阅读说明：本技术 栽培花生AhGPAT9A基因及其在改良种子含油量中的应用 (Cultivated peanut AhGPAT9A gene and application thereof in improving oil content of seeds ) 是由 刘风珍 万勇善 吕玉英 张秀荣 张昆 骆璐 杨会 朱素青 华方静 于 2020-07-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种栽培花生AhGPAT9A基因及其在改良种子含油量中的应用。本发明克隆得到了来源于栽培花生A染色体组的AhGPAT9A基因；并通过构建转基因花生株系,对AhGPAT9A基因的功能进行了考察,发现AhGPAT9A基因对花生种子的含油量有显著影响。因此,本发明对解析花生高油分子机制,提升高油分子育种技术水平,培育高油新品种都具有重要的理论指导意义和实践应用价值。(The invention discloses a cultivated peanut AhGPAT9A gene and application thereof in improving oil content of seeds. The AhGPAT9A gene derived from the peanut A genome is cloned; and by constructing a transgenic peanut strain, the function of the AhGPAT9A gene is investigated, and the AhGPAT9A gene is found to have a remarkable influence on the oil content of peanut seeds. Therefore, the method has important theoretical guidance significance and practical application value for analyzing the mechanism of the peanut high-oil molecules, improving the breeding technical level of the high-oil molecules and cultivating new high-oil species.)

栽培花生AhGPAT9A基因及其在改良种子含油量中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种栽培花生AhGPAT9A基因及其在改良种子含油量中的应用。

背景技术

花生(Arachis hypogaea L.)是世界范围内重要的油料和经济作物。我国花生总产量的约55％用于榨油，因此，花生在保障我国油脂供给安全、稳定国内油源方面占据举足轻重的地位。含油量是花生最重要的品质性状之一，高含油量一直是花生育种研究的重要目标。不同花生种质间的含油量差异可达20多个百分点，说明花生品种含油量仍有很大的提升空间，培育高油的优质品种具有很大的遗传潜力。因此，开展花生含油量相关基因的研究，特别是油脂合成关键基因的挖掘与利用，对解析花生高油分子机制，提升高油分子育种技术水平，培育高油新品种都具有重要的理论指导意义和实践应用价值。

三酰甘油(TAG)是植物油脂的主要形式，在植物TAG的生物合成途径中，三酰甘油酰基转移酶(GPAT)将酰基载体蛋白或酰基辅酶A上的脂酰基转移到甘油-3-磷酸(G3P)的sn-1位置，形成溶血磷脂酸(LPA)，是催化TAG合成的第一个酰基转移酶，对种子的发育以及油脂的积累具有重要作用。植物GPAT家族含有很多成员。在拟南芥中，GPAT包括10个成员，根据其亚细胞定位、酶活性和底物选择性分为3类，分别位于线粒体、叶绿体和内质网，其中GPAT9定位于内质网，属于膜结合蛋白，研究表明拟南芥GPAT9基因下调表达导致种子皱缩，含油量显著低于野生型；GPAT9过量表达不仅导致种子粒重和含油量显著增加，而且使叶片中TAG的含量大幅度提高。在花生中，有研究从栽培品种花育19中克隆了一个GAPT9基因，该基因在茎、花和种子中均有表达，但其在种子油脂积累过程中的作用未进行深入研究。

栽培花生(Arachis hypogaea L.)是异源四倍体(2n＝4x＝40，AABB)，是由两个花生区组的二倍体祖先野生种A.duranensis(AA)和A.ipaensis(BB)天然杂交后经过一次性自然加倍事件形成的，基因组大小为2.7Gb。由于栽培花生包括A和B两个染色体组，研究表明，栽培花生A染色体组和B染色体组间的同源基因在功能上可能存在冗余、累加、互补等多种复杂的关系。在现有研究中，克隆获得的花生基因大多数未进行A和B染色体组的区分，对于来源于栽培花生A染色体组的AhGPAT9A基因及其功能目前还未见有相关报道。

另外，由于花生是较难进行遗传转化的作物之一，在花生遗传转化体系的建立过程中，存在再生和转化率低、受品种基因型的限制、转入的基因难以在转基因植株中稳定存在等难题，导致花生基因的功能验证和转化应用十分困难。

发明内容

针对上述现有技术，本发明经长期研究和探索，克隆得到了来源于栽培花生A染色体组的AhGPAT9A基因；并通过构建转基因花生株系，对AhGPAT9A基因的功能进行了考察，发现AhGPAT9A基因对花生种子的含油量有显著影响。因此，本发明对解析花生高油分子机制，提升高油分子育种技术水平，培育高油新品种都具有重要的理论指导意义和实践应用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种来源于栽培花生A染色体组的AhGPAT9A基因，所述AhGPAT9A基因的核苷酸序列为如下(1)-(3)任一项所示：

(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(3)除(2)以外的编码SEQ ID NO.3所示氨基酸组成的核苷酸序列。

本发明的第二方面，提供携带上述AhGPAT9A基因的重组表达载体、基因工程菌或转基因株系。

本发明的第三方面，提供如下(1)-(3)任一项所示的AhGPAT9A基因在调节花生种子含油量中的应用；

(1)AhGPAT9A基因，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)AhGPAT9A基因，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示；

(3)AhGPAT9A基因，其具有除(2)以外的编码SEQ ID NO.3所示氨基酸组成的核苷酸序列。

本发明的第四方面，提供携带AhGPAT9A基因的重组表达载体、基因工程菌或转基因株系在调节花生种子含油量中的应用。

本发明的第五方面，提供如下(1)-(3)中任一项所述的蛋白在调节花生种子含油量中的应用；

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.3所示的蛋白；

2)将SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或***得到的与SEQ ID NO.3所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

3)在SEQ ID NO.3所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

本发明的第六方面，提供一种利用AhGPAT9A基因改良花生种子含油量的方法，包括：使如下(1)-(3)任一项所示的AhGPAT9A基因在花生植株中超量表达的步骤；

(1)AhGPAT9A基因，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)AhGPAT9A基因，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示；

(3)AhGPAT9A基因，其具有除(2)以外的编码SEQ ID NO.3所示氨基酸组成的核苷酸序列。

本发明的第七方面，提供一种培育高油转基因花生株系的方法，包括以下步骤：

(1)构建花生AhGPAT9A基因的超表达载体pGB-GPAT9A-OE，采用冻融法将超表达载体pGB-GPAT9A-OE转入农杆菌LBA4404感受态细胞中，筛选获得携带质粒pGB-GPAT9A-OE的重组农杆菌菌株；

(2)挑取步骤(1)获得的重组农杆菌菌株的单菌落，在YEB液体培养基中进行活化培养，离心，收集菌体，用MS液体培养基悬浮菌体至OD600为0.6-0.7，得到菌悬液；以花生栽培品种丰花2号的种子幼叶为转基因侵染外植体，在无菌条件下接种于芽丛诱导培养基中进行预培养，将预培养后的外植体置于菌悬液中振荡侵染10-20min，用滤纸吸干外植体表面菌液，转接到芽丛诱导培养基上，暗培养3-5d，后转接于添加头孢的芽丛诱导培养基中，培养28-32d，后转接到分化培养基中，继续继代培养，直到幼苗长出，得到再生苗；再生苗转接入含有除草剂的筛选培养基中，筛选得到抗性苗；将抗性苗转接于MS培养基中进行快速繁殖；

(3)对快速繁殖后的抗性苗进行Bar基因检测，基因检测为阳性的T0代转基因植株移栽入大田，收获的种子于第二年继续种植，并对T1代植株的DNA继续进行Bar基因检测，连续进行三代或者三代以上，获得高油性状稳定的转基因花生株系。

优选的，步骤(1)中，所述超表达载体pGB-GPAT9A-OE的构建方法为：

利用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物特异性扩增花生AhGPAT9A基因，扩增产物与克隆载体pEASY-T1连接，获得重组质粒pEASY-AhGPAT9A；

用限制性内切酶Bam H I和Not I分别双酶切重组质粒pEASY-AhGPAT9A和pGBVE表达载体，回收相应目的片段，利用T4DNA连接酶，将回收的目的基因AhGPAT9A连接到表达载体pGBVE中35S启动子后面，获得超表达载体pGB-GPAT9A-OE。

优选的，步骤(2)中，所述芽丛诱导培养基的组成为：MS培养基+5.0mg/L 6-BA+0.75mg/L NAA。

优选的，步骤(2)中，所述分化培养基的组成为：MS培养基+6mg/L 6-BA。

优选的，步骤(2)中，所述筛选培养基的组成为：MS培养基+1.2mg/L PPT。

优选的，步骤(3)中，Bar基因检测的方法为：利用SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的引物进行PCR扩增，阳性转基因植株可产生442bp的目的条带。

本发明的有益效果：

本发明首次从栽培花生A染色体组中克隆得到了AhGPAT9A基因，并构建了花生AhGPAT9A基因的超表达载体pGB-GPAT9A-OE和抑制表达载体pGB-GPAT9A-AE，通过优化后的农杆菌介导的基因转化方法转化花生受体，获得了性状稳定表达的花生转基因株系，其中，AhGPAT9A基因超表达植株的种子含油量显著提高，AhGPAT9A基因抑制表达植株的种子含油量显著降低。经过3个世代的种子含油量检测，筛选出了含油量显著提高的转基因株系和含油量显著降低的转基因株系。本发明为深入研究花生GPAT9基因功能提供参考，同时对利用基因工程提高花生含油量和培育高油花生新品种具有重要理论和实际意义。

附图说明

图1：花生幼叶总RNA经1％琼脂糖凝胶电泳图。

图2：将RNA反转录产物经1％琼脂糖凝胶电泳，出现弥散状条带。

图3：AhGPAT9A基因PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小约1400bp。M为DL5000 marker。

图4：A是用限制性内切酶Bam H I和Not I分别双酶切pGBVE表达载体和重组质粒pEASY-T1，B是重组质粒pGB-GPAT9A-OE经BamHⅠ和NotⅠ酶切鉴定的电泳图。

图5：AhGPAT9A基因的植物表达载体，包括超表达载体pGB-GPAT9A-OE和抑制表达载体pGB-GPAT9A-AE的构建示意图。

图6：对抗性苗进行标记基因Bar基因的PCR检测结果，阳性T0代转基因植株可产生442bp的目的条带。G和R编号分别代表超表达和抑制表达获得的抗性苗。

图7：对T1代转基因植株进行标记基因Bar基因的PCR检测结果。G和R编号分别代表超表达和抑制表达转基因植株。G代表菌液对照，FH2是野生型丰花2号。

图8：对T2代转基因植株进行标记基因Bar基因的PCR检测结果。+表示阳性菌液对照。

图9：对T3代转基因植株进行标记基因Bar基因的PCR检测结果。+和-分别阳性菌液对照和阴性野生型丰花2号对照。经过T1和T2两个世代的筛选，在T3代的阳性检出率达到了90％以上。

图10：对T4代转基因植株进行标记基因Bar基因的PCR检测结果。在T4代的阳性检出率达到了95％以上。说明转基因片段已经基本稳定遗传。

图11：对T2代转基因植株的种子进行AhGPAT9A基因的表达量分析结果。G和R编号分别代表超表达和抑制表达T2代转基因植株。FH2为野生型对照丰花2号。

图12：T1代转基因植株含油量与野生型对照丰花2号的比较分析，G和R分别代表超表达和抑制表达转基因植株。FH2为丰花2号。

图13：T2代转基因植株含油量与野生型对照丰花2号的比较分析，A是超表达转基因植株种子含油量结果分析；B是抑制表达转基因植株种子含油量结果分析。FH2为丰花2号。

图14：筛选出的T3代转基因株系种子含油量与野生型对照丰花2号的比较分析。G和R编号分别代表超表达和抑制表达转基因植株。FH2为丰花2号。

图15：T3代转基因株系部分农艺性状与野生型对照丰花2号的比较分析。G和R编号分别代表超表达和抑制表达转基因植株。FH2为丰花2号。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，目前对于栽培花生GPAT9基因的研究并未明确基因所属染色体组。而栽培花生A染色体组和B染色体组间的同源基因在功能上存在多种复杂的关系。因此，只有对栽培花生两个基因组的基因分别进行特异克隆和功能分析，才能明确不同染色体组基因的功能以及同源基因间的作用关系。但由于有些A组和B组间的同源基因序列相似性极高，因此分别克隆A组和B组基因序列难度较大。

再加之花生是较难进行遗传转化的作物之一，在花生遗传转化体系的建立过程中，存在再生和转化率低、受品种基因型的限制、转入的基因难以在转基因植株中稳定存在等难题，这使得克隆并验证来源于栽培花生A染色体组的AhGPAT9A基因的功能十分困难。

本发明人通过长期的研究和探索，从栽培品种丰花2号中分离了AhGPAT9A基因的全长cDNA序列，构建超表达载体和抑制表达载体，利用农杆菌介导法转化丰花2号，研究AhGPAT9A基因在转基因株系中的表达情况和对种子含油量的影响，筛选出了2个AhGPAT9A基因超量表达且种子含油量极显著提高的转基因花生株系，也筛选出了2个AhGPAT9A基因抑制表达且种子含油量极显著降低的转基因花生株系。

AhGPAT9A基因DNA序列5426bp(SEQ ID NO.1)。cDNA序列全长1395bp(SEQ IDNO.2)，包括5’-UTR 127bp和3’-UTR 137bp，编码区1131bp。含有13个外显子和12个内含子。其编码蛋白包括376个氨基酸(SEQ ID NO.3)。

针对花生遗传转化体系建立过程中所存在的困难，本发明采用农杆菌介导法构建花生遗传转化体系，并对菌液浓度、侵染时间、培养条件等进行了优化，经过连续多代的种植，所转入的基因片段能够在转基因作物中稳定的遗传表达。

基于上述发现的AhGPAT9A基因，本发明的保护范围还包括与上述AhGPAT9A基因同源的DNA片段，只要它们编码的蛋白与SEQ ID NO.3所示的蛋白功能等价。本文所指的“与SEQ ID NO.3所示的蛋白功能等价”意味着目标DNA片段所编码的蛋白在生物学功能和生理生化特征等方面与本发明中SEQ ID NO.3所示的蛋白相同或相近。SEQ ID NO.3所示的蛋白典型的生物学功能是促使花生种子中油脂含量提高。

这些与AhGPAT9A基因同源的DNA片段包括本发明核苷酸序列(SEQ ID NO.1、SEQID NO.2)对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因；它们编码的蛋白类似于本发明SEQ ID NO.3所示的蛋白，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或***现象，都属于本发明内容。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的AhGPAT9A基因的非关键位点的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明AhGPAT9A基因的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码的蛋白与SEQ ID NO.3所示的蛋白功能等价，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。氨基酸或核苷酸序列的等同率可采用BLAST算法测定(Altschul et al.1990.Journal of Molecular Biology 215:403-410；Karlin andAltschul.1993.Proceedings of the National Academy of Sciences 90:5873-5877)。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。其中：本发明中采用的试剂盒、试剂购自北京天根(TIABGEN)公司、华越洋公司和大连宝生物(TaKaRa)公司；试验中采用的花生栽培品种丰花2号由山东农业大学花生研究所提供。

实施例1：花生AhGPAT9A基因的克隆

1、花生叶片总RNA的提取和cDNA合成：

依据华越洋RNA提取试剂盒的操作说明书提取花生幼叶总RNA。取2μl RNA溶液，经1％琼脂糖凝胶电泳检测评估总RNA的完整性(图1)；取1μl RNA溶液，经分光光度计测定其OD260/OD280比值，检测总RNA的浓度和纯度。

依据PrimerScript RTreagent Kit操作说明对提取的RNA进行反转录合成cDNA。取3μl反转录产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图2)，置于-20℃保存备用。

2、花生AhGPAT9A基因的克隆：

本发明根据AhGPAT9A和AhGPAT9B基因序列的多处变异位点，在变异位点处设计了多对PCR扩增引物，并对扩增引物的特异性进行筛选，最终筛选出能够特异性扩增AhGPAT9A基因cDNA的引物，序列如下：

AhGPAT9A-F：5’-CACTGTCACTTTCTTTGCTTC-3’；(SEQ ID NO.4)

AhGPAT9A-R：5’-GCTCCTATGTAATGTCCA-3’；(SEQ ID NO.5)

PCR扩增体系：总体系20μl，包括模板cDNA 2μl，10μM的上/下游引物各0.5μl，10×PCR bufferⅡ(含Mg²⁺)2μl，2.5mM dNTPs 1.6μl，TransStart Taq 0.2μl，ddH₂O 13.2μl。

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃后延伸10min。

PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小约1400bp(图3)。

依据试剂盒TIANgel Midi Purification Kit操作说明回收扩增产物条带。

依据pEASY-T1 Cloning Kit操作说明进行PCR产物与克隆载体pEASY-T1连接，获得重组质粒pEASY-AhGPAT9A。筛选阳性克隆进行扩大培养，由北京六合华大基因科技有限公司进行测序。得到完整的包含5’和3’末端的AhGPAT9A全长cDNA序列，全长为1395bp。

3、AhGPAT9A基因的序列分析

序列分析结果表明，AhGPAT9A基因包括5’-UTR 127bp和3’-UTR 158bp，开放阅读框ORF1131 bp。该基因含有13个外显子和12个内含子。该基因编码376个氨基酸，氨基酸序列与已发表的拟南芥GPAT9蛋白以及大豆GPAT9蛋白序列相似性分别达到70％以上。

实施例2：AhGPAT9A基因的植物表达载体构建和遗传转化

1、植物超表达载体的构建

用限制性内切酶Bam H I和Not I分别双酶切重组质粒pEASY-AhGPAT9A和pGBVE表达载体，回收相应目的片段(图4A)，利用T4DNA连接酶，将回收的目的基因AhGPAT9A连接到表达载体pGBVE中35S启动子后面，获得重组质粒pGB-GPAT9A-OE。该重组质粒经BamHⅠ和NotⅠ酶切鉴定，结果显示，AhGPAT9A基因片段已与PGBVE载体大片段正确连接(图4B)。重组质粒pGB-GPAT9A-OE构建成功(图5)。采用冻融法将重组质粒转入农杆菌LBA4404感受态细胞中，筛选获得携带质粒pGB-GPAT9A-OE的重组农杆菌菌株。

2、植物抑制表达载体的构建

为确保目的基因反向***表达载体中，在其上、下游引物中引入NotⅠ和BamHⅠ酶切位点，引物序列具体如下：

上游引物GPAT9A-F-NotI：5′-TTGCGGCCGCATGATGAGGAAGACCAATCCCAAGTC-3，(SEQID NO.6)

下游引物GPAT9A-R-BamHI：5′-CGCGGATCCTTACTTTTCTTCCAAGCGCCGGAGC-3′。(SEQID NO.7)

以重组质粒pEASY-AhGPAT9A为模板，利用引物GPAT9A-F-NotI和GPAT9A-R-BamHI进行PCR扩增，获得1128bp的干扰基因片段，经回收后与pEASY-T1载体连接，获得重组质粒pEASY-iAhGPAT9A。用NotⅠ和BamHⅠ酶切重组质粒pEASY-iAhGPAT9A和pGBVE表达载体，回收相应目的片段，利用T4DNA连接酶，将干扰片段iAhGPAT9A连接到表达载体pGBVE中35S启动子后面，构建重组质粒pGB-GPAT9A-AE(图5)。采用冻融法将重组质粒转入农杆菌LBA4404感受态细胞中，筛选获得携带质粒pGB-GPAT9A-AE的重组农杆菌菌株。

3、AhGPAT9A基因的遗传转化

以栽培品种丰花2号的种子幼叶为转基因侵染外植体，在无菌条件下接种于芽丛诱导培养基(MS+5.0mg/L 6-BA+0.75mg/L NAA)上，于25℃暗培养5d。挑取携带重组质粒的农杆菌单菌落，在YEB液体培养基中活化，取活化菌液100μl转接于30mlYEB液体培养基中，200rpm下28℃培养过夜，6000rpm离心15min收集菌体，用MS液体培养基悬浮至OD600为0.7。将培养5d的外植体置于制备好的菌悬液中振荡侵染18min。用滤纸吸干外植体表面菌液，转接到芽丛诱导培养基上，暗培养5d。后转接于加头孢的芽丛诱导培养基(MS+5.0mg/L6-BA+0.75mg/L NAA+600mg/L Cef)中，进行32天的培养，后转接到分化培养基(MS+6mg/L6-BA)中，进行继代培养，直到幼苗长出。再生苗转接入含除草剂PPT的筛选培养基(MS+1.2mg/LPPT)中，32天后将抗性苗转接于MS培养基进行快速繁殖。

4、转基因植株的PCR鉴定

pGBVE表达载体含有抗除草剂的标记基因Bar，阳性植株携带的转基因可以通过Bar基因检测间接鉴定出。具体步骤：提取抗性苗的叶片总DNA，利用引物序列BarF：5′-GTCTGCACCATCGTCAACC-3′(SEQ ID NO.8)，BarR：5′-GAAGTCCAGCTGCCA GAAAC-3′(SEQ IDNO.9)进行PCR扩增，阳性转基因植株可产生442bp的目的条带(图6)，共获得316株抗性苗，PCR检测为阳性的为117株，抗性苗的阳性检测率为41％。PCR鉴定为阳性的T0代转基因植株移栽入大田，收获的种子于第二年继续种植，并对T1代植株的DNA继续进行Bar基因检测(图7)，T1代共种植178株，稳定检测为阳性的为100株，阳性检测率为52％，筛选出的部分植株收获的种子继续种植，T2代共种植263株，稳定检测为阳性的仅为82株，阳性检测率仅为32％，T3代筛选出44个株系(每个株系种10株)共440株，稳定检测为阳性的达到401株，阳性检测率达到91％，T4代继续筛选出60个株系(每个株系种10株)共600株，稳定检测为阳性的达到571株，阳性检测率达到95％，获得稳定转基因株系(图8-图10)。

实施例3：转基因植株的AhGPAT9A基因表达量分析

1、RNA的提取和cDNA合成

依据华越洋RNA提取试剂盒的操作说明书对阳性转基因植株进行种子总RNA的提取。依据PrimerScript RTreagent Kit操作说明对提取的RNA进行反转录合成cDNA。

2、AhGPAT9A基因的qRT-PCR分析

设计筛选AhGPAT9A基因的荧光定量PCR特异引物qAhGPAT9A-F和qAhGPAT9A-R，扩增片段为120bp。引物序列：

qAhGPAT9A-F：5′-TGTCAGTTCAGTGTTAGG-3′；(SEQ ID NO.10)

qAhGPAT9A-R 5′-TGGTGTGTCCAGAAGGTAGG-3′。(SEQ ID NO.11)

以Actin为内参基因，荧光定量PCR特异引物ACT11F和ACT11R，扩增片段为180bp。

引物序列：

ACT11F：5'-CAGCAGAGCGTGAAATCG-3'；(SEQ ID NO.12)

ACT11R：5'-GGAAGAGCACCTCAGGACAA-3'。(SEQ ID NO.13)

参照宝生物试剂盒SYBR Premix Ex Taq操作说明进行qRT-PCR分析。

每个样品在96孔PCR板重复3次，依据2^-ΔΔct法计算基因相对表达量。并以野生型对照丰花2号中AhGPAT9A基因表达量为标准(表达量＝1)。

筛选出的T2代转基因植株AhGPAT9A基因表达量分析结果显示，2个超表达植株的AhGPAT9A基因相对表达量分别是对照植株的2.1和1.45倍；2个抑制表达植株的AhGPAT9A基因相对表达量分别是对照植株的0.47和0.41倍(图11)。结果说明，转入的超表达载体使AhGPAT9A基因表达显著增加，而转入的抑制表达载体使AhGPAT9A基因表达显著降低。

实施例4：转基因植株的种子含油量等表型鉴定分析

对获得的转基因T1、T2和T3代种子利用索氏提取法进行了含油量检测(图12、图13、图14)。

野生型对照丰花2号种子含油量49.76％。

超表达转基因植株T1代种子含油量48.79％-57.38％，平均52.42％。由其中2个植株获得的T2代种子含油量分别是54.58％和53.73％，产生的T3代转基因株系种子含油量分别是54.21％和54.27％，比野生型对照丰花2号种子含油量提高了近5％。抑制表达转基因植株T1代种子含油量40.74％-51.62％，平均46.43％。由其中2个植株获得的T2代种子含油量分别是45.01％和44.73％，产生的T3代转基因株系种子含油量分别是45.29％和46.31％，比野生型对照丰花2号种子含油量降低了约4％。

转基因植株的种子含油量与野生型比较发生了显著变化，但在主茎高、侧枝长、果长和种子大小等农艺性状方面与野生型没有明显差异(图15)。

上述结果说明转基因植株的种子含油量受到AhGPAT9A基因表达的影响，AhGPAT9A基因超量表达可以显著提高种子含油量，同时未对主茎高、侧枝长等农艺性状产生影响

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 栽培花生AhGPAT9A基因及其在改良种子含油量中的应用

<130> 2020

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5426

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cactgtcact ttctttgctt cacacagttg ttggattaga tcacatggca tattggtaaa 60

tggtaattga tgcgtgtgct gctagtttgt ttaattgttt tcgaatagat ggtgaccttg 120

atgatttatg ttgtggcttt tctttggtat tctagtcata gatgtttaaa aggaattttc 180

aatttatagc gtgagaggtt tgagcataac acattttgaa ttcataacac attttggatt 240

ccagaaggtc gtctttggct gcaagtttgt attgggaagt ccctgtcagt tcagtgttag 300

gaccacaaag aatgatgagg aagaccaatc ccaagtctca aagtactgaa ttggaacttg 360

atcaacctaa cattgaagat tacctacctt ctggacacac cattcatcaa gagcctcatg 420

gaaagcttcg cctgtatgca tacttgttac tgtgacttta tgttgtatgg atgctcacaa 480

aatagtagtc aacaagaaaa aaagcagatt tctttttctc aattgacata gctgaaacct 540

agagtccttt ttaattcttt tctcatttaa tttttcacat actcctggca atgtgatgac 600

tggattctca tgtggagaat atatgaaaat tatatttcag gtgtgatttg cttgacattt 660

ctcctactct atctgaggct gcgggtgcta ttgtagatgt aagctttcgg gcttatcttg 720

aatattttca tgctttgtgg tgtcagtttc tcagttatta tcttttatag aaacaataat 780

gatcatcaat gagtgtatta aaaaggggaa tttttactgt caagcagggc aaatttagct 840

ttttccaaca ataaatggtg tcctgtttct gcaggcttca ttgcctcttg atttttctgt 900

tcagttctca tggatgattt agggtttcgc tataaatcag aagttttata tttaaggtct 960

agtggaagcc gaaagccatt agatataatg tcatttcata ttgatattgc aatatatgga 1020

tggcatcccc tattttgcgc cttggataga ttctggtcat ctgctcacat attgagtttt 1080

atgctgagca ggattcattc ttaaggtgct tcaagtcaat tcgatcagaa ccttggaact 1140

ggaatgttta tttatttcct ttgtggtgct ttggagttgt aattcgatat ttggttctgt 1200

tccctgcaag gtcagcatat tgcttttacc atatttgctt acatgtgatg catcatatag 1260

tattactaat gaaataatgc tatctgccta gctaatttta gatgatactt atccatagag 1320

atatgctttg atgctgacat tatcgaaaag aaaaaaaaaa gatttaaagg acatgatttg 1380

atcttcagtt ttaactaaat ataattctct tttacactcg gaatcgttaa aaatagaacc 1440

aatttgattt agaaagcaac tccatgaata gaattcttta taaaaagatg cgattcaaat 1500

ttatttgcaa atcaattagt actcttggaa cttaaaagag attaatgaaa ttcattttta 1560

tttctatatt actttcttgg cataaaataa tgagtttaag tttgacgcac tgacagtata 1620

aaatgtttta caataacaac aacagaacca tatcatgtga gttattgtgt cgtatcatga 1680

atcatgtctt gttaagagaa tattaatgtt atcaatttgg aaaccaaaac taaaaagcct 1740

aataaaattc cttctacggc agaaaaaaaa ggaatcaacc taattttgag tggatttctt 1800

gatgtacaca tcaatcaaat acaaggagtt cctaatccac tcaactcctt tctaatttgt 1860

tatacatcaa atgaagtttc ggtttttgtg ggctgactga aacatactgt ttgtaattgg 1920

cctattagta tttcttttca acttttcata ttggtgactt gttttattgt aatgtttgtc 1980

cctgtgtgtt gcatcctact tcctgctttg accctgcagg gttctactgt tgtcattcgg 2040

atggatgata ttcctttcag ctttcattcc agtgcacctt ctcttgaaga gagataatag 2100

cgtgcggaaa aatattgagg tgtatattta ttcattcctg cttcatgaca ttttgtccca 2160

tttaaatttt ttagacttct gtttcctttc aatatgcact ataaaactgg aaattaatga 2220

tcaaacttct aacagtttgc agtcaaataa aaaggataaa aaaaagaact tctactgatt 2280

tgatgcatta agatttcttt gacatttgaa ccaagtccag aatatagaaa gagaaagggt 2340

tcaaatatac aaaatatgct actggttctg aattgctgtg gactcttggc agcactgaac 2400

tgatgggtta taaccttcta tgatgtccta tcaatttttc aagctttaag gcatataatg 2460

taaaaatatt aggtatagtt gttcctgctt agtatcatct tatgttgtat tttatttatt 2520

actgttaaaa tttggactaa tagtgtaaga ggggagaaag ggtaaaaagc agttaaagcc 2580

acctcatagg gatttgaccc taaccaagaa acacccagtc cctttcgcat tatttggatt 2640

taatattaag tgtcttgtgt ctggtttcaa ctcatgttgt cttaactacc agaagaagaa 2700

acttaatcca atggctctat ttaaacttca aattttagtt tgacaaatgg aagagttagt 2760

gtgtgcgtgt gtatattgaa taataataat aattattatt gttattatta ttattttatt 2820

ttattttatt ttattttatt ttcatgagaa tgcaacaaaa tttggccaat tcattgatgg 2880

tcataattta ttttcccttc aagttgtaat atcaacttct gtaatgaatg attgctttat 2940

tcaaggaaga ggacattttt tttctttcta gttcttgttt tttatgtcac acgttgtcta 3000

attagctctc tggttttccc tttgaagaat agcaacttga caacttctaa ctttttgtga 3060

atcaaagtca atgcactgta agttgcttct ttctttcaga gatgtttggt ggagatgata 3120

tgcggtttct ttgttgcatc ctggactggg gttgtcaagt accatgggcc acggcctagc 3180

atgcgaccaa agcaggtttg tctgatgtat attggtgttg ccattttgtc cttattcaca 3240

tatcgattag agtttggtag tagtaatcta agctttttgt tcattgaata ggtttttgtg 3300

gccaaccata cttccatgat tgatttcatt atcttagaac agatgactgc atttgctgtt 3360

attatgcaga agcatccagg atgggttggt aagtgccatg gtgtataaca agagacacac 3420

aaagctttta agtctttgtc atcaataagt agcgcctttt ttattattat ctattaattt 3480

tttgtggcat ctcttatcct ggaaatttgg ttttgagaat tgcacattgc caaaggaaac 3540

aaaaaaaaga agtttgttgt ggcttctctt atcctggtaa tttggttttg agaattgcac 3600

attggcatta ccatgcttca acaattgttc ttggatatct tcactagaat taatttagat 3660

ccacttccaa tcaaataact tcctttagat ctactttttc acgtcactca ctccagtggt 3720

tattatatta acatgtttcc atcatcatct ctcaatagat gctactcagt ctttctcttg 3780

attacttttg ttcttgaacc aatctttcct tgtatattca ctcatgtgcc tcaaatttgc 3840

tttgaactta ttagatattt tacaagcaca aatttatgtc tgaaacattt cttcatatca 3900

tgaacaggat tgttgcagaa caccattttg gagagtgtag ggtgtatctg gttcaatcgg 3960

acagaggcaa aggatcgaga aattgtggca aggaagtaag tagaaatgaa aatgttagga 4020

gagcttgctt ctctgatgtt ctgttatctc tttagttgtt gttttcatat gaaatatctc 4080

ttctcttgtc tccttgcatt cttcttctgt atgtcttaac agaattgctt tttgatataa 4140

aaaaaaatgt tcggaaatat atgcatcaga tcttattgtt ttacttgcat aatttttcat 4200

acttcagatt gagggaacat gttcaaggag ctgacaataa ccctcttctc atatttcctg 4260

aaggaacttg tgtaaataat cactactctg tgatgttcaa gaaggtgtgt aaaacatttt 4320

cagttgcagt tattttattc tcttgttacg ataggctttt gttcccttct gtgattttat 4380

ctccattgac ttgtattcta actcctgtat gccgaaagct ttaatggaag cttcttaatt 4440

ttaataattt gtagggtgca ttcgaacttg gatgcacagt ttgcccagta gccatcaagt 4500

acaataaaat ttttgtagat gcattttgga atagtcgcaa gtaagaacat atgtttgagg 4560

ggttaatcat tctgatcttt cacttttctt gtatttctgt tttagacttt ctagttttca 4620

tgcatttgca ggcaatcatt cactaagcat ctgctgcaat taatgacatc ttgggctgtt 4680

gtctgtgatg tttggtactt ggagccacag aatcagaagc caggagagac atccattgaa 4740

tttgcagaga ggtaaaagat ctttattatc aatgatatgc agcatctttg tttggcttca 4800

aggagttaaa acttgaaaca gtgtgtttat tactttattt caatggctgt agggtgagag 4860

agataatctc acaacgtgct ggcctaaaaa tggttccttg ggatggatat ctaaagtatt 4920

ctcgccccag cccgaagctt agagaaggaa agtaagttca acttcttagt acctcttctt 4980

tttaatcaaa tgcctttgta acgatctagg cattataacg aggattagga ttgttttagt 5040

tttcttatga tacacgtaag tattattcgc tgataattga agtattttat caaacacttg 5100

attcaaggaa gtacttatca gatgtgcatt ggcaacatta gagtttgctg ataaaagtca 5160

tgctgtatta gatttgttta cactttggtt cttatttcag tcattttacc taccaaacta 5220

attatccaca tgcattgcag gcaacgaaac tttgttgagt ctgtgctccg gcgcttggaa 5280

gaaaagtaac gcgtgctttc tatacattct taatttagcc cttcaccttg atttttatct 5340

agacttctgt tttttcagtt gatcttttat gatgttaccg gttgctttgt cagtttgttg 5400

tgatcttgtg gacattacat aggagc 5426

<210> 2

<211> 1395

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cactgtcact ttctttgctt cacacagttg ttggattaga tcacatggca tattggtaaa 60

tgaaggtcgt ctttggctgc aagtttgtat tgggaagtcc cttcagttca gtgttaggac 120

cacaaagatg atgaggaaga ccaatcccaa gtctcaaagt actgaattgg aacttgatca 180

acctaacatt gaagattacc taccttctgg acacaccatt catcaagagc ctcatggaaa 240

gcttcgcctg tgtgatttgc ttgacatttc tcctactcta tctgaggctg cgggtgctat 300

tgtagatgat tcattcttaa ggtgcttcaa gtcaattcga tcagaacctt ggaactggaa 360

tgtttattta tttcctttgt ggtgctttgg agttgtaatt cgatatttgg ttctgttccc 420

tgcaagggtt ctactgttgt cattcggatg gatgatattc ctttcagctt tcattccagt 480

gcaccttctc ttgaagagag ataatagcgt gcggaaaaat attgagagat gtttggtgga 540

gatgatatgc ggtttctttg ttgcatcctg gactggggtt gtcaagtacc atgggccacg 600

gcctagcatg cgaccaaagc aggtttttgt ggccaaccat acttccatga ttgatttcat 660

tatcttagaa cagatgactg catttgctgt tattatgcag aagcatccag gatgggttgg 720

attgttgcag aacaccattt tggagagtgt agggtgtatc tggttcaatc ggacagaggc 780

aaaggatcga gaaattgtgg caaggaaatt gagggaacat gttcaaggag ctgacaataa 840

ccctcttctc atatttcctg aaggaacttg tgtaaataat cactactctg tgatgttcaa 900

gaagggtgca ttcgaacttg gatgcacagt ttgcccagta gccatcaagt acaataaaat 960

ttttgtagat gcattttgga atagtcgcaa gcaatcattc actaagcatc tgctgcaatt 1020

aatgacatct tgggctgttg tctgtgatgt ttggtacttg gagccacaga atcagaagcc 1080

aggagagaca tccattgaat ttgcagagag ggtgagagag ataatctcac aacgtgctgg 1140

cctaaaaatg gttccttggg atggatatct aaagtattct cgccccagcc cgaagcttag 1200

agaaggaaag caacgaaact ttgttgagtc tgtgctccgg cgcttggaag aaaagtaacg 1260

cgtgctttct atacattctt aatttagccc ttcaccttga tttttatcta gacttctgtt 1320

ttttcagttg atcttttatg atgttaccgg ttgctttgtc agtttgttgt gatcttgtgg 1380

acattacata ggagc 1395

<210> 3

<211> 376

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Met Arg Lys Thr Asn Pro Lys Ser Gln Ser Thr Glu Leu Glu Leu

1 5 10 15

Asp Gln Pro Asn Ile Glu Asp Tyr Leu Pro Ser Gly His Thr Ile His

20 25 30

Gln Glu Pro His Gly Lys Leu Arg Leu Cys Asp Leu Leu Asp Ile Ser

35 40 45

Pro Thr Leu Ser Glu Ala Ala Gly Ala Ile Val Asp Asp Ser Phe Leu

50 55 60

Arg Cys Phe Lys Ser Ile Arg Ser Glu Pro Trp Asn Trp Asn Val Tyr

65 70 75 80

Leu Phe Pro Leu Trp Cys Phe Gly Val Val Ile Arg Tyr Leu Val Leu

85 90 95

Phe Pro Ala Arg Val Leu Leu Leu Ser Phe Gly Trp Met Ile Phe Leu

100 105 110

Ser Ala Phe Ile Pro Val His Leu Leu Leu Lys Arg Asp Asn Ser Val

115 120 125

Arg Lys Asn Ile Glu Arg Cys Leu Val Glu Met Ile Cys Gly Phe Phe

130 135 140

Val Ala Ser Trp Thr Gly Val Val Lys Tyr His Gly Pro Arg Pro Ser

145 150 155 160

Met Arg Pro Lys Gln Val Phe Val Ala Asn His Thr Ser Met Ile Asp

165 170 175

Phe Ile Ile Leu Glu Gln Met Thr Ala Phe Ala Val Ile Met Gln Lys

180 185 190

His Pro Gly Trp Val Gly Leu Leu Gln Asn Thr Ile Leu Glu Ser Val

195 200 205

Gly Cys Ile Trp Phe Asn Arg Thr Glu Ala Lys Asp Arg Glu Ile Val

210 215 220

Ala Arg Lys Leu Arg Glu His Val Gln Gly Ala Asp Asn Asn Pro Leu

225 230 235 240

Leu Ile Phe Pro Glu Gly Thr Cys Val Asn Asn His Tyr Ser Val Met

245 250 255

Phe Lys Lys Gly Ala Phe Glu Leu Gly Cys Thr Val Cys Pro Val Ala

260 265 270

Ile Lys Tyr Asn Lys Ile Phe Val Asp Ala Phe Trp Asn Ser Arg Lys

275 280 285

Gln Ser Phe Thr Lys His Leu Leu Gln Leu Met Thr Ser Trp Ala Val

290 295 300

Val Cys Asp Val Trp Tyr Leu Glu Pro Gln Asn Gln Lys Pro Gly Glu

305 310 315 320

Thr Ser Ile Glu Phe Ala Glu Arg Val Arg Glu Ile Ile Ser Gln Arg

325 330 335

Ala Gly Leu Lys Met Val Pro Trp Asp Gly Tyr Leu Lys Tyr Ser Arg

340 345 350

Pro Ser Pro Lys Leu Arg Glu Gly Lys Gln Arg Asn Phe Val Glu Ser

355 360 365

Val Leu Arg Arg Leu Glu Glu Lys

370 375

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cactgtcact ttctttgctt c 21

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctcctatgt aatgtcca 18

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttgcggccgc atgatgagga agaccaatcc caagtc 36

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgcggatcct tacttttctt ccaagcgccg gagc 34

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtctgcacca tcgtcaacc 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaagtccagc tgccagaaac 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgtcagttca gtgttagg 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tggtgtgtcc agaaggtagg 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cagcagagcg tgaaatcg 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggaagagcac ctcaggacaa 20