具体实施方式

本发明公开了石斛多糖及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的石斛多糖的制备方法，包括如下步骤：

取铁皮石斛鲜条，洗净，加4～16倍水打浆，加热至80℃～100℃，提取60～180min，降温至20℃～40℃，6000～10000转/min离心6～12min、过滤，取澄清液体，备用；

取澄清液体加入95％的乙醇，使溶液的乙醇浓度达到75％，静置30min～180min，6000～10000转/min离心6-12min，取沉淀物，分别用95％乙醇、丙酮洗涤一次；

取沉淀物70℃烘干，粉碎,过60～120目筛，得铁皮石斛粘性粗多糖；

取粗多糖，加水10～15倍水加热至60℃溶解，澄清处理，在搅拌情况下加入5％十六烷基三甲基溴化铵溶液至终浓度为1.5％，继续搅拌10min，20～40℃静置30min～180min；6000～10000转/min离心6～12min，取沉淀，于冰浴条件加入0～10℃的38％乙酸溶液，搅拌10min；6000～10000转/min离心6～12min，取沉淀；

取沉淀加5～10倍水溶解，澄清处理，溶液加入95％的乙醇至溶液得乙醇浓度达到60％，搅拌，静置30min～180min，离心，取沉淀，分别用95％乙醇、丙酮洗涤两次；

取沉淀物70℃烘干，粉碎过60～120目筛网，得铁皮石斛粘性高纯度多糖。

本发明提供的石斛多糖的制备方法以新鲜饱满的石斛鲜条为原料，经清洗，晾干，打浆，提取，澄清处理，醇沉，干燥，复溶，除杂，醇沉，干燥等工艺及技术手段提取石斛多糖。石斛多糖存在于石斛鲜条中，提取过程中，经过不断的除杂工艺，不断的提高石斛多糖的纯度，本专利的石斛多糖纯度达到96.3％，石斛多糖具有增强机体免疫力、抗癌等生物活性，增强石斛多糖的增强机体免疫力及抗癌效果。

本发明提供的石斛多糖及其制备方法中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：

铁皮石斛鲜条100kg，用自来水洗净，凉干备用。

加4倍水，用双道打浆机打浆，加热至80℃，提取60min，降温至20℃，6000转/min离心6min、过滤，取澄清液体，得液体275kg，固形物为1.7％，浓缩至固形物为10％，得浓缩液44.5kg，备用；

浓缩液加入95％的乙醇，使溶液的乙醇浓度达到75％，静置30min，6000转/min离心6min，取沉淀物，分别用95％乙醇、丙酮洗涤一次；

沉淀物70℃烘干，粉碎,过60目筛网，得铁皮石斛粗多糖3.42kg；

取石斛粗多糖，加水10倍水，加热至60℃溶解，澄清处理，得液体32.3kg，在搅拌情况下加入5％十六烷基三甲基溴化铵溶液至终浓度为1.5％，继续搅拌10min，20℃静置30min；6000转/min离心6min，取沉淀，于冰浴条件加入10℃的38％乙酸溶液，搅拌10min；6000转/min离心6min，取沉淀；

沉淀加5倍水溶解，澄清处理，得澄清液体3.8kg，溶液加入95％的乙醇至溶液得乙醇浓度达到60％，搅拌，静置30min，6000转/min离心6min，取沉淀，分别用95％乙醇、丙酮洗涤两次；

沉淀物70℃烘干，粉碎,过60目筛网，得铁皮石斛高纯度多糖842g。

实施例2

铁皮石斛鲜条100kg，用自来水洗净，凉干备用。

加10倍水，用双道打浆机打浆，加热至90℃，提取120min，降温至30℃，8000转/min离心9min、过滤，取澄清液体，得液体692kg，固形物为0.7％，浓缩至固形物为10％，得浓缩液43kg，备用；

浓缩液加入95％的乙醇，使溶液的乙醇浓度达到75％，静置105min，8000转/min离心9min，取沉淀物，分别用95％乙醇、丙酮洗涤一次；

沉淀物70℃烘干，粉碎，过90目筛网，得铁皮石斛粗多糖3.50kg；

取石斛粗多糖，加水12.5倍水，加热至60℃溶解，澄清处理，得液体38.6kg，在搅拌情况下加入5％十六烷基三甲基溴化铵溶液至终浓度为1.5％，继续搅拌10min，30℃静置105min；8000转/min离心9min，取沉淀，于冰浴条件加入5℃的38％乙酸溶液，搅拌10min；8000转/min离心9min，取沉淀；

沉淀加7.5倍水溶解，澄清处理，得澄清液体8.3kg，溶液加入95％的乙醇至溶液得乙醇浓度达到60％，搅拌，静置105min，8000转/min离心9min，取沉淀，分别用95％乙醇、丙酮洗涤两次；

沉淀物70℃烘干，粉碎,过80目筛，得铁皮石斛高纯度多糖840g。

实施例3

铁皮石斛鲜条100kg，用自来水洗净，凉干备用。

加16倍水，用双道打浆机打浆，加热至100℃，提取180min，降温至40℃，10000转/min离心12min，过滤，取澄清液体，得液体1280kg，固形物为0.36％，浓缩至固形物为10％，得浓缩液44.5kg，备用；

浓缩液加入95％的乙醇，使溶液的乙醇浓度达到75％，静置180min，10000转/min离心12min，取沉淀物，分别用95％乙醇、丙酮洗涤一次；

沉淀物70℃烘干，粉碎，过120目筛网，得铁皮石斛粗多糖3.48kg；

取石斛粗多糖，加水15倍水，加热至60℃溶解，澄清处理，得液体30.5kg，在搅拌情况下加入5％十六烷基三甲基溴化铵溶液至终浓度为1.5％，继续搅拌10min，40℃静置180min；10000转/min离心12min，取沉淀，于冰浴条件加入10℃的38％乙酸溶液，搅拌10min；10000转/min离心12min，取沉淀；

沉淀加10倍水溶解，澄清处理，得澄清液体8.1kg，溶液加入95％的乙醇至溶液得乙醇浓度达到60％，搅拌，静置180min，10000转/min离心12min，取沉淀，分别用95％乙醇、丙酮洗涤两次；

沉淀物70℃烘干，粉碎，过120目筛网，得铁皮石斛高纯度多糖840g；

检测例：

多糖检测方法(苯酚-硫酸法)：以D-无水葡萄糖为对照，采用硫酸-苯酚显色法，测定多糖含量，标准曲线方程为y＝7.66812x+0.00000(r＝0.99926)，式中x为D-无水葡萄糖质量浓度(mg/mL)、y为吸光度，测定吸光度后，根据回归方程，计算多糖含量。

表1：产品检测

注：本发明石斛多糖产品与对比专利相比，其统计结果具有明显差异(P＜0.05)。

试验例1：石斛多糖增强免疫力功能试验

1.试验材料

1.1受试样品

取本发明实施例和对比例(申请号为201810949604.9、201810209020.8及201110365323.7)工艺制备的石斛多糖作为试验样品。

1.2试验剂量

实施例和对比例试样用量为2.4g/d，以成人体重60kg计，平均用量为40mg/(kg·d)，即试验样品用量为40mg/(kg·d)。

本发明实施例1设试验样品低、中、高3个剂量组，分别设为20、40、80mg/(kg·d)。

1.3实验动物

昆明小鼠，18～22g，广州中医药大学实验动物中心提供，正常饲养3天后供试。

1.4主要仪器及试剂

UV-2501紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；BS110S电子天平(Sartorius公司)；XZC-5A型小鼠跳台仪(江苏赛昂斯生物科技有限公司)；D-半乳糖；SOD试剂；MDA试剂；考马斯亮兰试剂；注射用环磷酰胺。

2.试验方法

2.1免疫低下模型的建立及分组给药

取昆明小鼠120只，雌雄各半，随机分成空白对照组、阴性对照组、实施例1高、中、低剂量组、实施例2组、实施例3组、对比例1组、对比例2组、对比例3组，每组12只。除空白对照组外，其余各组小鼠于第1、3、5天按50.0mg/kg腹腔注射环磷酰胺注射液。造模同时按相应剂量灌胃给予试验样品，空白对照组及阴性对照组每天灌胃相应体积蒸馏水，每天灌胃给药1次，连续14d。

2.2观察指标

于末次给药后1h，小鼠称重，尾静脉注射25％中华墨汁生理盐水液10.0mL/kg，于注射墨汁后2分钟及12分钟，用毛细玻管从小鼠眼眶后静脉丛取血2-3滴，吸20.0μl溶于2.0mL 0.1％Na₂CO₃溶液中，摇匀，于721型分光光度下680nm处测吸光度，按下列公式计算吞噬指数K。同时剖取脾脏和胸腺，计算胸腺、脾脏系数。

试验数据采用多组间比较采用单因素方差分析，实验数据采用t检验分析法，比较组间差异，数据均用x±s表示。

3.结果

石斛多糖对器官重量、单核巨噬细胞吞噬功能的影响

与空白组相比，阴性对照组小鼠的胸腺系数、脾脏系数及碳粒廓清指数K显著降低(P<0.01)；且石斛多糖试验样品各剂量组均能明显提高环磷酰胺所致免疫低下小鼠的脾脏系数及碳粒廓清指数(P<0.01或0.05)，同时高、中剂量组能显著提高免疫低下小鼠的胸腺系数(P<0.01或0.05)，提示石斛多糖试验样品可增强其免疫功能，并具有提高小鼠网状内皮系统的非特异性吞噬功能的作用。结果见表2。

表2高纯度石斛多糖对免疫低下小鼠的影响(x±s)

注：与空白对照组比较，^*P<0.01；与阴性对照组比较，^##P<0.01，^#P<0.05；与对比例比较，^※※P<0.01，^※P<0.05。

3.4分析

在衰环磷酰胺对小鼠形成免疫抑制的实验条件下，石斛多糖试验样品各剂量组小鼠的碳粒廓清指数显著高于阴性对照组，即单核吞噬细胞功能明显增强，说明其能增强机体的非特异性免疫功能。同时，石斛多糖试验样品能使小鼠胸腺系数和脾脏系数增加。

本实施例从免疫调节评价了高纯度石斛多糖的功能，证明其可通过提高免疫系统功能等方面发挥作用。

试验例2：高纯度石斛多糖抗癌功能试验

1.试验药品：

样品：高纯度石斛多糖(本发明实施例1～3、对比例1～3)；

对照品：环磷酰胺。

2.动物

NIH₆₁₅纯系小鼠。

3.瘤株

SI₁₈₀A、EAC和L₆₁₅小鼠由中国医学科学院血液研究所提供。

4.实验方法与结果

(1)芦荟多糖对小鼠S₁₈₀的影响

取NIH纯系小鼠，体重20士2g，雌雄兼用，按《全国抗肿瘤药物体内筛选规程》的方法接种，瘤源为接种6天-9天肿瘤生长良好的S₁₈₀A，取出腹水，用灭菌的生理盐水按l:4比例稀释制成肿瘤细胞混悬液(5×10⁶细胞/ml)。分别以0.2ml/_R接种于小鼠右侧腋窝皮下或者接种于小鼠腹腔内。

24h后随机分组，每组10只，分别每天腹腔或者皮下注射给药一次，石斛多糖的剂量为60mg/kg，环磷酰胺的剂量为60mg/kg，空白对照组给同体积的生理盐水，连续给药10d，停药后次日将接种皮下的小鼠处死，取出瘤块称重，计算抑瘤率。接种腹腔的小鼠停药后观察寿命天数，计算生命延长率。结果见下表。

表3：石斛多糖对小鼠S₁₈₀的影响

注：与空白对照组(生理盐水组)比较，^*P<0.01；与对比例组比较，^#P<0.01。

表4：石斛多糖对小鼠S180A的影响

注：与生理盐水(空白对照组)比较，^*P<0.01；与对比例组比较，^#P<0.01。

从试验结果可以看出，石斛多糖具有显著的对抗小鼠S₁₈₀的作用，无论是对实体瘤S₁₈₀还是对腹水型S₁₈₀(S₁₈₀A)都具有强大的对抗作用，效果极显著优于对比例产品。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。