阅读说明：本技术 基于鼠源天然单链抗体库筛选识别CIM-ScFv抗体的多肽序列及其应用 (Polypeptide sequence for screening and identifying CIM-ScFv antibody based on murine natural single-chain antibody library and application thereof ) 是由 王选年 岳锋 司艳芳 郭东光 齐永华 潘鹏涛 李鹏 孙国鹏 朱艳平 于 2020-05-19 设计创作，主要内容包括：基于鼠源天然单链抗体库筛选识别CIM-ScFv抗体的多肽序列及其应用,多肽序列的重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO.1所示序列：ARWTVITYAMDY,轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示序列：QNGHSFPYT,多肽序列在西马特罗抗原鉴定中的应用。本发明对获得的单链抗体进行质量评价,四轮筛选中噬菌体回收率一直呈增加的趋势,说明随着淘选次数的增加,特异性的噬菌体抗体得到了有效富,与西马特罗抗原进行亲和力鉴定,亲和力较好,可应用于西马特罗抗原的快速检测试剂的生产中,丰富西马特罗等β2型受体激动剂的残留检测方法,为进一步制备西马特罗的抗体和抗体进化奠定物质基础,为西马特罗等非法添加物的控制使用提供参考,以满足公众对无残留动物肉制品的要求。(The polypeptide sequence for screening and identifying the CIM-ScFv antibody based on the murine natural single chain antibody library and the application thereof, wherein the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the polypeptide sequence is shown as the sequence in SEQ ID NO. 1: ARWTVITYAMDY, the amino acid sequence of the light chain variable region is shown as SEQ ID NO. 2: QNGHSFPYT, application of the polypeptide sequence in cimaterol antigen identification. The invention carries out quality evaluation on the obtained single-chain antibody, the phage recovery rate in four-round screening is always in an increasing trend, which shows that the specific phage antibody is effectively enriched along with the increase of the elutriation times, the affinity identification is carried out on the phage antibody and the cimaterol antigen, the affinity is better, the invention can be applied to the production of a rapid detection reagent of the cimaterol antigen, the residue detection method of the cimaterol and other beta 2-type receptor agonists is enriched, a material basis is laid for further preparation of the cimaterol antibody and antibody evolution, a reference is provided for the control and use of cimaterol and other illegal additives, and the requirement of the public on residue-free animal meat products is met.)

基于鼠源天然单链抗体库筛选识别CIM-ScFv抗体的多肽序列 及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体属于基于鼠源天然单链抗体库筛选识别CIM-ScFv抗体的多肽序列及其应用。

背景技术

西马特罗（CIM），不法饲养企业常用其代替克罗特伦作为新型“瘦肉精”使用。已经证明，CIM药物残留在动物食用组织（如肺，肝，肾和肌肉等）会对消费者健康构成潜在风险。CIM作为家畜生长促进剂的用途在许多国家和地区已被禁止，但是为了提高经济利润，滥用CIM的行为在各地仍然很普遍。为了辅助解决食品安全问题及改善非法添加物在我国明令禁止而屡禁不止的现象，继续完善药残监控体系，本研究基于鼠源天然单链抗体库筛选识别CIM-ScFv抗体的多肽序列，旨在丰富西马特罗等β2型受体激动剂的残留检测方法，为西马特罗农兽药残留的免疫学检测试剂的制备提供原材料，而为其他小分子半抗原的重组抗体的研制奠定科学的基础，为进一步制备西马特罗的抗体和抗体进化奠定物质基础，为西马特罗等非法添加物的控制使用提供参考，以满足公众对无残留动物肉制品的要求。

发明内容

本发明的目的是提供基于鼠源天然单链抗体库筛选识别CIM-ScFv抗体的多肽序列及其应用，本发明首先制备鼠源单克隆抗体库，以期从中筛选出抗西马特罗重组抗体，通过可溶性ScFv的竞争抑制ELISA标准曲线结果，表明带有该多肽序列的噬菌体抗体与相应靶标抗原在3~243 ng/mL范围内有良好的拟合程度，由此证明，本发明设计的多肽序列，可用于对西马特罗药物残留进行定量和定性的快速检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

基于鼠源天然单链抗体库筛选识别CIM-ScFv抗体的多肽序列，其特征在于：所述多肽序列的重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO .1所示序列：ARWTVITYAMDY，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示序列：QNGHSFPYT。

基于鼠源天然单链抗体库筛选识别CIM-ScFv抗体的多肽序列在西马特罗抗原鉴定中的应用。

于鼠源天然单链抗体库筛选识别CIM-ScFv抗体的多肽序列在西马特罗抗原的快速检测中的应用。

基于鼠源天然单链抗体库筛选识别CIM-ScFv抗体的多肽序列在制备用于检测样品中西马特罗残留的试剂盒中的用途。

进一步优选地，所述样品包括但不限于动物组织、尿液和饲料。

进一步地，所述试剂盒包括但不局限ELISA试剂盒。

基于鼠源天然单链抗体库筛选识别CIM-ScFv抗体的多肽序列在免疫相关诊断产品中的应用。

更加优选地，所述免疫相关诊断产品包括但不限WB试剂盒、 ELISA试剂盒、胶体金试剂条和荧光诊断试剂

与现有技术相比本发明具有以下特点和有益效果

本发明提供的如SEQ ID NO .1所示序列：ARWTVITYAMDY，和如SEQ ID NO .2所示序列：QNGHSFPYT，特异性较好，可根据上述序列快速合成西马特罗抗体，实现快速的人工合成。

本发明首先设计引物扩增小鼠抗体基因可变区，合成其单链抗体，构建重组噬菌粒pCANTAB-5E-ScFv，电转化至宿主菌TG1中，辅助噬菌体M13K07救援后，获得鼠源噬菌体单链抗体库，经鉴定后，以西马特罗完全抗原为靶标，经过四轮筛选，对获得的单链抗体进行质量评价，四轮筛选中噬菌体回收率一直呈增加的趋势，说明随着淘选次数的增加，特异性的噬菌体抗体得到了有效富集，与西马特罗抗原进行亲和力鉴定，亲和力较好，可应用于西马特罗抗原的快速检测试剂的生产中，丰富西马特罗等β2型受体激动剂的残留检测方法，为进一步制备西马特罗的抗体和抗体进化奠定物质基础，为西马特罗等非法添加物的控制使用提供参考，以满足公众对无残留动物肉制品的要求。

附图说明

图1特异性的噬菌体抗体四次有效富集图示；

图2为小鼠RNA电泳结果图示；

图3为 VH与VL的电泳结果图示；

图4 SOE-PCR拼接ScFv抗体基因图示；

图5 ScFv扩增的电泳结果图示；

图6测定抗体库滴度试验结果图示；

图7可溶性ScFv的SDS-PAGE检测结果图示；

图8可溶性ScFv的ic-ELISA检测结果图示。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创新特征、达成目的与功效易于明白了解，下面对本发明进一步说明。

在此记载的实施例为本发明的特定的具体实施方式，用于说明本发明的构思，均是解释性和示例性的，不应解释为对本发明实施方式及本发明范围的限制。除在此记载的实施例外，本领域技术人员还能够基于本申请权利要求书和说明书所公开的内容采用显而易见的其它技术方案，这些技术方案包括采用对在此记载的实施例的做出任何显而易见的替换和修改

本发明首先从未免疫健康BABL/c小鼠的新鲜脾组织中提取总RNA，然后通过RT-PCR扩增总抗体可变区cDNA。利用编码五肽(Gly₄Ser)₃的DNA linker，将VH和VL基因的纯化产物，组装成完整的小鼠ScFv抗体基因。最后将重组ScFv片段克隆到噬菌体pCANTAB-5E载体上，电穿孔转入大肠杆菌TG1中，通过辅助噬菌体M13KO7的再感染，获得了具有功能的单链片段可变区（ScFv）的鼠源重组噬菌体抗体文库，经鉴定后，以西马特罗完全抗原为靶标，经过四轮筛选，对获得的单链抗体进行质量评价，以每轮的噬菌体回收率为纵坐标作图，如图1所示，噬菌体回收率一直呈增加的趋势，说明随着淘选次数的增加，特异性的噬菌体抗体得到了有效富集，挑取单菌落扩大培养，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序引物为pCANTAB-5E通用引物S1及S6，去掉酶切位点及保护碱基后经过MIGT数据库预测，得出本发明SEQ ID NO .1所示序列和SEQ ID NO .2所示序列，同时对筛选出的13-CIM-ScFv的阳性噬菌体克隆进行可溶性表达及性质鉴定，经鉴定该杂交瘤细胞株产生的可溶性ScFv抗体对CIM的效价为1:320左右，具有较高的抗体效价，抗体亚型为IgG1，抗体亲和力高，可用于西马特罗药物残留的检测，可溶性ScFv抗体与抗原CIM特异反应，而与BSA、OVA没有反应，说明13号噬菌体（13-CIM-ScFv）抗体对CIM有良好的特异性。

下面对本发明所涉及的实验内容进行详细描述：

1、获取单链片段可变区（ScFv）的鼠源重组噬菌体抗体文库；

1.1小鼠RNA的提取及鉴定

选取6-8周龄健康未免疫的小鼠一只，将其固定在干净的蜡盘上，腹部朝上。用酒精棉球对其腹部消毒之后，准备两套灭菌的剪刀镊子，其中一套用于剪开皮肤，另一套用与剪开腹膜后取出脾脏。取出脾脏后用剪刀去除粘连的组织，将完整的脾脏迅速转移至-80 ℃预冷的研钵（已高压灭菌）中，研磨的过程中可以适当补加少量液氮使研磨更充分。此过程注意低温，防止RNA降解，破坏基因完整性。将裂解充分的脾脏组织按照试剂盒的操作步骤提取RNA。

将提取的RNA用TE缓冲液或RNAase-free Water稀释10倍，将稀释液用微量蛋白核酸分析仪进行初步鉴定，用TE缓冲液或RNAase-free Water作为空白样品反复矫零3次后，将触头擦干等待检测，记录A260/A280的比值及核酸浓度；最后取5 μL RNA稀释液与1 μL 6×Loading buffer混合上样，电压150 v，15 min后，用凝胶成像仪紫外成像查看结果。完整的RNA进行琼脂糖电泳时，会出现28S和18S rRNA两条条带且前者亮度比后者强一倍左右，具体结果如图2所示，可知提取的RNA完整性良好，可用于后续PCR扩增反应。

1.2小鼠cDNA第一链的合成

将鉴定完整的RNA在冰上按照反转录试剂盒说明书配制RT反应液，将反应液混匀之后，在PCR中设置PCR反应，将反应完成的cDNA直接用于目的片段的扩增，或存于-20 ℃备用。

1.3引物设计与合成

用NCBI、IMGT数据库下载小鼠抗体基因，利用DNAMAN软件对比分析鼠源抗体可变区核酸序列，使用Primer 5.0软件设计特异性引物用于扩增BABL/c小鼠重链可变区（VH），轻链可变区（VL）基因。

1.4 VH与VL的合成

以cDNA第一链为模板，PCR扩增分别合成鼠源基因的VH和VL，准备PCR反应体系，用于可变区扩增的 VH 或 VL 引物均为混合引物，根据引物的简并度计算混合引物中各引物的相对比例，以使由简并碱基所代表的每一独特引物的使用量相等。反应溶液涡旋混匀，短暂离心后，进行PCR 扩增反应，PCR扩增产物电泳鉴定，结果如图3所示，之后对 PCR扩增产物进行回收，回收产物存放在-20℃，VH片段大小为432 bp（图3中A图），VL片段大小为312 bp（图3中B图），与预期结果相符，可以用于ScFv的合成。

由表1可知，VH游引物与VL上游引物之间有30bp的互补重叠区域，因此可以利用重叠延伸PCR法（Splicing overlap extension polymerase chain reaction,SOE-PCR），如图4所示，将上述VH和VL回收产物在无引物情况下连接起来（图4中SOE-P1所示），组装成ScFv基因产物，而后补加引物大量扩增ScFv抗体基因片段（图4中SOE-P2所示）。因此将上述VH、VL大量扩增后，通过胶回收试剂盒回收纯化，采用SOE-PCR法合成ScFv全长基因，结果如图5所示，片段大小约为780 bp，电泳鉴定后，大量扩增并回收，回收产物即为小鼠单链抗体基因。取灭菌的PCR微量反应管配制PCR反应液，PCR扩增产物-20 ℃保存，用于鉴定和重组载体的构建。

1.5噬菌体抗体库的构建

1.5.1重组载体pCANTAB-5E-ScFv的制备

将纯化的ScFv基因与载体pCANTAB-5E连接，构建重组噬菌体载体。配置连接体系并混匀后于16 ℃低温水浴锅中连接10~12 h。将连接产物加入至TG1电转感受态细胞中，立即将该混合物转至干净、干燥，提前预冷的电击杯中，进行电转化。

电击结束后，立即向点击杯中加入1 mL SOC培养基（37 ℃预热，营养成分高于普通培养基）轻轻吹打，转移至新的摇菌管中，37 ℃ 200 rpm震荡培养1 h使菌种复壮；离心5000 rpm，5 min，保留约200 μL上清，其余上清弃去，重悬菌体后涂布在2×YT-A固体培养基上（含氨苄青霉素100 μg/mL），然后倒置放置于37 ℃恒温培养箱中过夜培养。

次日，从平皿中挑取边缘清晰的单菌落，于5 mL 2×YT-A液体培养基中，37 ℃，180 rpm培养过夜。取震荡培养后的菌液1 mL，离心后弃上清，20 μL无菌水重悬菌体，作为反应的模板进行PCR鉴定。引物为ScFvForSfiI、ScFvRevNot1，反应体系及反应程序同SOE-PCR。

1.6抗体库滴度的测定

（1）将救援后的噬菌体抗体库用2×YT培养液（或PBS缓冲液）稀释，操作如下：99 µL的2×YT培养液加入1 µL抗体库原液（1:100稀释），混匀。取以上混合液10 µL于90 µL的2×YT培养液中，即为1000倍稀释后的噬菌体溶液，以此依稀诸多数量级，恰当准确的稀释是出现良好梯度现象的关键。

（2）从数量级10²、10⁴、10⁶、10⁸稀释液中取出10 µL，分别加入90 µL的TG1培养液（OD600=0.4）中，37 ℃共同培养30 min（同M13K07滴度测定），再与3 mL的顶层琼脂混匀后，倒入2×YT-KA平板中，次日计算平板上噬菌斑数。与此同时设置阴性对照，将没有加入抗体库的对数期TG1培养液100 µL按照同样的方式培养。平板上的菌落数随噬菌体库的稀释倍数增大而减小，未加入噬菌体的TG1平板无单菌落则说明结果可信，如果不是，则需要重新挑取噬菌斑重复噬菌体的构建及救援。

本实验抗体库稀释液在平皿上的生长情况如图6所示。抗体库经10⁸稀释后，平皿生长的有效单菌落个数为156个，则按照滴度计算公式，结果可知，本研究获得的噬菌体ScFv抗体库的滴度为1.56×10¹⁰ pfu。

2抗西马特罗单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达及性质鉴定

2.1 13-CIM-ScFv的可溶性表达

挑选分离良好，边缘清晰的单菌落，接种于5 mL2×YT-A培养基中，30 ℃，250 rpm 震荡培养过夜，次日取500 μL过夜培养物于50 mL2×YT-A培养基中，30 ℃，250 rpm 震荡培养至对数期。加入IPTG至终浓度为0.25、0.1、0.5 mmol/L，培养条件为30 ℃，采用不同的诱导条件，不同的诱导时间，诱导之后离心，10000 rpm，20 min收集沉淀，用2 mL预冷的TBS充分重悬，-20 ℃放置20 min，室温放置20 min，10000 rpm，20 min，将上清转移至新管备用，菌体用1 mL高渗提取液（冰上预冷）重悬，室温涡旋震荡10 min，4 ℃放置10 min后低温离心10000 rpm，20 min，弃上清，加入等体积已预冷的低渗缓冲液，低温轻柔搅拌30 min后离心，4 ℃，10000 rpm，20 min，保留上清，此上清含有分泌至细胞周质中的ScFv蛋白。

2.2可溶性ScFv的SDS-PAGE检测

将其样品处理后，分别对不同诱导条件的噬菌体阳性ScFv蛋白及对照菌的培养上清进行的SDS-PAGE电泳。空白对照没有条带，未诱导菌液上清杂带较多。诱导后的菌液均在30KDa左右出现蛋白条带，符合预期大小且条带较单一，没有过多杂蛋白。说明在大肠杆菌HB2151的细菌周质中存在抗西马特罗的ScFv抗体可溶性表达。由图7可知最佳诱导条件为0.1mmol/L IPTG、30℃、16h。选取该诱导条件作为大量制备13-CIM-ScFv的诱导条件。结果说明在表达过程中，该蛋白没有移码。

2.3可溶性ScFv的竞争抑制ELISA分析方法的初步建立

2.3.1纯化抗体的工作浓度测定

采用间接ELISA方法，测定分泌至细胞周质中的ScFv蛋白的效价。注：将周质腔提取抗体用一抗稀释液从1:5开始倍比稀释。二抗为Anti-E-tag（HRP）抗体1:4000稀释，阴性对照为pCANTAB-5E-HB2151。吸光值约为1.0且P/N比值大于2.1对应的稀释倍数为竞争抑制ELISA的ScFv蛋白的最适使用浓度。

结果显示该抗体均能与包被抗原反应。说明该单链抗体得到了正确的折叠和表达。如表1所示，大于阴性孔OD₄₅₀读数的2.1倍判为阳性孔，阳性孔对应的最大稀释倍数为该抗体的效价，由此可以判断，该抗体对CIM的效价为1:320左右。

表1间接ELISA法测定可溶性ScFv效价结果.

稀释倍数(Serum dilution)	1:5	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640	阴性对照(Negative control)
										OD<sub>450</sub>	1.173	1.013	0.883	0.662	0.490	0.370	0.298	0.203	0.133

2.3.2竞争抑制ELISA标准曲线的建立及灵敏度与最低检测限的测定

选取8个标准浓度建立标准曲线，以添加标准品对包被抗原50% 抑制浓度作为半数抑制浓度（IC50），IC50值越低说明抑制作用越低，则灵敏度越高。最低检测线的判定方法为抑制率90%时对应的小分子抑制品的浓度，带入标准曲线可以计算出该OD值对应的浓度数值为3.98 ng/mL。

具体地，选取可溶性抗体稀释倍数为1:10后作为一抗。通过对6个标准品浓度(1、3、9、27、81、243ng/mL）的对数及其对应的吸光值，建立的标准曲线为y = -0.2561x +1.0358 ，拟合度R² = 0.9848，如图8。用该噬菌体抗体建立的竞争ELISA方法的半数抑制浓度 IC50=101 ng/mL，最低检测限 LOD=3.16 ng/mL，在1~243 ng/mL范围内有良好的拟合程度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 新乡学院

<120> 基于鼠源天然单链抗体库筛选识别CIM-ScFv抗体的多肽序列及其应用

<130> 20200330

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Arg Trp Thr Val Ile Thr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr Thr

1 5