阅读说明：本技术 用于检测弯曲杆菌属细菌的抗体和测试设备 (Antibody and test device for detecting campylobacter bacteria ) 是由 奥斯卡·兰德塔·埃洛尔斯 尤兰达·加尔西亚·米格尔 胡安·安立奎·马丁内斯·奥利文 比阿特里斯 于 2018-10-02 设计创作，主要内容包括：本发明可以被包括在诊断学领域中。本发明提供用于检测样品中的弯曲杆菌属细菌的杂交瘤、抗体和测试设备。此外,本发明公开了所述抗体用于检测弯曲杆菌属细菌的用途以及用于检测弯曲杆菌属细菌的方法。本发明的抗体对于来自饥饿细胞的DNA结合蛋白(Dps)具有特异性并且当用于免疫层析测试设备中时与用于检测弯曲杆菌属细菌的其他抗体相比提供较少的假阳性和更高的灵敏性。(The present invention may be included in the field of diagnostics. The present invention provides hybridomas, antibodies, and test devices for detecting campylobacter bacteria in a sample. Further, the present invention discloses the use of said antibody for the detection of campylobacter bacteria and a method for the detection of campylobacter bacteria. The antibodies of the invention are specific for DNA binding proteins (Dps) from starved cells and provide fewer false positives and higher sensitivity when used in an immunochromatographic test device compared to other antibodies used to detect campylobacter bacteria.)

用于检测弯曲杆菌属细菌的抗体和测试设备

技术领域

本发明可以被包括在诊断学领域中。具体地，本发明提供对弯曲杆菌属(genusCampylobacter)细菌的来自饥饿细胞的DNA结合蛋白(Dps)具有特异性的抗体以及生产所述抗体的杂交瘤。所述抗体可用于免疫层析测试设备以及用于检测弯曲杆菌属细菌的方法。

背景技术

在人中，由弯曲杆菌物种引起的感染中的85％至95％涉及空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)，而其他案例中的大部分涉及大肠弯曲杆菌(Campylobactercoli)。在美国和欧洲，空肠弯曲杆菌是食物中毒的最常见的原因之一。绝大部分案例作为孤立事件而不是作为公认的部分爆发而出现。通过食源性疾病积极监测网络(FoodborneDiseases Active Surveillance Network，FoodNet)，积极监测指示人群中每年每100，000个人中诊断出约14个病例。欧洲食品***(European Food Safety Authority)在2011年估计每年在欧盟有约九百万例人弯曲杆菌病。

由弯曲杆菌物种引起的食物中毒可以是严重致衰的，但极少是致命的。其已与随后的格林-巴利综合征(Guillain-Barré syndrome)的发展相关联，格林-巴利综合征通常在初始疾病后两至三周发展。最近感染空肠弯曲杆菌的个体以0.3/1000例感染的比率(比一般人群的频率高约100倍)发展格林-巴利综合征。

因此，目前需要检测弯曲杆菌属的物种。之前用于检测粪便样品中的空肠弯曲杆菌的设备涉及使用检测空肠弯曲杆菌的表面蛋白的免疫层析测试设备(JP5467228B2；JP2009077658(A)；Granato等，2010.Comparison of premier CAMPY Enzyme Immnunoassay(EIA)，proSpecT Campylobacter EIA，and Immuno Card STAT！CAMPY test with culturefor laboratory diagnosis of campylobacter entericinfections.J.Clin.Microb.4022-4027)。然而，目前的检测设备面临缺少特异性，这可能导致假阳性(Bessede等，2011.New Methods for Detection of Campylobacters inStool samples in comparation to culture.J.Clin.Microb.941-944；Couturier等，2003.Detection of non-jejuni and campylobacter species from stool specimenswith an immunochromatographic antigen detection assay.J.Clin Microbiol.(6)：1935-7)。此外，这些设备可能面临缺少灵敏度。

需要测试设备，所述测试设备产生更少的假阳性并且比目前可获得的测试设备更灵敏。通过使用结合空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌的来自饥饿细胞的DNA结合蛋白(Dps)的抗体，本申请的发明人开发出了一种测试设备，所述测试设备产生更少的假阳性并且比目前可获得的其他设备更灵敏。

附图

图1：免疫层析测试设备的图。A)条带(strip)形式的免疫层析测试设备的俯视图。所述测试设备包括以下元件：吸收材料(1)，具有检测部分(3)和对照部分(4)的支持膜(2)，样品添加部分(5)和所述设备中包含标记的抗体的部分(6)。箭头指示流动方向。B)条带形式的免疫层析测试设备的侧视图。所述测试设备还包含塑料支撑物(7)。(c)免疫层析测试设备的成角度的侧视图。

发明内容

本发明提供特异性结合Dps的抗体，产生本发明的抗体的杂交瘤以及免疫层析测试设备，所述免疫层析测试设备包含：(a)第一抗体，所述第一抗体特异性结合Dps，(b)第二抗体，所述第二抗体特异性结合Dps，以及(c)支持膜，其中所述第一抗体被固定在所述支持膜上并且所述第二抗体是标记的。此外，本发明提供用于在分离的样品中检测弯曲杆菌属细菌的方法，所述方法包括将所述样品与本发明的测试设备接触，本发明的抗体用于检测弯曲杆菌属细菌的用途以及本发明的抗体用于制备免疫测定测试设备的用途。

具体实施方式

抗体

在第一方面，本发明提供特异性结合Dps的抗体。

如本文中使用的，术语“抗体”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质。术语抗体包括，例如，全长的成熟抗体和抗体的抗原结合片段。例如，抗体分子可以包含重(H)链可变结构域序列(本文中简写为VH)和轻(L)链可变结构域序列(本文中简写为VL)。在另一个实例中，抗体包含两个重(H)链可变结构域序列和两个轻(L)链可变结构域序列，由此形成两个抗原结合位点，如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fd、Fd’、Fv、单链抗体(例如scFv)、单可变结构域抗体、双抗体(Dab)(二价的和双特异性的)、以及嵌合(例如，人源化)抗体，这些抗体可以通过对完整抗体进行修饰而制备或者可以是使用重组DNA技术从头合成的那些。这些功能性抗体片段保持选择性结合其各自抗原或受体的能力。抗体和抗体片段可以来自任何类型的抗体，包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，并且可以来自抗体的任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。本发明的抗体可以是单克隆或多克隆的。所述抗体也可以是人、人源化、CDR嫁接或体外生成的抗体。所述抗体可以具有选自例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。所述抗体也可以具有选自例如κ或λ的轻链。抗原结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通过在铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)双抗体(dAb)片段，其由VH结构域组成；(vi)骆驼科或骆驼源化可变结构域；(vii)单链Fv(scFv)，参见例如，Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)；(viii)单结构域抗体。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段以使用。

术语“抗体”包括完整的分子。所述抗体的恒定区可以改变，例如，突变，以改变所述抗体的性质(例如，增加或减少以下一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数量、效应细胞功能或补体功能)。

抗体分子也可以是单结构域抗体。单结构域抗体可以包括其互补决定区是单结构域多肽的部分的抗体。实例包括但不限于重链抗体、天然缺少轻链的抗体、来源于常规4链抗体的单结构域抗体、改造的抗体和除了来源于抗体的那些以外的单结构域支架(scaffold)。单结构域抗体可以现有技术中的任一种，或是任何未来的单结构域抗体。单结构域抗体可以来源于任何物种包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、鱼、鲨、山羊、兔和牛。根据本发明的另一个方面，单结构域抗体是被称为缺少轻链的重链抗体的天然存在的单结构域抗体。例如WO 9404678中公开了此种单结构域抗体。为了清楚的原因，来源于天然缺少轻链的重链抗体的该可变结构域在本文中被称为VHH或纳米抗体(nanobody)以将其与四链免疫球蛋白的常规VH相区别。此种VHH分子可以来源于骆驼科物种中(例如在骆驼、美洲驼、单峰驼、羊驼和原驼中)产生的抗体。骆驼科以外的其他物种可以产生天然缺少轻链的重链抗体；此种VHH在本发明的范围内。

VH和VL区可被进一步划分为高可变性区域，其被称为“互补决定区”(CDR)，互补决定区间杂有被称为“框架区”(FR或FW)的更保守的区域。

框架区和CDR的范围已通过数种方法精确限定(参见，Kabat，E.A.等(1991)具有免疫学作用的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第五版，美国卫生与人力服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIHPublication No.91-3242；Chothia，C.等(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；以及OxfordMolecular的AbM抗体建模软件使用的AbM定义。总体上参见例如抗体工程实验室手册(Antibody Engineering Lab Manual)中的抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析(Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains)(编辑：Duebel，S和Kontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg)。

如本文中使用的术语“互补决定区”和“CDR”是指抗体可变区内提供抗原特异性和结合亲和性的氨基酸序列。通常，在各重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)并且在各轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。

给定的CDR的精确的氨基酸序列边界可以使用数种已知方案中的任一种来确定，包括Kabat等(1991)，“具有免疫学作用的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)”第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(“Kabat”编号方案)，Al-Lazikani等，(1997)JMB 273，927-948(“Chothia”编号方案)描述的那些。如本文中使用的，根据“Chothia”编号方案确定的CDR有时也被称为“高变环”。

如本文中使用的术语“单克隆抗体”是指单分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单结合特异性和亲和性。单克隆抗体可以通过杂交瘤技术或通过不使用杂交瘤技术的方法(例如，重组方法)来制备。

其抗体可以是多克隆或单克隆抗体。在其他实施方案中，所述抗体可以是重组制备的，例如，通过噬菌体展示或通过组合方法制备的。优选地，所述抗体是单克隆抗体。

用于产生抗体的噬菌体展示和组合方法是本领域中已知的(如描述于例如Ladner等美国专利号5,223,409；Kang等国际公布号WO 92/18619；Dower等国际公布号WO 91/17271；Winter等国际公布WO 92/20791；Markland等国际公布号WO 92/15679；Breitling等国际公布WO 93/01288；McCafferty等国际公布号WO 92/01047；Garrard等国际公布号WO92/09690；Ladner等国际公布号WO 90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等(1992)Hum Antibod Hybridomas 3：81-85；Huse等(1989)Science 246：1275-1281；Griffths等(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等(1992)J Mol Biol 226：889-896；Clackson等(1991)Nature 352：624-628；Gram等(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad等(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等(1991)Nuc Acid Res 19：4133-4137；及Barbas等(1991)PNAS 88：7978-7982，以上所有的内容都通过引用结合于本文中)。

在一个实施方案中，所述抗体是完全人抗体(例如，小鼠中制备的抗体，所述抗体已被遗传改造为由人免疫球蛋白序列产生抗体)，或非人抗体，例如，啮齿类动物(小鼠或大鼠)、山羊、灵长类动物(例如，猴)、骆驼抗体。优选地，所述非人抗体是啮齿类动物的(小鼠或大鼠抗体)。制备啮齿类动物抗体的方法是本领域中已知的。

人单克隆抗体可以使用带有人免疫球蛋白基因而非小鼠系统的转基因小鼠产生。将来自用目的抗原免疫的这些转基因小鼠的脾细胞用于制备分泌对来自人蛋白质的表位具有特定亲和性的人mAb的杂交瘤(参见，例如，Wood等，国际申请WO 91/00906，Kucherlapati等，PCT申请WO 91/10741；Lonberg等，国际申请WO 92/03918；Kay等，国际申请92/03917；Lonberg，N.等，1994Nature 368：856-859；Green，L.L.等，1994NatureGenet.7：13-21；Morrison，S.L.等，1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855；Bruggeman等，1993Year Immunol 7：33-40；Tuaillon等，1993PNAS 90：3720-3724；Bruggeman等1991Eur J Immunol 21：1323-1326)。

抗体可以是这样的抗体，其中可变区或其部分(例如CDR)在非人生物(例如大鼠或小鼠)中产生。嵌合抗体，CDR嫁接抗体和人源化抗体在本发明内。在非人生物(例如大鼠或小鼠)中产生然后被修饰(例如在可变框架或恒定区中)以降低在人中的抗原性的抗体在本发明内。

嵌合抗体可以通过本领域中已知的重组DNA技术制备(参见Robinson等，国际专利公布PCT/US86/02269；Akira，等，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等，欧洲专利申请173,494；Neuberger等，国际申请WO 86/01533；Cabilly等，美国专利号4,816,567；Cabilly等，欧洲专利申请125，023；Better等(1988Science 240：1041-1043)；Liu等(1987)PNAS 84：3439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.139：3521-3526；Sun等(1987)PNAS 84：214-218；Nishimura等，1987，Canc.Res.47：999-1005；Wood等(1985)Nature 314：446-449；及Shaw等，1988，J.Natl Cancer Inst.80：1553-1559)。

人源化或CDR嫁接抗体的至少一个或两个并且通常全部三个受体CDR(免疫球蛋白重和或轻链的)将被供体CDR替代。所述抗体可以用非人CDR的至少部分替代或仅某些所述CDR可以用非人CDR替代。唯一必要的是替代人源化抗体与Dsp结合所需的数目的CDR。优选地，所述供体将是啮齿类动物抗体，例如，大鼠或小鼠抗体，并且所述受体将是人框架或人共有框架。典型地，提供CDR的免疫球蛋白被称为“供体”而提供框架的免疫球蛋白被称为“受体”。在一个实施方案中，供体免疫球蛋白是非人(例如，啮齿类动物)免疫球蛋白。受体框架是天然存在的(例如，人)框架或共有框架，或与其具有约85％或更高，优选90％、95％、99％或更高同一性的序列。

如本文中使用的，术语“共有序列”是指由相关序列的家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如，Winnaker，由基因到克隆(From Genes to Clones)(Vetlagsgesellschaft，Weinheim，德国1987))。在蛋白质家族中，共有序列中的各位置被所述家族中最常出现在所述位置的氨基酸占据。如果两个氨基酸出现的频率相同，其中任一个可以被包括在共有序列中。“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。

抗体可以通过本领域中已知的方法人源化(参见例如，Mortison，S.L.，1985，Science 229：1202-1207，Oi等，1986，BioTechniques 4：214，以及Queen等US 5,585,089，US 5,693,761和US 5,693,762，以上所有的内容都通过引用结合于此)。

人源化或CDR嫁接抗体可以通过CDR嫁接(CDR-grafting)或CDR置换来制备，其中免疫球蛋白链的一个、两个或全部CDR可以被替代。参见例如，美国专利5,225,539；Jones等1986Nature 321：552-525；Verhoeyan等1988Science 239：1534；Beidler等1988J.Immunol.141：4053-4060；Winter US 5,225,539，以上所有的内容都通过引用清楚地结合于此。Winter描述了CDR嫁接方法，其可用于制备本发明的人源化抗体(英国专利申请GB 2188638A，提交于1987年3月26日；Winter US 5,225,539)，其内容通过引用清楚地结合于此。

同样在本发明范围内的是特定氨基酸已被取代、缺失或添加的人源化抗体。选择来自供体的氨基酸的标准描述于US 5,585,089，例如，US 5,585,089的12-16列，例如，US5,585,089的12-16列，其内容通过引用结合于此。用于人源化抗体的其他技术描述于1992年12月23日公布的Padlan等的EP 519596 A1中。

所述抗体可以是单链抗体。单链抗体(scFV)可以被改造(参见，例如，Colcher，D.等(1999)Ann N Y Acad Sci 880：263-80；以及Reiter，Y.(1996)Clin Cancer Res 2：245-52)。所述单链抗体可以被二聚化或多聚化以产生对相同靶蛋白的不同表位具有特异性的多价抗体。

在其他实施方案中，所述抗体具有选自以下的重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区；特别是，选自以下的重链恒定区：例如(例如，人)IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区。在另一个实施方案中，所述抗体具有选自以下的轻链恒定区，例如(例如，人)κ或λ轻链恒定区。所述恒定区可以改变，例如，突变以改变所述抗体的性质(例如，增加或减少以下一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数量、效应细胞功能、和/或补体功能)。在一个实施方案中，所述抗体具有效应物功能并且可以固定补体。在其他实施方案中，所述抗体不招募效应细胞或固定补体。在另一个实施方案中，所述抗体结合Fc受体的能力下降或没有能力结合Fc受体。例如，所述抗体是不支持与Fc受体结合的同种型或亚型，片段或其他突变体，例如，所述抗体具有诱变的或缺失的Fc受体结合区。

用于改变抗体恒定区的方法是本领域中已知的。具有改变的功能(例如对效应配体如细胞上的FcR或补体的C1组分的改变的亲和性)的抗体可以通过用不同的残基替换所述抗体恒定部分中的至少一个氨基酸氨基来制备(参见例如，EP 388,151 A1，美国专利号5,624,821和美国专利号5,648,260，以上所有的内容都通过引用结合于此)。可以对如果在施加于鼠或其他物种免疫球蛋白时将减少或消除这些功能的相似类型的改变进行描述。

抗体可以被衍生化或连接至另一个功能性分子(例如，另一个肽或蛋白质)。如本文中使用的，“衍生化”的抗体分子是已被修饰的抗体分子。衍生化的方法包括但不限于加入荧光部分、放射性核素、毒素、酶或亲和性配体如生物素。因此，本发明的抗体分子意在包括本文中所述的抗体的衍生化的和以其他方式修饰的形式，包括免疫粘附分子。例如，抗体分子可以与一种或多种其他分子实体如另一种抗体(例如，双特异性抗体或双抗体)、可检测试剂、细胞毒性剂、药物试剂、和/或可以介导抗体或抗体部分与另一种分子(如链霉亲和素核心区或多组氨酸标签)的缔合的蛋白质或肽功能相连(通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)。

一种类型的衍生化抗体分子通过将两种以上的抗体(相同类型的或不同类型的，例如，用以产生双特异性抗体)交联来制备。合适的交联剂包括具有通过适当的间隔物隔开的两个不同的反应基因的异双功能的交联剂(例如，m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能的交联剂(例如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。此种接头可获得自PierceChemical Company，Rockford，Ill。

抗体分子可以与另一种分子实体缀合，所述另一种分子实体典型地是标记或治疗性(例如，细胞毒性或细胞抑制)试剂或部分。放射性同位素可用于诊断或治疗应用。此种放射性同位素包括但不限于：碘(131I或125I)、钇(90Y)、镥(177Lu)、锕(225Ac)、镨、砹(211At)、铼(186Re)、铋(212Bi或213Bi)、铟(111In)、锝(99mTc)、磷(32P)、铑(188Rh)、硫(35S)、碳(14C)、氚(3H)、铬(51Cr)、氯(36Cl)、钴(57Co或58Co)、铁(59Fe)、硒(75Se)或镓(67Ga)。可用作标签(例如用于诊断剂)的放射性同位素包括碘(131I或125I)、铟(111In)、锝(99mTc)、磷(32P)、碳(14C)和氚(3H)、或以上所列治疗性同位素中的一种或多种。

本发明提供放射性标记的抗体分子和标记所述抗体分子的方法。在一个实施方案中，公开了标记抗体分子的方法。所述方法包括将抗体分子与螯合剂接触由此产生缀合的抗体。所述缀合的抗体用放射性同位素，例如，111铟，90钇和177镥进行放射性标记，由此产生标记的抗体分子。

术语“Dps”或“来自饥饿细胞的DNA结合蛋白”是指来自铁蛋白超家族的蛋白质，其可以由UniProtKB数据库中在登录号Q0P891(空肠弯曲杆菌)和/或A0A0Q2JBU3(大肠弯曲杆菌)下的条目来表征。Dps优选地是指空肠弯曲杆菌的Dps和/或大肠弯曲杆菌的Dps。

在优选的实施方案中，所述抗体在不存在Dps的情况下在夹心免疫测定中不产生任何信号和/或所述抗体当用于夹心免疫测定时可以检测少于3ng/ml的Dps。优选地，所述夹心免疫测定是免疫层析测定。更优选地，用于所述夹心免疫测定的两种抗体是本发明的抗体。在实施例的表1中，当将包含PBS+0.1％BSA的样品施用于免疫层析测试设备时，CL30Camp与CL30Camp的组合不产生背景噪音。在实施例的表2和3中，显示所述免疫层析测试设备检测少于3ng/ml的来自空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌的Dps。

在优选的实施方案中，当用于夹心免疫测定(优选为免疫层析测定)时，所述抗体可以检测少于3ng/ml的Dps。优选地，所述抗体可以检测少于2或1.5ng/ml的Dps。更优选地，所述抗体可以检测少于1ng/ml的Dps。

在优选的实施方案中，通过用天然或重组的Dps对动物进行免疫获得或可获得所述抗体。在备选的实施方案中，通过用包含SEQ ID NO：11和/或SEQ ID NO：12的免疫原对动物进行免疫获得或可获得所述抗体。在优选的实施方案中，所述抗体特异性结合SEQ IDNO：11和/或SEQ ID NO：12。

SEQ ID NO：11是空肠弯曲杆菌的Dps并且具有以下序列：

SEQ ID NO：12是大肠弯曲杆菌的Dps并且具有以下序列：

在优选的实施方案中，所述抗体包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，其中所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3多肽并且VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3多肽，其中LCDR1是SASSSVSSSYLH(SEQ ID NO：1)，LCDR2是RTSNLAS(SEQ ID NO：2)，LCDR3是QQWSGYPFT(SEQ IDNO：3)，HCDR1是GFSLTSSGVH(SEQ ID NO：4)，HCDR2是VIWRGGSTDYNAAFMS(SEQ ID NO：5)并且HCDR3是NYYYGTSPDYFDY(SEQ ID NO：6)。

SEQ ID NO：7是存在于CL30Camp中的VL片段并且具有以下序列：

SEQ ID NO：8是存在于CL30Camp中的VH片段并且具有以下序列：

在优选的实施方案中，所述抗体包含VL和VH，其中所述VL是SEQ ID NO：7并且所述VH是SEQ ID NO：8。

SEQ ID NO：9是存在于CL30Camp中的LC并且具有以下序列：

SEQ ID NO：10是存在于CL30Camp中的HC并且具有以下序列：

在优选的实施方案中，所述抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，并且所述LC是SEQ IDNO：9并且所述HC是SEQ ID NO：10。在优选的实施方案中，所述抗体包含两个LC和两个HC，其中所述LC是SEQ ID NO：9并且所述HC是SEQ ID NO：10。

在优选的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。

抗Dps抗体可以被标记。可以通过使用任何常规方法进行标记。用于标记的标记物质优选是不可溶的颗粒。合适的颗粒的实例包括：通过染料-分子标记合成聚合物获得的有色的合成聚合物颗粒，如乳胶、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、和丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物；胶体金属颗粒(金、银、铜、铁、铂、钯及其混合物(例如，金和铂的混合物、金和银的混合物、以及钯和铂的混合物))；以及红血球。优选地，所述颗粒允许通过视觉观察容易且快速地检查变化。有色的合成聚合物颗粒或胶体金属颗粒可以用于此用途。所述颗粒的粒度为例如15nm至400nm，优选为100nm至400nm(对于有色的合成聚合物颗粒)或30nm至80nm(对于胶体金属颗粒)。所述胶体金属颗粒可以是市售的产品，也可以通过使用常规方法制备。

在用胶体金属颗粒标记的情况下，典型地将0.1mg至100mg，优选地0.5mg至20mg的抗Dps抗体加至1L胶体金属颗粒溶液(典型地，540nm吸光度约为2.0)，并将混合物冻存，或在室温搅拌5分钟至24小时。再用牛血清白蛋白(BSA；典型地0.01g至10g，优选地0.1g至2g)进行封闭后，将溶液离心，并且获得所得的沉淀，为用胶体金属颗粒标记的抗Dps抗体。

在优选的实施方案中，所述抗体用有色的合成聚合物颗粒和/或胶体金属颗粒标记。优选地所述有色的合成聚合物颗粒包含聚苯乙烯。

免疫层析测试设备

在第二方面，本发明提供免疫层析测试设备，其包括：(a)第一抗体，所述第一抗体特异性结合Dps，(b)第二抗体，所述第二抗体特异性结合Dps，以及(c)支持膜，其中第一抗体被固定在支持膜上并且第二抗体是标记的。

如本文中使用的，术语“固定”是指将抗体连接在支持物如膜上以致所述抗体不能在支持物上自其位置移动。第一抗体是捕获抗体，并且通过固定在支持物上而构成检测部分。如本文中使用的，“检测部分”是指通过捕获被连接至第二抗体或与第二抗体连接的样品抗原检测抗原存在的位点。

支持膜可以是任何材料的，所述材料允许第一抗体通过静电相互作用、疏水相互作用或化学偶联被固定，并且在所述材料上物质如样品和第二抗体可以移动至检测位点。合适的支持膜的实例包括硝化纤维素，聚偏二氟乙烯(PVDF)以及乙酸纤维素。

在优选的实施方案中，支持膜包含用于检查样品是否适当显影的对照部分。可以与对照物质结合的物质被固定在对照部分上。检测部分和对照部分在支持物上的位置不受特别限制。典型地，对照部分在检测部分的下游。

在本发明的测试设备中，滴在所述设备的样品添加部分上的液体样品通过毛细作用向所述设备包含第二抗体的部分移动，并且样品和标记的抗体的混合物迁移通过支持膜，并且信号在检测位点显影(参见图1A)。当样品含有Dps时抗原和标记的抗体形成免疫复合物。在检测部分，第一抗体通过抗原-抗体相互作用捕获所述复合物，并且缀合物累积并显色。然后可以通过视觉检查检测部分处的颜色的程度来确定样品中抗原的存在或不存在。当支持物具有对照部分时，所述测试设备还可以包含在或邻近所述设备包含第二抗体的部分的对照标记物。对照标记物可以由可以在对照部分与对照标记物结合的物质捕获，并且对照标记物累积并显色。当第二抗体也被用作对照标记物时，未与样品中的抗原形成复合物的剩余的第二抗体通过检测位点，并且被下游对照部分处固定的物质捕获。标记的抗体累积并显色。

在一个实施方案中，第一抗体是本发明的抗体，即之前公开的任一抗体实施方案。在备选的实施方案中，第二抗体是本发明的抗体。在优选的实施方案中，第一抗体和第二抗体都是本发明的抗体。更优选地，第一和第二抗体包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，其中所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3多肽并且VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3多肽，其中LCDR1是SASSSVSSSYLH(SEQ ID NO：1)，LCDR2是RTSNLAS(SEQ ID NO：2)，LCDR3是QQWSGYPFT(SEQ ID NO：3)，HCDR1是GFSLTSSGVH(SEQ ID NO：4)，HCDR2是VIWRGGSTDYNAAFMS(SEQ IDNO：5)并且HCDR3是NYYYGTSPDYFDY(SEQ ID NO：6)。甚至更优选地，第一和第二抗体包含VL和VH，其中VL是SEQ ID NO：7并且VH是SEQ ID NO：8。最优选地，第一和第二抗体包含LC和HC，其中LC是SEQ ID NO：9并且HC是SEQ ID NO：10。

在优选的实施方案中，第二抗体是标记的，优选地用有色的合成聚合物颗粒和/或胶体金属颗粒标记。更优选地，第二抗体用有色的合成聚合物颗粒标记。

方法

在第三方面，本发明提供用于在分离的样品中检测弯曲杆菌属细菌的方法，所述方法包括将样品与本发明的测试设备接触。

在优选的实施方案中，弯曲杆菌属细菌属于物种空肠弯曲杆菌和/或大肠弯曲杆菌。

在优选的实施方案中，分离的样品是分离的粪便样品。在将样品与本发明的测试设备接触前，可以通过将粪便样品分散在pH 8.4Tris碱缓冲液中来制备粪便样品。

抗体的用途

在第四方面，本发明提供本发明的抗体用于检测弯曲杆菌属细菌的用途。优选地，弯曲杆菌属细菌属于物种空肠弯曲杆菌和/或大肠弯曲杆菌。

在优选的实施方案中，本发明的抗体被用于检测粪便样品中的弯曲杆菌属细菌。优选地，弯曲杆菌属细菌属于物种空肠弯曲杆菌和/或大肠弯曲杆菌。

在第五方面，本申请提供本发明的抗体用于制备免疫测定测试设备的用途。术语“免疫测定测试设备”可以指包含至少一种抗体的任何测试设备。测试设备的实例包括免疫层析测试设备，ELISA测试设备，和免疫沉淀测试设备。然后所述免疫测定测试设备可以用于检测分离的样品中的弯曲杆菌属细菌的方法，所述方法包括将样品与所述免疫测定测试设备接触。优选地，弯曲杆菌属细菌属于物种空肠弯曲杆菌和/或大肠弯曲杆菌。更优选地，弯曲杆菌属细菌属于物种空肠弯曲杆菌和/或大肠弯曲杆菌并且分离的样品是分离的粪便样品。

在优选的实施方案中，本发明的抗体被用于制备本发明的免疫层析测试设备。

杂交瘤

在第六方面，本发明提供产生本发明的抗体的杂交瘤。

单克隆抗体可以通过用来源于Dps的抗原免疫小鼠来产生。来自这些用目的抗原免疫的小鼠的脾细胞被用于制备分泌具有特异性表位亲和性的mAb的杂交瘤(参见，例如，Wood等，国际申请WO 91/00906，Kucherlapati等，PCT公布WO 91/10741；Lonberg等，国际申请WO 92/03918；Kay等，国际申请92/03917；Lonberg，N.等1994Nature 368：856-859；Green，L.L.等1994Nature Genet.7：13-21；Morrison，S.L.等1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855；Bruggeman等1993Year Immunol 7：33-40；Tuaillon等1993PNAS 90：3720-3724；Bruggeman等1991Eur J Immunol 21：1323-1326)。

实施例

实施例1：制各特异性结合Dps的单克隆抗体

CL30Camp单克隆抗体获得自相同名称的杂交瘤。简言之，通过执行本领域中已知的标准方案来获得产生单克隆抗体CL30Camp的杂交瘤(

G Milstein C分泌预定特异性的抗体的融合细胞的连续培养(Continuous cultures of fused cells secretingantibody of predefined specificity)Nature 1975Aug 7 0028-0836 256 5517 495-497)。

用纯化的天然的Dps(该纯化的天然的Dps通过Ishikawa等，2003.J.Bacteriol.185(3)：1010-1017中描述的方法获得)免疫BALB/c型小鼠。将来自免疫的小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞系(具体地，SP20细胞系)融合，并且通过ELISA筛选获得的杂交瘤以找到产生与Dps结合的抗体的克隆。为了进行ELISA，将96孔微量滴定板的孔用在100mM碳酸盐缓冲液(pH 9)中的兔多克隆抗Dps抗体在37℃包被2h。洗涤所述孔然后加入在含有1％(w/v)BSA(牛血清白蛋白)的Dps的PBS溶液。再次洗涤所述孔然后将杂交瘤细胞系培养物的上清液加入至各孔。使用抗小鼠IgG过氧化物酶缀合物(Sigma-Aldrich)和相应的底物来揭示能够结合Dps的抗体的存在。

选择分泌对Dps具有高特异性和亲和性的抗体的杂交瘤。在选择的杂交瘤中，进一步选择产生良好滴度的在热胁迫测试中表现优异的抗体的杂交瘤。

使用蛋白A亲和层析使用本领域中常见的方法来纯化所述抗体(参见“亲和层析卷1：抗体(Affinity Chromatography Vol.1：Antibodies)”手册18103746AF 04/2016由GEHealthcare Bio-Sciences AB出版)。

选择CL30Camp因为其在ELISA测试以及免疫层析测试中具有高特异性和灵敏性(表1，使用的样品是含0.1％(w/v)BSA的PBS)。

表1：研究分离的抗体的不同组合的背景噪音

实施例2：制备缀合的抗体

用有色的聚苯乙烯纳米粒(K1 020Merck，Darmstadt，Germany)标记抗Dps抗体。所述有色的纳米粒包含表面上的羧基并且具有的平均直径为约300nm。对所述抗体进行如下的标记：将1mL含10％(w/v)颗粒的溶液洗涤、离心并且重悬在10mM MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)缓冲液(pH 6.0)中。然后加入EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)至终浓度5mM。将溶液在37℃孵育1小时然后通过将溶液离心并去除上清液来去除过量的试剂。

将活化的颗粒重悬在10mM MES(pH 6)中并且加入抗体至2mg/m²的表面浓度。接着，将溶液在25℃孵育4小时，然后用含0.1％(w/v)Tween-20的溶液洗涤标记的抗体。将标记的抗体稀释在含10％(w/v)蔗糖、2％(w/v)BSA、1％(w/v)PEG-6000和2％(w/v)Tween-20的0.05％(w/v)Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)pH8.0缓冲溶液中。

以15μl/cm的速率将该溶液沉积在宽度为29mm的编织聚酯纤维上。将所述聚酯纤维在30℃和20％相对湿度的室中干燥24小时。

实施例3：制备检测和对照部分

以线性方式将含1mg/mL的抗Dps抗体的PBS缓冲液沉积在层宽(laminated width)为25mm并且孔径为10至30微米的硝化纤维素膜上。以1μL/cm的速率沉积所述抗体溶液。然后将所述膜在30℃和20％相对湿度的室中干燥24小时。

与将抗Dps抗体沉积在检测部分上平行，将多克隆兔抗小鼠IgG沉积在对照部分上。相同的条件用于多克隆兔抗小鼠IgG在硝化纤维素膜上的沉积。

实施例4.免疫层析测试设备的装配

将缀合材料(样品添加部分和包含标记的抗体的部分)、支持膜和吸收材料如图1B和1C中所示地装配在具有粘合剂箔的塑料支撑物上。将条带横切为4mm的宽度。

用于分散粪便样品的溶液由200mM Tris缓冲剂的水溶液(pH 8.4)组成。将该分散溶液分配到用于取样的小瓶中。各小瓶包含1mL溶液。

实施例5：测试设备对空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌的Dps的检测极限

在上述分散溶液中制备Dps的1/2连续稀释液。将100μl样品施加到本发明的免疫层析测试设备。使所述测试设备在室温显影10分钟，之后视觉评估结果。通过使分散于相同缓冲液中的粪便样品Dps稀释，进行相同的实验。结果显示在表2和3中。解释：+＝阳性反应；-＝阴性反应；+/-＝弱阳性反应。

表2：测试设备对空肠弯曲杆菌的Dps的检测极限

表3：测试设备对大肠弯曲杆菌的Dps的检测极限

实施例6：假阳性检测

将显示大肠弯曲杆菌或空肠弯曲杆菌阳性或阴性的20mg粪便样品分散在1mL的实施例4中描述的分散溶液中。将100μl的样品施加到本发明的免疫层析测试设备。使所述测试设备在室温显影10分钟，之后视觉评估结果。解释：+＝阳性反应；-＝阴性反应；+/-＝弱阳性反应。

表4：在不含空肠弯曲杆菌或大肠弯曲杆菌的样品的情况下测试设备的反应性

表5：在含有空肠弯曲杆菌或大肠弯曲杆菌的样品的情况下测试设备的反应性

序列表

<110> 切尔泰斯生物技术公司

<120> 用于检测弯曲杆菌属细菌的抗体和测试设备

<130> HE-Ref: 903 538

<160> 12

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR1

<400> 1

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR2

<400> 2

Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR3

<400> 3

Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

<400> 4

Gly Phe Ser Leu Thr Ser Ser Gly Val His

1 5 10

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2

<400> 5

Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Ser

1 5 10 15

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3

<400> 6

Asn Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser Pro Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CL30Camp的VL片段

<400> 7

Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ala Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Pro Leu

35 40 45

Ile His Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 8

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CL30Camp的VH片段

<400> 8

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Ser

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Pro Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Asn Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser Pro Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CL30Camp的LC

<400> 9

Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ala Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Pro Leu

35 40 45

Ile His Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala

100 105 110

Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser

115 120 125

Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp

130 135 140

Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val

145 150 155 160

Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser

180 185 190

Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 10

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CL30Camp的HC

<400> 10

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Ser

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Pro Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Asn Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser Pro Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

115 120 125

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val

130 135 140

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

195 200 205

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

210 215 220

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

290 295 300

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

305 310 315 320

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

340 345 350

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

355 360 365

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly

385 390 395 400

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

405 410 415

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

420 425 430

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 11

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的Dps

<400> 11

Met Ser Val Thr Lys Gln Leu Leu Gln Met Gln Ala Asp Ala His His

1 5 10 15

Leu Trp Val Lys Phe His Asn Tyr His Trp Asn Val Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Phe Phe Ser Ile His Glu Tyr Thr Glu Lys Ala Tyr Glu Glu Met Ala

35 40 45

Glu Leu Phe Asp Ser Cys Ala Glu Arg Val Leu Gln Leu Gly Glu Lys

50 55 60

Ala Ile Thr Cys Gln Lys Val Leu Met Glu Asn Ala Lys Ser Pro Lys

65 70 75 80

Val Ala Lys Asp Cys Phe Thr Pro Leu Glu Val Ile Glu Leu Ile Lys

85 90 95

Gln Asp Tyr Glu Tyr Leu Leu Ala Glu Phe Lys Lys Leu Asn Glu Ala

100 105 110

Ala Glu Lys Glu Ser Asp Thr Thr Thr Ala Ala Phe Ala Gln Glu Asn

115 120 125

Ile Ala Lys Tyr Glu Lys Ser Leu Trp Met Ile Gly Ala Thr Leu Gln

130 135 140

Gly Ala Cys Lys Met

145

<210> 12

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)的Dps

<400> 12

Met Ser Val Thr Lys Gln Leu Leu Gln Met Gln Ala Asp Ala His His

1 5 10 15

Leu Trp Val Lys Phe His Asn Tyr His Trp Asn Val Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Phe Tyr Ser Ile His Glu Tyr Thr Glu Lys Ala Tyr Glu Glu Met Ala

35 40 45

Glu Leu Phe Asp Asn Cys Ala Glu Arg Ala Leu Gln Leu Gly Glu Lys

50 55 60

Ala Ile Thr Cys Gln Lys Thr Leu Met Glu Asn Ala Lys Ser Pro Lys

65 70 75 80

Val Glu Lys Asp Cys Phe Thr Pro Val Glu Val Met Glu Leu Ile Lys

85 90 95

Lys Asp Tyr Glu Tyr Leu Leu Ala Glu Phe Lys Lys Leu Asn Glu Glu

100 105 110

Ala Glu Lys Ala Ser Asp Thr Thr Thr Ala Ala Phe Ala Gln Glu Asn

115 120 125

Ile Ala Lys Tyr Glu Lys Ser Leu Trp Met Leu Ala Ser Val Leu Gln

130 135 140

Asn Thr Cys Lys Met

145