-66-SH-TPP的细胞活性，这是因为引入的Fe3(CO)12可以靶向到线粒体并释放CO，产生气体治疗使细胞活性降低；[email protected] Fe3(CO)12@5-FU比[email protected]3(CO)12的细胞活性低是因为相同条件下材料负载的药物5-FU在TME刺激释放使细胞活性降低，[email protected] Fe3(CO)12@5-FU比5-FU的细胞活性低是因为相同条件下材料引入的Fe3(CO)12可以利用线粒体内•OH触发CO释放，产生气体治疗使细胞活性降低；[email protected] Fe3(CO)12@[email protected]低于[email protected] Fe3(CO)12@5-FU的细胞活性，这是因为[email protected] Fe3(CO)12@[email protected]引入的HA可以使材料靶向到细胞表面，进一步增强给药系统的靶向性，减少其对正常细胞的毒副作用，通过细胞-线粒体的逐级靶向的方式使给药系统有了更强的目的性，不会无差别杀伤细胞，使肿瘤细胞活性进一步降低。
本发明提供的协同治疗剂以修饰线粒体靶向分子TPP的Uio-66-SH-TPP为载体并在其骨架内修饰Fe3(CO)12，孔道内吸附药物5-FU及表面包覆HA进一步增强给药系统的靶向性。首先所述的纳米MOFs-Uio-66-SH-TPP是采用高温溶剂热的方法制备的，具有20nm的小尺寸。其次通过配位键合的方法，将Fe3(CO)12修饰到Uio-66-SH-TPP骨架内，作为CO气体释放前药。最后进一步修饰5-FU和HA，利用线粒体内•OH触发CO释放，在TME刺激5-FU释放，最终实现了CO气体治疗和化疗的协同治疗效果。