合成肽，包含该合成肽的药学组合物，以及其在治疗与栓塞相关的疾病中的用途
阅读说明：本技术 合成肽，包含该合成肽的药学组合物，以及其在治疗与栓塞相关的疾病中的用途 (Synthetic peptides, pharmaceutical compositions comprising the same, and their use in treating diseases associated with embolism ) 是由 吴汉忠 郭源松 于 2020-03-19 设计创作，主要内容包括：本揭示内容是关于一种生物分子,该生物分子包含一用以标的血栓的合成肽,一种包含该生物分子的药学组合物,以及其在治疗与栓塞相关的疾病中的用途。依据本揭示内容的实施方式,该合成肽具有SEQ ID NO:1、2或3的氨基酸序列,且该合成肽会展现出对血栓的结合亲和力及专一性。因此,该合成肽可作为一种标的元件,用以递送一治疗剂(例如,一抗凝血剂或一溶血栓剂)至血栓处,据以改善该治疗剂的治疗安全性及疗效。(The present disclosure relates to a biomolecule comprising a synthetic peptide for targeting thrombi, a pharmaceutical composition comprising the biomolecule, and its use in treating embolism-related diseases. According to embodiments of the present disclosure, the synthetic peptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO 1, 2 or 3, and exhibits binding affinity and specificity for thrombi. Thus, the synthetic peptide can be used as a target element for delivering a therapeutic agent (e.g., an anticoagulant or a thrombolytic agent) to the thrombus site, thereby improving the therapeutic safety and efficacy of the therapeutic agent.)
技术领域
本揭示内容整体上关于疾病治疗的技术领域。更具体来说，本揭示内容是关于三种合成肽，以及其在治疗与栓塞相关的疾病 (thromboembolism-related diseases)中的用途。
背景技术
血栓(thrombosis)是指在血管或心脏腔室中有血栓(或血凝块)的形成。它是一种从不同的与栓塞相关的疾病所导致的常见病理征象，包括缺血性心脏疾病(例如，心绞痛(angina)、心肌梗塞(myocardial infarction)，以及心脏性猝死(sudden cardiacdeath))、缺血性中风，以及静脉栓塞(venous thromboembolism，VTE)。依据世界卫生组织(World Health Organization， WHO)的报导，心肌梗塞及中风是全球的前两名死因，总共造成全球百分之二十五的死亡率。因此，对于与栓塞相关的疾病来说，研究其分子机制，以及提供治疗至关重要。
有关治疗与栓塞相关的疾病的主流疗法包括外科手术、抗凝血疗法，以及溶血栓疗法。然而，该些疗法在治疗与栓塞相关的疾病上经常会伴随有害的副作用，因此该些疗法的疗效无法令人满意。举例来说，外科手术可能会造成出血、伤口血肿、感染，及/或神经损伤；而抗凝血疗法及溶血栓疗法则是有报告指出会诱发偏离目标效应(off-targeteffect)，以至于造成致命的出血现象。
有鉴于此，相关领域亟需一种用以治疗与栓塞相关的疾病的更加安全及有效的新颖方法。
发明内容
下文呈现本揭示内容的简单概要，以利读者对本揭示内容有基本的理解。本概要并非对本揭示内容的广泛性概观，也非用以鉴别本揭示内容的关键性/决定性元件，或勾勒本揭示内容的范围。它唯一的目的在于以一种简化的形式呈现本揭示内容某些概念，以作为后续呈现更多详细说明的序幕。
如在本文中所实施及广泛描述的，本揭示内容的一方面是关于一种生物分子，该生物分子包含一用以标的血栓的合成肽。依据本揭示内容的实施方式，该合成肽具有FQNEWFHNFLHD(SEQ ID NO:1)、TEANLSSWVFAR (SEQ ID NO:2)，或LQKNPFDLVQIL(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列。
非必要性地，本揭示内容生物分子更包含一信号肽，其中该信号肽是位于该合成肽的上游，并与该合成肽的上游连接。
依据较佳的实施方式，本揭示内容生物分子更包含一治疗剂，其中该治疗剂是与该合成肽复合，且该治疗剂是一抗凝血剂或一溶血栓剂。所述抗凝血剂的实例包括，但不限于，香豆素(coumarin)、杀鼠灵(warfarin)、醋硝香豆素(acenocoumarol)、苯丙香豆素(phenprocoumon)、阿托曼霉素 (atromentin)、苯茚二酮(phenindione)、可灭鼠(brodifacoum)、双灭鼠 (difenacoum)、肝素(heparin)、磺达肝素(fondaparinux)、艾屈肝素 (idraparinux)、生物素化艾屈肝素(idrabiotaparinux)、利伐沙班(rivaroxaban)、阿哌沙班(apixaban)、依度沙班(edoxaban)、贝曲沙班(betrixaban)、达雷沙班(darexaban)、利达沙班(letaxaban)、伊利巴沙班(eribaxaban)、水蛭素(hirudin)、来匹卢定(lepirudin)、比伐努定(bivalirudin)、阿加曲班(argatroban)、达比加群(dabigatran)、希美加群(ximelagatran)、巴曲酶(batroxobin)、吻蛭素 (hementin)、可迈丁(coumadin)、阿斯匹林(aspirin)、梯可匹定(ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)，以及普拉格雷(prasugrel)。例示性的溶血栓剂包括，组织血浆蛋白原活化因子(tissueplasminogen activator，tPA；例如，雷特普酶(reteplase)、阿替普酶(alteplase)、替奈普酶(tenecteplase)，或拉诺普酶 (lanoteplase))、葡萄球菌激酶(staphylokinase)、链球菌激酶(streptokinase)，或尿激酶(urokinase)。
依据本揭示内容的特定实施方式，该生物分子更包含一连接子，该连接子包含甘氨酸(glycine，G)及丝氨酸(serine，S)残基。在该些实施方式中，该治疗剂是经由该连接子与该合成肽复合。依据一操作实施例，该连接子包含GGGGS(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。
非必要性地，该生物分子更包含一报导分子，其中该报导分子是与该合成肽或该治疗剂复合。依据目的的不同，该报导分子可以是一标签分子、一放射性分子、一荧光分子、一磷光分子，或一化学发光分子。
本揭示内容亦涵盖一种用以治疗血栓或与栓塞相关的疾病的药学组合物或药物。本揭示内容药学组合物或药物包含本揭示内容生物分子，以及一药学上可接受的赋形剂，其中该生物分子包含一合成肽及一治疗剂，且该治疗剂是与该合成肽复合。
本揭示内容的另一方面是关于一种用以预防及/或治疗一有需要的个体的血栓或与栓塞相关的疾病的方法。该方法包含，对该个体投予一有效量的本揭示内容任一种方面或实施方式的生物分子、药学组合物，或药物。
可利用本揭示内容生物分子、药学组合物，或药物来治疗的个体是一哺乳动物；较佳地，该个体是人类。
本揭示内容亦涵盖一种本揭示内容生物分子或药学组合物于制备一药物的用途，其中该药物是用以预防及/或治疗一有需要的个体的与栓塞相关的疾病。
在参阅以下的详细说明及附随图式后，本揭示内容诸多伴随的特征及优点当可轻易了解。
附图说明
在参阅以下的详细说明，以及附随图式后，本揭示内容将更明显易懂，其中：
图1A-1B为依据本揭示内容的一实施方式所阐述的，筛选标的至人类血栓的噬菌体克隆株的结果。图1A为一直方图，说明从不同回合的生物淘选 (biopanning)中所获得的经洗提的噬菌体的效价。图1B为酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)的实验数据，说明特定噬菌体对人类血栓的结合亲和力。Y轴，在波长450纳米的吸光值。
图1C-1D为依据本揭示内容的一实施方式所阐述的，所选出的噬菌体克隆株对特定蛋白的结合亲和力。图1C为酶联免疫吸附法的实验数据，阐述特定噬菌体以剂量依赖性的方式结合至血栓。图1D为酶联免疫吸附法的实验数据，阐述特定噬菌体对牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的结合亲和力，牛血清蛋白在本实验中是作为负控制组。
图2A-2C为依据本揭示内容的另一实施例所阐述的，特定噬菌体克隆株对活体内血栓的标的能力。图2A为小鼠右颈静脉诱发血栓之前(上方像片)，以及之后(下方像片)的像片。图2B为酶联免疫吸附法的结果，说明特定噬菌体在组织中的分布情形。Y轴，在波长450纳米的吸光值。图2C为噬菌体效价检定的结果，说明特定噬菌体在组织中的分布情形。
图3为依据本揭示内容的一实施方式所阐述的免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)的像片，其中相较于负控制组，特定噬菌体可专一性结合至活体内的血栓。
图4为依据本揭示内容另一实施例所阐述的肽-tPA融合蛋白的分析结果。A小图为凝胶电泳的像片，用以分析特定融合蛋白的表达情形。B小图为Western印迹法的像片，用以确认特定融合蛋白的表达情形。野生型tPA 在本实验中是作为正控制组。C小图为一折线图，阐述特定融合蛋白的切割活性。利用Z-Gly-Gly-Arg-AMC作为荧光基质来检测tPA活性。一旦经特定切割后，该基质会发出荧光(激发波长为380纳米(EX380)，发射波长为420 纳米(EM420))。Y轴为EX380/EM420，荧光发射量为任意单位。
图5A-5B阐述小鼠经处理特定融合蛋白后的红外线荧光影像学结果。图 5A为红外线荧光影像图，为处理特定融合蛋白后，在0分钟、5分钟、20分钟、40分钟及1小时下所摄影的像片。在右颈外静脉，接近颈部的位置可探测到最强烈的红外线荧光讯号。箭头指出所诱发的血栓。图5B为一直方图，说明特定融合蛋白在诱发的血栓中的定量结果。特定融合蛋白在诱发的血栓中的荧光测量结果，是对应处理特定融合蛋白后的时间来绘制。
图6阐述特定融合蛋白在中脑动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)小鼠模式中的治疗效应。A小图为T2加权(T2-weighted) 的MCAO小鼠磁振造影(Magnetic Resonance Imaging，MRI)的影像图，其中是将载体(PBS)、tPA、SP30-tPA或SP66-tPA注射至该MCAO小鼠中。T2加权的MRI中的白色区域表示梗塞的区域。B小图为一直方图，说明MCAO小鼠脑中梗塞区域的分析结果，其中该MCAO小鼠已接受特定的治疗。
具体实施方式
为使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对本发明的实施方式与具体实施例提出说明性的描述，但这并非是实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
I.定义
为方便起见，本说明书、实施例及所附申请专利范围中所使用的特定专有名词集中在此。除非本说明书另有定义，此处所使用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。并且，在和上下文不相冲突的情形下，本说明书所使用的单数名词涵盖该名词的复数型，而所使用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。具体而言，在本说明书与权利要求中，单数形式「一」(a及an)包括复数参考值，但依据上下文而另有指示者除外。此外，在本说明书与申请专利范围中，「至少一」 (at leastone)与「一或多」(one or more)表述方式的意义相同，两者都代表包含了一、二、三或更多。
「肽」(peptide)一词是指氨基酸的聚合物，而不计聚合物的长度为何。本专有名词并未具明或排除本发明肽的化学修饰或表达后修饰，尽管该些肽的化学修饰或表达后修饰可以包括或排除为特定实施方式。因此，肽的修饰，例如，包括糖化基团(glycosylgroups)、乙酰基团(acetyl groups)、磷酸基团 (phosphate groups)、脂质基团(lipidgroups)等的共价连接，皆明确涵盖在肽一词的范围内。另外，具有该些修饰的肽可具体指定为个别由本发明包括或排除的种类。在本揭示内容中，任一个指定的氨基酸残基在一肽中的位置是由该肽的N端起算。当氨基酸未指定为D-或L-氨基酸时，该氨基酸可以是一 L-氨基酸或一D-或L-氨基酸，除非依据上下文应为一种特定的异构物。另外，本揭示内容所使用的肽氨基酸残基的注记为本领域常用的缩写注记。
本文所使用的「合成肽」(synthetic peptide)一词是指一种不包含全部皆为天然蛋白分子的肽。所述肽是「合成的」是指，该肽可藉由人为介入方式来制备，例如利用下列技术：噬菌体展示(phage-display)技术、化学合成、重组基因学技术，或全抗原断裂法(fragmentation of whole antigen)等技术。
如在本文中所讨论的，在肽的氨基酸序列中的些微变异视为涵盖在本发明所揭示及主张的发明概念内，只要其条件符合其氨基酸序列中的变异维持在至少70％的序列相似度即可，例如，至少70％、71％、72％、73％、75％、 75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％及99％的序列相似度。本揭示内容肽可经由特定修饰以改变肽特征但不影响其生理活性。举例来说，某些氨基酸经改变及/或删除后，不会影响本揭示内容肽的生理活性(即，其用于标的血栓的能力)。具体来说，氨基酸的保守性置换是可预期的。所述保守性置换是指发生在同一氨基酸家族(具有关联性的氨基酸侧链)内的置换。通常编码的氨基酸可分为下列家族：(1)酸性氨基酸＝天冬氨酸(aspartate)、谷胺酰胺(glutamate)；(2)碱性氨基酸＝赖氨酸 (lysine)、精氨酸(arginine)、组氨酸(histidine)；(3)非极性氨基酸＝丙氨酸 (alanine)、缬氨酸(valine)、亮氨酸(leucine)、异亮氨酸(isoleucine)、脯氨酸(proline)、苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)、色氨酸 (tryptophan)；以及(4)未带电极性氨基酸＝甘氨酸(glycine)、天冬酰胺 (asparagine)、谷氨酰胺(glutamine)、半胱氨酸(cysteine)、丝氨酸(serine)、苏氨酸(threonine)、酪氨酸(tyrosine)。较佳的家族分类为：丝氨酸(S)及苏氨酸 (T)为脂肪族羟基族(aliphatic-hydroxy family)；天冬酰胺(N)及谷氨酰胺(Q) 为含酰胺族(amide-containing family)；丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L) 及异亮氨酸(I)为脂肪族(aliphatic family)；以及苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)及酪氨酸(Y)为芳香族(aromatic family)。举例来说，可合理预期将亮氨酸(L)置换成异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)，将天冬氨酸(D)置换成谷氨酸(E)，将苏氨酸(T) 置换成丝氨酸(S)，或是将一氨基酸置换成一相关结构的氨基酸，此种置换不会对氨基酸分子的结合或其特性产生重大影响，特别是当所述置换并未包含氨基酸的框架区(framework site)时。可藉由分析肽衍生物的特定活性，确认氨基酸的改变是否影响一功能性肽。所属技术领域中的普通技术人员可制备蛋白/肽的片段或类似物。较佳的片段或衍生物的胺端或羧端会出现在功能域(functional domains)的附近。在一实施例中，本揭示内容合成肽中的一个氨基酸残基(例如，缬氨酸(V))发生保守性置换(例如，置换成亮氨酸(L))。在其他实施例中，本揭示内容合成肽中的两个氨基酸残基被保守性置换成其他适当的氨基酸残基，举例来说，缬氨酸(V)及精氨酸(R)分别置换成一对氨基酸包括，但不限于，甲硫氨酸(M)及赖氨酸(K)、赖氨酸(K)及脯氨酸(P)、色氨酸(W)及异亮氨酸(I)、异亮氨酸(I)及脯氨酸(P)、天冬酰胺(N)及缬氨酸 (V)，以及谷氨酰胺(G)及赖氨酸(K)。
「序列相似度百分比(％)」(percentage(％)sequence identity)一词是指候选肽序列的氨基酸残基与特定肽序列的氨基酸残基的一致性百分比；在比对时，是将复数条序列进行比对，并视需要而引入间隙(gap)，藉以达到序列相似度的最大百分比，并且不考虑任何保守性置换(conservative substitution) 作为序列相似度的一部分。可利用各种本领域技术人员所熟知的方法来比对，并确认序列相似度百分比，举例来说，可利用例如BLAST、BLAST-2、 ALIGN或Megalign(DNASTAR)等公开的电脑软体来比对。本领域技术人员可决定测量比对的适当参数，包括任一种所需要的演算法以利所比对的全长序列达到最大比对值。为达此目的，二条氨基酸序列之间的序列比对是利用国家生物技术讯息中心(Nation Center for Biotechnology Information，NCBI) 于线上提供的电脑软体Blastp(蛋白-蛋白BLAST)来分析。一特定氨基酸序列 A与一特定氨基酸序列B之间的氨基酸序列相似度百分比(或说是一特定氨基酸序列A具有与一特定氨基酸序列B的某％的氨基酸序列相同度)是利用下列公式来计算：
其中X是氨基酸残基数，其是藉由序列比对程式BLAST在比对A及B后得出一致性匹配数，而Y则是A或B序列中(取较短者)的氨基酸残基总数。
所述「投予」(administered、administering或administration)一词是指以任一种递送模式，包括，但不限于，静脉内、肌肉内、腹膜内、动脉内、颅内或皮下方式来投予一种包含本揭示内容肽的生物分子、药学组合物或药物。在某些实施方式中，是在使用前，将所述包含本揭示内容肽的生物分子与一适当的赋形剂(例如，缓冲溶液)混和，以便进行静脉内注射。
在本揭示内容中，「治疗」(treat、treating及treatment)一词涵盖部份或完全预防、改善、减轻及/或处理与血栓相关的病征(symptom)、次要病症 (secondary disorder)或症状(condition)。「治疗」一词在本说明书中亦指对一个体施用或投予一或多个本揭示内容生物分子，该个体是患有与血栓相关的病征、次要病症或症状，以达到部份或完全减轻、减缓、治愈疾病、延迟发病、抑制病程发展、降低疾病严重性，及/或降低一或多种与血栓相关的病征、次要病症、或症状的发生。与血栓相关的病征、次要病症及/或症状包括，但不限于，心绞痛、心肌梗塞、心脏性猝死、缺血性中风，以及静脉栓塞。在此「治疗」亦可指投予至患有早期该些病征或症状的个体，以降低该个体发展与血栓相关的病征、次要病症及/或症状的风险。当一治疗可减少一或多种病症或临床标记时，则该治疗为「有效的」(effective)。或者是，当一治疗可降低、减缓或终止疾病病程、病征或症状的发展时，则该治疗为「有效的」。
「有效量」(effective amount)一词在此是指一种足以产生一期望的治疗反应的成份使用量。为达到治疗的目的，一有效量亦可指一种成分的治疗利益效果超越该成分的毒性或有害影响。一种药剂的有效量并非需要治愈疾病或病症，但会对疾病或病症提供治疗，以便延缓、阻断、预防疾病或病症的发生，或者，缓解疾病或病症的症状。可将有效量分为一次、两次或多次剂量并作成适当的形式，以便在一指定期间内投予一次、两次或多次。具体的有效量或足量会取决于多种因素，例如，所欲治疗的特定症状、病患的生理条件(例如，病患的体重、年龄或性别)、接受治疗的哺乳动物或动物种类、治疗持续时间、目前疗法(若有的话)的本质，以及所用的具体剂型，以及该化合物或其衍生物的结构。举例来说，可将有效量表示成克、毫克或微克或每公斤体重几毫克(毫克/公斤)。或者是，可将有效量以活性成份(例如，本揭示内容的生物分子)的浓度来表示，例如摩尔浓度(molarconcentration)、重量浓度(mass concentration)、体积浓度(volume concentration)、重量摩尔浓度(molality)、摩尔分率(mole fraction)、重量分率(mass fraction)及混合比例 (mixing ratio)。本发明所属领域技术具有通常知识者可基于实验动物模式取得的剂量，来换算成药物(例如，本揭示内容的生物分子)的人体等效剂量 (human equivalentdose，HED)。举例来说，本发明所属领域技术具有通常知识者可依据美国食品药物管理局(US Food and Drug Administration，FDA)所公告的「估算成人健康志愿者在初始临床治疗测式的最大安全起始剂量」 (Estimating the Maximum Safe Starting Dose inInitial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)，来估算人体使用的最高安全剂量。
「药学上可接受的」(pharmaceutically acceptable)一词是指一种「普遍认为安全」(generally regarded as safe)的分子实体及组合物，例如，该些分子实体及组合物为生理上可容忍，且当投予至人体时，通常不会产生过敏或类似的不良反应。较佳地，如本文所使用的「药学上可接受的」一词，是指该分子实体及组合物已通过联邦政府的主管机关认证或已通过州政府主管机关认证，或列于美国药典或其他普遍认可的药典中，以叙明可用于动物，特别是可用于人体。
本文所使用的「赋型剂」(excipient)一词是指任一种惰性物质(例如，粉末或液体)，可形成载体(vehicle或carrier)来包覆活性剂。赋型剂一般是安全无毒的，在广义上，它可能是制药工业中用来制备药物组合物的常用成分，例如，填充剂、稀释剂、凝集剂、结合剂、润滑剂、助滑剂、安定剂、着色剂、润湿剂、崩解剂等。
「个体」(subject)一词是指一种可利用本揭示内容的生物分子、药学组合物、药物及/或方法来治疗的哺乳动物，包括人类。除非有具体指出特定性别，否则「个体」一词是指男性及女性二者。
II.发明详述
本揭示内容至少一部分是基于发明人发现三种合成肽(分别包含 FQNEWFHNFLHD(SEQ ID NO:1)、TEANLSSWVFAR(SEQ ID NO:2)，以及LQKNPFDLVQIL(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列)，会展现出对血栓的结合亲和力及专一性。因此，本揭示内容的目的在于提供一种包含该合成肽的生物分子，以及其于治疗血栓的用途。
据此，本揭示内容的第一方面是关于一种包含一合成肽的生物分子，该合成肽具有一与SEQ ID NO:1、2或3至少85％(即，85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、95％、99％或100％) 相似度的氨基酸序列。依据本揭示内容的操作实施例，该合成肽包含一与 SEQ ID NO:1、2或3具有100％相似度的氨基酸序列。
可藉由任一种常用方法来制备本发明合成肽，例如，噬菌体展示技术 (即，藉由进行噬菌体展示肽的生物淘选，以选出一欲求的对于标的分子会展现出结合亲和力的肽)，或阿伐氨基团的t-BOC或FMOC保护法(即，逐步合成法，该方法是从肽的C端开始，每次各加入一个单一氨基酸)。亦可藉由本领域所熟知的固相肽合成法来合成本发明肽。或者是，可藉由宿主细胞(例如，HEK293细胞)来制备本发明合成肽，其中是将编码所述肽的核酸转染该细胞。
为达到治疗的目的，本揭示内容生物分子可进一步包含一治疗剂，该治疗剂是与该合成肽复合。依据本揭示内容的某些实施方式，该治疗剂是一抗凝血剂或一溶血栓剂。适用本揭示内容生物分子中的抗凝血剂的实例包括，但不限于，香豆素、杀鼠灵、醋硝香豆素、苯丙香豆素、阿托曼霉素、苯茚二酮、可灭鼠、双灭鼠、肝素、磺达肝素、艾屈肝素、生物素化艾屈肝素、利伐沙班、阿哌沙班、依度沙班、贝曲沙班、达雷沙班、利达沙班、伊利巴沙班、水蛭素、来匹卢定、比伐努定、阿加曲班、达比加群、希美加群、巴曲酶、吻蛭素、可迈丁、阿斯匹林、梯可匹定、氯吡格雷，以及普拉格雷。关于溶血栓剂的部分，它可以是任一种tPA(例如，雷特普酶、阿替普酶、替奈普酶，或拉诺普酶)、葡萄球菌激酶、链球菌激酶，或尿激酶。当可理解，该治疗剂可以是其他替代性分子，只要它对血栓会展现出预防及/或治疗功效即可(例如，抑制血栓形成，或溶解闭塞性血栓)，举例来说，血纤蛋白分解剂(fibrinolyticagents)或抗血小板剂(antiplatelet agents)。依据特定操作实施例，该治疗剂是tPA。
非必要性地，所述合成肽及所述治疗剂是经由一连接子来复合。依据本揭示内容的某些实施方式，该连接子的氨基酸序列包含复数个甘氨酸(G) 及/或丝氨酸(S)残基。在一特定的实施方式中，该连接子包含GGGGS(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。
非必要性地，本揭示内容生物分子可进一步包含一报导分子，该报导分子是与该合成肽或该治疗剂复合。依据使用目的的不同，该报导分子可以是一标签分子(例如，几丁质结合蛋白(chitin binding protein，CBP)、麦芽糖结合蛋白(maltose bindingprotein，MBP)、麸胱甘肽-S-转移酶 (glutathione-S-transferase，GST)、硫氧还蛋白(thioredoxin，TRX)、链霉标签(STREP tag)、FLAGTM标签、Myc标签、人类流感病毒血球凝集素 (hemagglutinin，HA)标签，或多组氨酸(His)标签)；一放射性分子(例如，镓 -67、钼-99、铟-111，或铊-201)；一荧光分子(例如，绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein，CFP)、蓝色荧光蛋白(blue fluorescentprotein，BFP)、黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)，或该些荧光蛋白的增强型变异体)；一磷光分子(例如，掺铕(europium)、掺镝(dysprosium)，或掺铽(terbium)的正磷酸镏(lutetium orthophosphate)、铝酸锶(strontium aluminate)，或硅酸镁锶(strontium magnesium silicate)；经铜活化的硫化锌(copper-activated zincsulphide)；经银活化的硫化锌(silver-activated zinc sulphide)；经铜活化的硫化锌镉(copper-activated zinc-cadmium sulphide)；或经铋活化的硫化钙锶(bismuth-activated calcium-strontium sulphide))；或一化学发光分子(例如，腔肠素(coelenterazine)、光泽精(lucigenin)、荧光素(luciferin)、荧光素酶 (luciferase)，或含草酸盐(oxalate)的染料)。依据本揭示内容的一实施方式，本揭示内容生物分子包含一Myc标签，该Myc标签是与该治疗剂复合。依据本揭示内容的另一实施方式，本揭示内容生物分子包含一His标签，该His 标签是与该治疗剂复合。依据本揭示内容的再另一实施方式，本揭示内容生物分子包含一Myc标签及一His标签，其中该Myc标签是与该治疗剂复合，且该His标签是与该Myc标签复合。
依据某些操作实施例，所述生物分子是一融合蛋白。在该些实施例中，是将一信号肽设置在本揭示内容合成肽的上游，并与该合成肽的上游连接，据以直接调控或增强该合成肽的表达或分泌。所述信号肽可以是天然信号肽或合成信号肽。依据一特定的实施例，该信号肽是衍生自小鼠的免疫球蛋白 (IG)卡帕链。本揭示内容融合蛋白包含排序，亦即，从N端到C端为：信号肽、合成肽、连接子、治疗剂、Myc标签，以及His标签。
本揭示内容亦涵盖本揭示内容生物分子于制备一药物或一药学组合物的用途，所述药物或药学组合物是用以治疗血栓或与栓塞相关的疾病。所述药物或药学组合物包含本揭示内容生物分子，以及一药学上可接受的赋形剂，其中该生物分子包含一合成肽，以及一治疗剂，其中该治疗剂是与该合成肽复合。较佳地，所述治疗剂是一抗凝血剂或一溶血栓剂。
一般来说，本揭示内容生物分子的重量约占本揭示内容药物或药学组合物总重量的0.01％至99.9％。在某些实施方式中，本揭示内容生物分子的重量约占本揭示内容药物或药学组合物总重量的至少0.1％。在某些实施方式中，本揭示内容生物分子的重量约占本揭示内容药物或药学组合物总重量的至少5％。在再其他实施方式中，本揭示内容生物分子的重量约占本揭示内容药物或药学组合物总重量的至少10％。在又再其他实施方式中，本揭示内容生物分子的重量约占本揭示内容药物或药学组合物总重量的至少25％。
依据投予路径的不同，所述药物或药学组合物可包含不同类型的赋形剂或载体。本揭示内容药物或药学组合物可藉由静脉内、真皮内、动脉内、腹腔内、病灶内(intralesionally)、颅内(intracranially)、鼻腔内、胸腔内 (intrapleurally)、气管内(intratracheally)、直肠内(intrarectally)、局部性、肌肉内、皮下、血管内(intravesicularlly)、心包内(intrapericardially)、眼内 (intraocularally)、口服(orally)、部位性(locally)、注射、吸入、输入、部位性灌流(localized perfusion)等方式来投予，且可配制成粉末、乳膏剂、液体及喷雾剂等形式。
在某些实施方式中，本发明药物或药学组合物是配制成适用于口服给药的固体剂型。这类固体剂型可以是胶囊、小袋(sachets)、片剂(tablets)、丸剂(pills)、锭剂(lozengens)、粉末或颗粒剂(granules)。在这类剂型中，是将活性成分(如上文所述的任一种生物分子)与至少一药学上可接受的赋形剂混和。非必要性地，任一种所述的固体剂型可含有包衣(coatings)及外壳 (shells)，例如，肠包衣，以及用以修改任一种成分的释放率的包衣。这类包衣的实例为本领域所熟知。在一实施例中，本发明药物或药学组合物的是片剂，例如，速释(quick-release)片剂。在另一实施例中，本发明药物或药学组合物是配制成持续释放的剂型。在再另一实施例中，本发明药物或药学组合物是粉末，并包覆在软质及硬质的明胶胶囊中。
在某些实施方式中，本揭示内容药物或药学组合物是配制成适用于口服给药的液体剂型。所述液体剂型可进一步包含一缓冲剂，以利维持适当的 pH。所述液体剂型也可充填至软质的明胶胶囊中。举例来说，所述液体剂型可包含溶液、悬浮体、乳化剂、微乳液、沉淀物，或任一种欲求的液体介质，以利携带任一种上述的生物分子，或一药学上可接受的衍生物、其盐类或溶剂合物，或其组合物。所述液体剂型可经过设计以便改善上述活性生物分子的溶解度，例如，可形成含药的乳化剂或药物释放时的分散相。
在某些实施方式中，可将本揭示内容药物或药学组合物配制为适用于非口服给药的剂型，例如注射给药，其包括，但不限于，皮下、大剂量注射 (bolus injection)、肌肉内、腹腔内及静脉内注射。药物或药学组合物可配制成油性或水性的等张悬浮液、溶液或乳胶，且可包含处方药剂，例如，悬浮、稳定或分散药剂。或者是，药物或药学组合物可以制成干燥形式，例如，粉末、晶体或冷冻干燥的固体，并附与使用前为无菌且无热原(pyrogen-free)的水或等张生理食盐水。组合物亦可置于无菌的安瓶或小瓶中。
当本揭示内容生物分子是配制成静脉内、经皮或皮下注射等给药剂型时，可将肽制成无热原的非口服可接受的液体溶液。在考量到pH值、等张性及稳定性等因素下，本领域技术人员可理解如何制备该非口服可接受的液体溶液。除了本揭示内容生物分子以外，较佳的用于静脉内、经皮或皮下注射的药物或药学组合物应包含一等张赋形剂，例如，氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖及氯化钠注射液、乳酸林格氏注射液或其他习知的赋形剂。本揭示内容药物或药学组合物亦可包含稳定剂、防腐剂、缓冲液、抗氧化剂或其他本领域技术人员所知的添加剂。静脉投予本揭示内容药物或药学组合物的间隔时间，会随着疾病的严重程度及每个个体的状况与潜在特异反应的不同而有所差异。在连续静脉内投予时，每次投予本揭示内容生物分子的间隔时间可以是12到24小时。最终会由主治医师决定静脉治疗的疗程。
可将本揭示内容生物分子配制成生理上可接受的剂型，以用于局部性、全身性，或部位性的投药。举例来说，可将本揭示内容生物分子施用于植体 (implant)或装置的表面。进一步地，可视需要来将组合物包覆或注射进一种粘性剂型中，以利递送至血栓。如上所述，可将其他有用的药剂包含进本揭示内容药物或药学组合物中，或是可将本揭示内容药物或药学组合物同时或依序投药。
本揭示内容的另一方面是关于一种利用本揭示内容生物分子来预防及 /或治疗一有需要的个体的血栓或与栓塞相关的疾病的方法，其中该生物分子包含一合成肽及一治疗剂，且该治疗剂是与该合成肽复合。该方法包含，对该个体投予一有效量的所述生物分子，或包含该生物分子的药物或药学组合物。
本揭示内容生物分子、药物或药学组合物的有效剂量会随着许多因素而有所变化，例如，所欲治疗的特定病症、病症严重性、病患个别的参数(包括年龄、生理条件、个体大小、性别及体重)、接受治疗的持续时间、并行的疗法的本质(若有的话)、具体的投药途径等，将由医疗人员凭所掌握的专业知识及经验来决定。
在一实施方式中，所述个体是小鼠。为在小鼠中引起治疗功效，可对小鼠投予本揭示内容生物分子每剂约0.1至100毫克/公斤(例如，0.1、0.2、0.3、 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、99，或100毫克/公斤)体重的剂量；较佳地，是投予本揭示内容生物分子每剂约0.5至50毫克/公斤体重的剂量；更佳地，是投予本揭示内容生物分子每剂约1至20毫克/公斤体重的剂量。依据一操作实施例，投予本揭示内容生物分子每剂约2至10毫克/公斤体重的剂量已足以在个体中引起治疗功效 (例如，血栓体积的减少，或血流的恢复)。
本领域技术人员能够基于动物模式所得到的剂量，来换算本揭示内容生物分子的人体等效剂量(human equivalent dose，HED)。据此，本揭示内容生物分子用于人体的有效剂量可介于每剂10微克/公斤至10毫克/公斤(例如， 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、 400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900，或950微克/公斤，或1、2、3、4、5、6、7、8、9，或10毫克/公斤)体重之间的剂量；较佳地，是每剂50微克/公斤至5毫克/公斤体重的剂量；更佳地，有效的HED 约为每剂100至1,000微克/公斤。
当可理解，本揭示内容方法施用于个体时，可单独施用或与其他的疗法并用，所述疗法是对于预防或治疗血栓或与栓塞相关的疾病具有某些有利功效的疗法。依据使用目的的不同，可在投予所述其他疗法的前、中、后，对该个体施用本揭示内容方法。
所述与栓塞相关的疾病可以是缺血性心脏疾病(例如，心肌梗塞)、肢体缺血、静脉栓塞(VTE，包括深层静脉栓塞(deep vein thromboembolism，DVT) 及肺栓塞(pulmonaryembolism，PE))、动脉栓塞(arterial thromboembolism， ATE)、肿瘤、溶血性贫血(hemolytic anemia)、发炎、败血症、肾上腺皮质机能亢进症(hyperadrenocorticism)、脑血管疾病(例如，中风)，或其他与血栓相关的疾病或病症，或由血栓所引起的疾病或病症。
本揭示内容的进一步方面是关于一种利用本揭示内容生物分子来确认一有需要的个体体内是否存在血栓或栓塞，或确认其位置的方法(例如，一个体具有或疑似具有血栓或栓塞)，其中该生物分子包含一合成肽，并且与一报导分子复合。该方法包含，对该个体投予一有效量的所述生物分子，并侦测该报导分子的讯号，进而确认血栓或栓塞是否存在或确认其位置。
依据本揭示内容特定的操作实施例，所述个体是小鼠，其中是对小鼠投予本揭示内容生物分子每剂约为1至20毫克/公斤体重的剂量，以确认是否存在血栓或确认其位置。本领域技术人员可容易地基于本说明书的操作实施例中所提供的动物模式所得到的剂量，来换算本揭示内容生物分子的HED。
除了人类与小鼠以外，所述个体可以是其他替代性的哺乳动物，举例来说，大鼠、仓鼠、天竺鼠、兔子、狗、猫、乳牛、山羊、绵羊、猴子，以及马。
下文提出多个实施例来说明本揭示内容的某些方面，以利本发明所属领域技术具有通常知识者实践本发明。不应将此等实施例视为对本发明范围的限制。据信本发明所属领域普通技术人员在阅读此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本揭示内容。本文引用的所有公开文献在此藉由引用而并入全文。
实施例
材料及方法
噬菌体展示法生物淘选
从一具约20年前死亡的尸体(该尸体曾历经新鲜剖尸的程序)中分离并收集人类血栓，并将部分的血栓磨碎成粉末，接着在4℃下与2×1011只噬菌体(在1％的BSA(溶于PBS中)中)反应1小时。在以PBS清洗后，将有结合的噬菌体从血栓组织洗提出来，并利用E.coli扩增，以便进行后续的选汰回合之用。将该些经洗提并扩增的噬菌体进行滴定，是利用含有异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)及X-Gal(5-溴基-4-氯基-3-吲哚基-D-半乳糖苷)的溶菌肉汤(lysogeny broth，LB)培养盘来进行。上述生物淘选的步骤是重复五次，接着随机选取噬菌体克隆株并进行血栓 ELISA筛选检测。
以ELISA筛选具有血栓结合活性的噬菌体
将磨碎的人类血栓组织或BSA(溶于涂布缓冲液(coating buffer)中)涂布在96孔的ELISA微量盘中过夜。在进行封闭及清洗后，将所选取的噬菌体克隆株加入，并在室温下(room temperature，RT)反应1小时。在以PBS清洗后，各孔加入作为探针的与山葵过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)复合的小鼠抗-M13抗体(1：2000稀释)在RT下反应1小时。在重复清洗的步骤后，将培养盘以ELISA基质溶液进行呈色。以3N的盐酸终止反应，接着利用微量盘分析仪分析呈色基质于450纳米的吸光度。
流式细胞技术分析
收集小鼠全血，并将HUVEC细胞(2×105至2×106个细胞)与所选取的噬菌体(5×109至5×1010pfu)在4℃下反应1小时。接着，将样本与抗-M13单株抗体在4℃下反应1小时，再与FITC或PE复合的抗-小鼠Fab的Ab在4℃下反应 30分钟。利用流式细胞技术分析荧光概况。FITC及PE是以488纳米的雷射来激发，并分别以绿色闸道滤镜(530/30)及黄色闸道滤镜(585/42)来测量荧光发射波长。
活体内导航(homing)实验
将小鼠麻醉，并藉由嵌入含有10％的FeCl3的纸张至右颈静脉中5至10 分钟来诱发血栓。接着将小鼠以静脉内注射5×109pfu的噬菌体。在反应10 分钟后，将小鼠牺牲，并以50毫升的PBS灌流来移除未结合的噬菌体。收集小鼠器官及血栓，并将样本中的噬菌体以E.coli细胞并于IPTG/X-Gal培养盘中进行滴定。进一步地，是将血栓及器官包埋于组织冷冻包埋剂(optimal cutting temperature，OCT)复合物中，以制备用于免疫组织化学的切片。
免疫组织化学染色
将活体内噬菌体导航实验所收集的组织样本进行切片，并置于载玻片上，移除OCT，并将样本以4％的聚甲醛来固定，接着将样本与1％的BSA反应30分钟，以阻断非专一性的结合。在清洗后，将切片与小鼠抗-M13抗体 (1：250稀释)反应1小时，再以含聚合物的SUPER SENSITIVETMIHC侦测系统处理。简言之，将切片与超级增强试剂(Super Enhancerreagent)反应20分钟，并与聚HRP试剂反应30分钟。利用DAB来作为显色剂，以进行过氧化酶显影，并将样本以苏木精进行对比染色，封固于封固剂中，并以光学显微镜进行镜检。
tPA及肽-tPA融合蛋白的建构、表达及纯化
将人类重组tPA及与肽融合的tPA克隆至一表达载体中。个别将质体转染至293细胞中，并将经转染的细胞在37℃下持续培养在无血清的培养基中 1周，以制备重组蛋白。接下来，收集培养液、离心，并以0.45微米的滤膜过滤。将上清液中的蛋白以管柱层析法进行纯化。在以PBS透析产物后，将纯化的蛋白以SDS-PAGE并以考马斯亮蓝染色检验。将蛋白浓度也进行评估。
tPA及标的性肽-tPA融合蛋白的活性
为利用荧光动力学ELISA来测量tPA蛋白活性，将5纳克/微升的tPA或标的性肽-tPA融合蛋白与100微体积摩尔浓度的Z-Gly-Gly-Arg-AMC肽基质混和(溶于分析缓冲液(50毫体积摩尔浓度的Tris，0.01％的Tween-20，pH 8.5) 中)。利用荧光分光光度计，并以380纳米的激发波长及460纳米的发射波长来测量酶活性。
血栓中tPA及标的性肽-tPA融合蛋白的定位
将50毫克的tPA或标的性肽-tPA融合蛋白与4纳体积摩尔浓度的 HILYTEFLUORTM750在RT下混和45分钟，以促进偶联反应。将溶液以3.5 千道耳顿的截止(cut-off)膜在4℃下透析过夜。在以静脉内注射HILYTE FLUORTM750标记的tPA或标的性肽-tPA融合蛋白至具有血栓的小鼠后，进行时程荧光(time-course fluorescence)的测量。利用一影像系统来撷取荧光影像图。藉由减去背景荧光强度来定量血栓中HILYTE FLUORTM750的累积量。
活体小鼠的活体内红外线荧光影像
将50毫克的血栓亲和性的肽-tPA与4纳体积摩尔浓度的HILYTE FLUORTM750在RT下避光混和45分钟，以促进偶联反应。以3.5千道耳顿的截止膜在4℃下透析过夜来移除多余的染剂。在以静脉内注射HILYTE FLUORTM750复合的融合蛋白或tPA后，取得红外线荧光影像图的时程变化。利用一影像系统来撷取活体中HILYTE FLUORTM750复合的蛋白的红外线荧光影像图。将所诱发的血栓中HILYTE FLUORTM750的荧光讯号累积量进行定量，并以软体分析。
以雷射都卜勒流量计来测量血流量
将小鼠以仰卧摆位放在37℃的保温垫上，并以异氟醚麻醉。测量通过右颈外静脉血栓的血流量20分钟，接着注射tPA或标的性肽-tPA融合蛋白 (2-10毫克/公斤)。在注射tPA或标的性肽-tPA融合蛋白前，立即利用雷射都卜扫描器来评估血流量，并持续至整个实验期间结束为止。
以回声感测器来测量血流量
测量通过右颈内动脉血栓的血流。将小鼠以阿佛丁(avertin)麻醉，接着保持在异氟醚中进行外科手术。在注射tPA或标的性肽-tPA(2-10毫克/公斤) 融合蛋白前，利用成色都卜勒(color Doppler)来分析血流量，并持续至整个实验期间结束为止。
MCAO动物模式及磁振造影(MRI)分析
本实验揭示小鼠MCAO模式的建立方法，并稍作修改。简言之，将10 周大的C57BL/6小鼠称重，并以10％异氟醚麻醉。将颈部前方的皮肤切除，以暴露出总颈动脉、内颈动脉及外颈动脉，该些部位是由迷走神经所区隔。将血管夹置于总颈动脉分枝部的上游，并造成内颈动脉上的小型进口。利用尼龙缝线来堵塞中颈动脉45分钟，接着移除缝线。以雷射都卜勒流量计来确认本模式是否成功，且脑中内颈动脉的血流量可减量超过30％。利用一水平镗孔(bore horizontal)式的MRI系统来拍摄给药后24小时的小鼠脑部。拍摄对比式T2加权的自旋回声影像图(TR＝400毫秒，TE＝10.8毫秒，FOV＝2×2 公分，NEX＝8，切片厚度为0.8毫米)。藉由将ROI(平均像素强度)的讯号除以背景杂讯的标准差来计算讯噪比(SNR)。
实施例1鉴定及特性分析新颖肽
1.1以噬菌体展示技术筛选出新颖肽
为鉴别可专一性标的至血栓的肽，利用噬菌体展示肽库来筛选出可结合至血栓的肽。在五回合的生物淘选后，会结合至血栓的噬菌体的效价可增加至106倍(图1A)。从第五回合的生物淘选中筛选出72株的噬菌体克隆株，并基于其所展现出的相对高度结合亲和力，而选出噬菌体克隆株PC30、 PC39、PC44、PC45及PC66(图1B)。为避免筛选出非专一性结合至非血栓组织的肽，遂利用全血细胞及HUVEC作为负控制组，并以流式细胞技术来进行对比筛选(实验数据未显示)。依据ELISA所进行的剂量依赖性结合活性数据分析，显示出噬菌体克隆株PC30(FQNEWFHNFLHD；SEQ ID NO：1)、PC39(TEANLSSWVFAR；SEQ ID NO：2)，以及PC66(LQKNPFDLVQIL； SEQ ID NO：3)可展现出最佳的血栓专一性结合活性(图1C)，其中并以对 BSA的结合活性作为负控制组(图1D)。
1.2活体内确认所选出的肽的结合活性
为确认三株所选出的噬菌体对活体内血栓的结合活性，将在实施例1.1 中所选出的噬菌体注射至在右颈静脉已诱发血栓的小鼠(图2A)中。ELISA结果(图2B)及噬菌体效价分析结果(图2C)皆显示出噬菌体会高度累积在所诱发的血栓中，而其他器官，例如，脑部、肺脏、心脏、肝脏，以及肾脏仅有低度非专一性的噬菌体结合活性。免疫组织化学数据也确认，所选出的噬菌体仅会出现在血栓中，而在正常器官中无法侦测到(图3)。
实施例2制备及特性分析SP30/SP66-tPA融合蛋白
2.1制备融合蛋白
为使tPA在活体内专一性标的至血栓，本实施例因此建构融合蛋白。所述融合蛋白自N端至C端包含：来自小鼠Ig卡帕链的分泌信号肽、所选取的血栓结合性肽(来自PC30或PC66)、可挠性富含甘氨酸的连接子(GGGGS)、 tPA、myc标签(以便侦测)，以及His标签(以便纯化)。来自PC30及PC66噬菌体克隆株的标的血栓的肽以下分别命名为SP30及SP66。
在表达及纯化后，将融合蛋白以凝胶电泳进行分析。考马斯亮蓝染色结果(图4的A小图)及免疫印迹分析结果(利用专一性对抗tPA的抗血清)(图4 的B小图)均指出，在电泳中，两种血栓专一性结合活性的肽融合蛋白具有相似的移行能力，两者并无可观察到的差异性存在。
接下来，利用Z-Gly-Gly-Arg-AMC的基质进行酶活性分析，以确认加入血栓亲和性肽不会减损tPA的活性。酶活性分析显示出，加入血栓结合性肽不会影响tPA的活性(图4的C小图)。
2.2活体内血栓中的SP30/SP66-tPA生物分布
在本实施例中，将一种红外线荧光探针(HILYTE FLUORTM750)与 SP30-tPA及SP66-tPA偶联，据以直接监测活体小鼠中SP30/SP66-tPA的位置，以及其局部浓度。
在进行红外线荧光的活体影像前，对已诱发血栓的小鼠以静脉内注射与染剂复合的SP30-tPA及SP66-tPA(图5A)。在注射后的特定时间点上拍摄影像。与染剂复合的tPA(即不含血栓结合肽者)是作为负控制组。实验结果指出，在注射后5分钟内，tPA控制组会累积在诱发血栓处，但荧光强度会在1 小时内减量50％(图5B)。反之，相较于tPA，注射血栓结合肽-tPA融合蛋白的小鼠在注射后5分钟内会具有两倍的多的荧光，且在注射后1小时内，荧光可保持在类似的量(图5B)。
上述实验结果证明，SP30及SP66标的肽可作为有效的工具，以使tPA 集中并保持在血栓部位。
2.3活体内MCAO小鼠模式
为检验在中风疾病模式中，血栓结合肽-tPA融合蛋白是否比tPA更能恢复血流量的目的，本实施例遂使用小鼠MCAO模式。首先进行MCAO程序，接着将小鼠以tPA或SP30/SP66-tPA融合蛋白来治疗。依据投药后24小时的 MCAO小鼠脑部T2加权的MRI结果，注射SP30-tPA的小鼠的大脑梗塞区域，比注射控制组(PBS)或单独tPA的小鼠更低(图6)。该些结果证明，将tPA标的至血栓，可改善tPA对抗中风所引发的组织损伤的功效。
总结上述，本揭示内容提供三种新颖肽，分别包含FQNEWFHNFLHD (SEQ ID NO:1)、TEANLSSWVFAR(SEQ ID NO:2)，以及LQKNPFDLVQIL (SEQ ID NO:3)的氨基酸序列。依据本揭示内容的实施例，各肽能够专一性结合至血栓，因此，各肽可作为一种用以递送一治疗剂(例如，tPA)至血栓处的标的元件，据以改善该治疗剂的治疗安全性及有效性。
当可理解，上文有关实施方式的叙述仅作为例示性的实施方式，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可对其进行各种更动与修饰。上文的说明书，实施例及实验数据对本揭示内容作为例示性实施方式中的结构及使用方式做出完整的描述。尽管上文已描述本揭示内容中各样的实施方式有一定程度的特性，或参照一或多个个别的实施方式，本发明所属领域技术具有通常知识者仍可在不悖离本揭示内容精神及范围的情形下，对已揭示的实施方式进行众多修改。
序列表
<110> 中央研究院
<120> 合成肽，包含该合成肽的药学组合物，以及其在治疗与栓塞相关的疾病中的用途
<130> P4047-CN
<150> US62/821,982
<151> 2019-03-21
<160> 4
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 1
Phe Gln Asn Glu Trp Phe His Asn Phe Leu His Asp
1 5 10
<210> 2
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Gly Gly Gly Gly Ser
1 5