阅读说明：本技术 一种大麦条纹病致病性基因pgssk2及其应用 (Barley stripe disease pathogenicity gene pgssk2 and application thereof ) 是由 孟亚雄 梁倩倩 王化俊 汪军成 李葆春 马小乐 司二静 杨轲 边秀秀 黄志磊 于 2020-07-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供大麦条纹病致病性基因pgssk2及其应用,属于生物技术工程领域,具体提供了一个来源于大麦条纹病菌-麦类核腔菌的新基因pgssk2。pgssk2基因加强了大麦条纹病病原菌对咪鲜胺的耐受性,通过转pgssk2基因突变体,培育大批量抗咪鲜胺有关杀虫剂和除草剂作物,将提高农业生产。(The invention provides a barley stripe disease pathogenicity gene pgssk2 and application thereof, belongs to the field of biotechnology engineering, and particularly provides a novel gene pgssk2 derived from barley stripe pathogen-wheat sclerotinia sclerotiorum. The tolerance of barley stripe disease pathogenic bacteria to prochloraz is enhanced by the pgssk2 gene, and a large quantity of crops resistant to related pesticides and herbicides of the prochloraz are cultivated by transforming the pgssk2 gene mutant, so that the agricultural production is improved.)

一种大麦条纹病致病性基因pgssk2及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种大麦条纹病致病基因pgssk2及其调控菌丝生长，渗透压敏感性及抑菌剂耐受性，细胞壁完整性及致病性方面的应用。

背景技术

麦类核腔菌(Pyrenophora graminea)是大麦条纹病的病原菌，主要引起大麦叶部病害，该菌属半知菌亚门真菌(Deuteromycotina)，是一种通过种子传播的病原菌，在受感染的大麦植株中系统性传播，受到感染的大麦植株整株均可发病，防治十分困难。病原真菌通过信号级联放大响应环境变化并调整各个基因表达，病原真菌入侵寄主过程中涉及的信号基因主要包括：异三聚体G蛋白基因、MAP激酶和依赖于cAMP的蛋白激酶基因。在真核生物中，MAP信号通路对多种细胞外信号的反应起着核心作用。其中，在酿酒酵母中，对渗透胁迫作出反应的高渗透压甘油(HOG)通路是最具特征的MAP激酶模块之一，HOG通路的激活受两个膜结合渗透传感器SLN1P和SHOLP的调控，这些蛋白通过该通路的两个独立分支传递信号，它们汇聚在MEPK编码的pbs2p基因中。在高渗胁迫下，sln1不激活，未磷酸化ssk1的积累通过顺序磷酸化激活下游MAP激酶级联(Ssk2/Ssk22-Pbs2-Hog1)，丝状真菌粗糙脉孢菌Hog路径由一个渗透感应组氨酸激酶(OS1)，磷酸转移蛋白组氨酸(HPT1)，两个调控蛋白(RRG1和RRG2)和下游MAPK级联反应(OS5和OS2)分别和Hog1酿酒酵母SSK2/SSK22，Pbs2同源性较高。到目前为止，大麦条纹病菌病原菌的双组份信号系统成员的相关研究尚属空白，本申请主要通过RNAi的方式研究一种大麦条纹病菌mapkk激酶编码的pgssk2基因及其应用，旨在为大麦抗病性育种提供技术支撑。

现有技术存在的问题：现有技术中未见大麦条纹病(麦类核腔菌)pgssk2基因及功能的报道。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种大麦条纹病(麦类核腔菌)致病性基因pgssk2，通过RNAi干扰技术获得pgssk2突变体，进一步提供了该基因在调控菌丝生长分化，渗透胁迫，抑菌剂耐受性，细胞壁完整性及致病性等方面的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

1.一种大麦条纹病致病性基因pgssk2，该基因全长序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

2.一种大麦条纹病致病基因pgssk2基因克隆及其基因功能验证方法，包括如下步骤：

(1)pgssk2基因克隆及序列分析；

(2)pgssk2基因的干扰载体构建；

(3)原生质体制备及载体的遗传转化；

(4)菌丝生长实验；

(6)渗透压敏感性及抑菌剂耐受性实验；

(7)细胞壁完整性实验；

(8)大麦条纹病致病性的测定。

3.一种大麦条纹病致病基因pgssk2基因在调控菌丝生长速率中的应用。

4.一种大麦条纹病致病基因pgssk2基因在调节渗透压及真菌抑制剂敏感性方面的应用。

5.一种大麦条纹病致病基因pgssk2基因在参与细胞壁完整性的应用。

6.一种大麦条纹病致病基因pgssk2在调控大麦条纹病菌致病性方面的应用。

7.一种大麦条纹病致病基因pgssk2在提高大麦抗咪鲜胺方面的应用。

本申请至少具有以下有益效果：

(1)本申请提供了一个来源于大麦条纹病菌-麦类核腔菌(Pyrenophoragraminea)新的基因pgssk2。

(2)pgssk2基因加强了大麦条纹病病原菌对咪鲜胺的耐受性。这样可以通过转pgssk2基因突变体，培育大批量抗咪鲜胺有关杀虫剂和除草剂作物，提高农业生产。

附图说明

图1pgssk2基因的序列

图2Exophiala dermatitidis，Glarea lozoyensis，Paraphaeosphaeriasporulosa，Botrytis cinerea，Pyrenophora graminea和Saccharomyces cerevisiae部分序列比对

其中，黑色阴影表示相同的氨基酸，绿色或粉红色阴影表示相似的氨基酸，信号接受体领域加了下划线，缺少的氨基酸用“.”表示；

图3pgssk2基因系统发育分析

图4pgssk2基因的S_TKC功能域

图5干扰载体pSilent pgssk2构建示意图

图6干扰载体pSilent pgssk2干扰策略图

图7pgssk2基因的RNAi载体pSilentssk2酶切及PCR验证

其中，M1：markDL2000；M2：markDL10000；1：HindⅢ酶切大小为150bp；2：KpnⅠ和SphI酶切，大小为424bp；3：XhoⅠ酶切，大小为998bp；4：HindⅢ和XhoⅠ酶切，大小为424bp和150bp；5：SphI和XhoⅠ酶切，大小为574bp和424bp；6：pSilent pgssk2载体的PCR鉴定。

图8干扰株的PCR验证

其中，M：markDL15000+2000；1：WT菌株PCR分析验证；2：质粒潮霉素PCR分析验证；3：△pgssk2-7菌株PCR分析验证；4：△pgssk2-21菌株PCR分析验证

图9PGSSK2重组蛋白的SDS-PAGE分析

其中，M：蛋白质标准分子量；1.pET-32a；2.pET32a-pgssk2；3.pET32a-pgssk2诱导；4.纯化的PGSSK2重组蛋白

图10干扰株的RT-PCR及Westernblot验证

其中，A和B表示在野生株(WT)和干扰株(△pgssk2-7和△pgssk2-21)之间的显著性(P≤0.01)

图11野生株和干扰株在不同培养基上的生长

图12野生株和干扰株在不同渗透压培养基生长

图13野生株和干扰株在不同抑菌剂培养基生长

图14野生株和干扰株在不同细胞壁抑制剂培养基生长

图15野生株和干扰株在不同细胞壁抑制剂培养基的生长率

图16几丁质含量分析

图17野生株及干扰株对大麦叶片的致病性检测

其中，(A)两周大的大麦叶片接种5mm的WT、△pgssk2-7和△pgssk2-21菌株，接种3天后拍照记录。(B)用WT、△pgssk2-7和△pgssk2-21菌株在4℃处理大麦种子30天后栽培，栽培20天后观察拍照。(C)接种WT、△pgssk2-7和△pgssk2-21菌株后大麦的感染率。(D)感染了WT、△pgssk2-7和△pgssk2-21菌株的大麦叶片生长趋势。(E)在野生株WT中△pgssk2基因在寄生状态和非寄生状态下mRNA的转录水平，星号表示寄生状态和非寄生状态下存在显著差异(P≤0.05)。

具体实施方式

为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

本实施例提供一种大麦条纹病致病性基因pgssk2，该基因全长序列如序列表SEQID NO:1所示。pgssk2的DNA序列长度为4906bp的基因，序列包含一个52bp的内含子，位于核苷酸3619bp-3671bp位置。pgssk2基因的序列如图1所示。PGSSK2编码1384个氨基酸的蛋白质，分析了PGSSK2的1384氨基酸序列与Botrytis cinerea，Exophiala dermatitidis，Glarea lozoyensis，Paraphaeosphaeria sporulosa和Saccharomyces cerevisiae的同源性为：51.52％，51.33％，51.27％，67.92％和26.78％(图2)。系统发育分析结果显示，P.graminea，P.sporulosa和E.dermatitidis聚在一起(图3)。CDART(conserved domainarchitecture retrieval tool)程序预测了PGSSK2中保守的S_TCK信号接受体结构域(蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶催化域，丝裂原活化蛋白/细胞外信号调节激酶(ERK)激酶(1077-1349aa)，MAPK激酶(1084-1363aa)(图4)。

实施例2

本实施例提供一种大麦条纹病致病基因pgssk2基因克隆及其基因功能验证方法，包括如下步骤：

(1)pgssk2基因克隆及序列分析包括通过ssk2(Genbank ID：NP 013106)序列与大麦条纹病QWC基因组测序结果同源比对分析，同源序列命名为pgssk2，对pgssk2基因序列进行同源克隆，以引物对pgssk2-F1/pgssk2-R1(表1)为引物扩增目的片段，PCR扩增获得的产物经纯化后连接pMD19-T vector(Takara Biotech)，送公司测序。采用SMART软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)和CDART(conserved domain architecture retrievaltool)程序对PGSSK2蛋白进行结构域预测。

(2)pgssk2基因的RNAi载体构建包括用真菌干扰载体pSilent-1(6.9kilobases[kb])，通过发卡策略构建pgssk2基因的RNA干扰载体，以大麦条纹病WT的cDNA为模板，分别用引物对pgssk2-XhoI/pgssk2-HindⅢ和引物对pgssk2-KpnI/pgssk2-SphI(表1)扩增目的片段pgssk2-1(741bp)和pgssk2-2(741bp)。pSilent pgssk2载体构建采用两步法策略，分别用限制性内切酶XhoI和HindⅢ双酶切片段pgssk2-1和载体pSilent-1，分别回收两个片段，用T4连接酶连接pgssk2-1片段和pSilent-1载体，pgssk2-1(741bp)片段***pSilent-1载体的XhoI/HindⅢ位点获得载体pSilent pgssk2-1。分别用限制性内切酶KpnI和SphI双酶切片段pgssk2-2和载体pSilent pgssk2-1，分别回收两个片段，用T4连接酶连接pgssk2-2片段和pSilent pgssk2-1，pgssk2-2片段(424bp)***pSilent pgssk2-1载体的KpnI/SphI位点获得载体pSilent pgssk2，反向互补的序列pgssk2-1(pgssk2的821-1245bp)和pgssk2-2(pgssk2的1245-821bp)分别***载体pSilent-1的XhoI/HindⅢ位点和KpnI/SphI位点构建获得pgssk2干扰载体pSilent pgssk2(图5)。

(3)原生质体制备及干扰载体的遗传转化包括在1.5mL的离心管悬浮新鲜制备的WT菌株原生质体(1×108cells/mL)100μL于STC buffer中，并混合1-10μg的质粒pSilentpgssk2 DNA，置于新制的碎冰20minutes，然后向悬浮物离心管加入100μLPTC buffer温柔混匀，混合液置于新制的碎冰20min，然后加入800μL PTC buffer，混合液室温放置15min。用玻璃涂布器将原生质体转化混合液(500μL/plate)涂布在含有15mL的再生培养基平板上，将再生平板置于25℃培养48h，向再生平板上铺盖一层10mL的含有70μg/mL潮霉素(hygromycin B)的PDA培养基，25℃继续培养2-3天直到长出再生菌落。再生单菌落转接到潮霉素浓度为100μg/mL的PDA平板。连续转3代，生长状况稳定的菌落进行后续PCR检测。所述步骤(4)转化株PCR、RT-PCR及western blot验证包括提取RNA，使用潮霉素特异性引物对Hyg-1/Hyg-2对转基因株进行PCR扩增验证，同时采用实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-time PCR，qRT-PCR)检测pgssk2在转基因菌株中的表达。

QRT-PCR采用SYBR预混Ex Taq(Perfect Real Time，Takara,Japan)，在7300Real-Time PCR系统上进行。提取野生株及干扰株的RNA，反转录cDNA，将各转化株的cDNA以1:5稀释后进行转基因表达分析。实时聚合酶链反应混合物由12.5μL TB Green Advantage qPCRPremix(2X)(Takara Bio,Mountain View,CA)，0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，1μL稀释的cDNA，以大麦条纹病菌的β-actin基因选为内参基因，目的基因为pgssk2。实验重复三个平行，所用引物见表1。

采用western blot方法检测pgssk2基因，方法参照2.1.6，将pgssk2基因连接表达载体pET32a，诱导表达PGSSK2蛋白，Ni-NTA His Resin柱纯化，收集蛋白液经SDS-PAGE电泳分析，蛋白免疫小鼠获得一抗，以小鼠抗重组PGSSK2的血清为一抗，以羊抗鼠IgG(Bioss，中国)为二抗，使用免疫联合化学发光检测(bio-star，Hercules，CA)该膜，根据制造商的说明书进行。

表1 pgssk2基因克隆及功能研究用到的引物

(1)大麦条纹病菌pgssk2基因的RNAi载体构建

按照以pgssk2为靶标的反向重复RNAi载体pSilent pgssk2构建的设计(图6)，通过酶切和连接构建了pSilent pgssk2载体，依据pSilent pgssk2载体上的限制性位点对其进行酶切分析，经HindⅢ酶切在150bp左右处出现了特异条带(图7，泳道1下面箭头所示)，其大小与两个HindⅢ酶切位点之间载体的内含子大小相符；用KpnⅠ和SphI酶切，大小为424bp左右(图7，泳道2下面箭头所示)，与干扰臂片段大小一致；用XhoⅠ酶切，大小为998bp(图7，泳道3下面箭头所示)，其大小与两个干扰臂之和加载体内含子大小一致；HindⅢ和XhoⅠ酶切，大小为424bp和150bp，条带正好与干扰臂及载体内含子大小相符；用SphI和XhoⅠ酶切，大小为574bp和424bp(图7，泳道4下面箭头所示)，其大小也与干扰臂加内含子(574bp)和一条干扰臂的大小(150bp)一致。

(2)干扰株的验证

在大麦条纹病菌病原菌的原生质体再生体系上转化干扰载体pSilent pgssk2，获得42个转化子，随机选择2株pgssk2干扰突变体，进行RT-PCR及western blot验证。经潮霉素特异性引物Hyg-1/Hyg-2(表1)PCR检测，3个突变体均具有1026bp预期潮霉素片段(图8)；荧光定量PCR结果表明，以未转化野生株为对照(WT)(P≤0.01)，pgssk2基因的转录水平在RNAi干扰株△pgssk2-7和△pgssk2-21显著下降，△pgssk2-7和△pgssk2-21突变体的相对表达量下降值分别为：43.4％和44％，△pgssk2-7和△pgssk2-21表达量下降与野生株的表达量下降呈显著差异(P≤0.01)。进一步进行western blot验证。PGSLN蛋白纯化结果见图9，获得154KD左右片段；表达结果如图10所示，与荧光定量结果一致，western blot验证△pgssk2-7和△pgssk2-21的条带较弱，这些结果证实本研究已经获得了pgssk2的基因干扰株。

(3)pgssk2与大麦条纹病菌菌丝营养生长的关系

大麦条纹病WT中pgssk2基因的干扰对大麦条纹病菌的径向生长影响不大，pgssk2干扰株(△pgssk2-7和△pgssk2-21)在PDA，CM，BM，V8和MM培养基上的生长速度分别为：△pgssk2-7：10.9，9.5，9.0，9.1和8.7mm/d；△pgssk2-21：10.9，9.3，9.0，9.0和8.7mm/d；WT：10.4，9.5，9.2，8.9和9.3mm/d(图11；表2)，△pgssk2-7和△pgssk2-21与野生株WT间不存在显著差异(P≤0.01)。

以上结果说明，pgssk2和大麦条纹病菌菌丝的生长及发育不相关。

表2菌丝在不同培养基上的生长率

实施例3

本实施例提供一种大麦条纹病致病基因pgssk2在调解渗透压及真菌抑制剂方面的应用，该应用的验证包括如下步骤：

(1)大麦条纹病菌pgssk2基因的RNAi载体构建

按照以pgssk2为靶标的反向重复RNAi载体pSilent pgssk2构建的设计(图6)，通过酶切和连接构建了pSilent pgssk2载体，依据pSilent pgssk2载体上的限制性位点对其进行酶切分析，经HindⅢ酶切在150bp左右处出现了特异条带(图7，泳道1下面箭头所示)，其大小与两个HindⅢ酶切位点之间载体的内含子大小相符；用KpnⅠ和SphI酶切，大小为424bp左右(图7，泳道2下面箭头所示)，与干扰臂片段大小一致；用XhoⅠ酶切，大小为998bp(图7，泳道3下面箭头所示)，其大小与两个干扰臂之和加载体内含子大小一致；HindⅢ和XhoⅠ酶切，大小为424bp和150bp，条带正好与干扰臂及载体内含子大小相符；用SphI和XhoⅠ酶切，大小为574bp和424bp(图7，泳道4下面箭头所示)，其大小也与干扰臂加内含子(574bp)和一条干扰臂的大小(150bp)一致。

(2)干扰株的验证

在大麦条纹病菌病原菌的原生质体再生体系上转化干扰载体pSilent pgssk2，获得42个转化子，随机选择2株pgssk2干扰突变体，进行RT-PCR及western blot验证。经潮霉素特异性引物Hyg-1/Hyg-2(表1)PCR检测，3个突变体均具有1026bp预期潮霉素片段(图8)；荧光定量PCR结果表明，以未转化野生株为对照(WT)(P≤0.01)，pgssk2基因的转录水平在RNAi干扰株△pgssk2-7和△pgssk2-21显著下降，△pgssk2-7和△pgssk2-21突变体的相对表达量下降值分别为：43.4％和44％，△pgssk2-7和△pgssk2-21表达量下降与野生株的表达量下降呈显著差异(P≤0.01)。进一步进行western blot验证。PGSLN蛋白纯化结果见图9，获得154KD左右片段；表达结果如图10所示，与荧光定量结果一致，western blot验证△pgssk2-7和△pgssk2-21的条带较弱，这些结果证实本研究已经获得了pgssk2的基因干扰株。

(3)pgssk2基因与渗透压及真菌抑制剂的相关性

为检测pgssk2基因在适应渗透压中扮演的角色，野生株和干扰株(△pgssk2-7和△pgssk2-21)菌株在以下类型培养基培养：离子胁迫(Na+)，氧化胁迫(H2O2)，重金属胁迫(CoCl2)，渗透压胁迫(山梨醇)和真菌抑制剂胁迫(苯并咪唑类真菌抑制剂多菌灵、甾醇脱甲基作用抑制剂戊唑醇和咪鲜胺、苯基吡咯类咯菌腈和二甲酰亚胺类真菌抑制剂异丙脲)。

在山梨醇胁迫下野生株WT和干扰株△pgssk2-7和△pgssk2-21的径向生长速度是8.7，7.7和7.9mm/d，径向生长率为69.2％，49.2％和52.3％，干扰株(△pgssk2-7和△pgssk2-21)的生长率显著下降(P≤0.05)。在氧化胁迫(H2O2)、重金属胁迫(CoCl2)、离子胁迫(Na+)和甘油胁迫下没有显著差异(图12，表3)。以上结果说明pgssk2基因与渗透压(Sorbitol)胁迫相关。

表3野生株和干扰株在不同胁迫培养基上的生长率

真菌抑制剂敏感性实验表明，干扰株△pgssk2-7和△pgssk2-21对咪酰胺的耐受性显著性高于野生株WT(P≤0.05)(图13；表4)，WT、△pgssk2-7和△pgssk2-21的生长率为：4.5、6.4和6.7％。与野生株相比，干扰株△pgssk2-7和△pgssk2-21对戊唑醇的敏感性显著增加，△pgssk2-7、△pgssk2-21和WT的相对生长率为：8.9、9.2和11.3％。以上结果说明pgssk2基因加强了大麦条纹病病原菌对咪鲜胺的耐受性和对戊唑醇的敏感性。

表4野生株和干扰株在不同抑菌剂培养基上的生长率

实施例4

本实施例提供一种大麦条纹病致病基因pgssk2在参与细胞壁完整性的应用，该应用的验证包括如下步骤：

(1)大麦条纹病菌pgssk2基因的RNAi载体构建

按照以pgssk2为靶标的反向重复RNAi载体pSilent pgssk2构建的设计(图6)，通过酶切和连接构建了pSilent pgssk2载体，依据pSilent pgssk2载体上的限制性位点对其进行酶切分析，经HindⅢ酶切在150bp左右处出现了特异条带(图7，泳道1下面箭头所示)，其大小与两个HindⅢ酶切位点之间载体的内含子大小相符；用KpnⅠ和SphI酶切，大小为424bp左右(图7，泳道2下面箭头所示)，与干扰臂片段大小一致；用XhoⅠ酶切，大小为998bp(图7，泳道3下面箭头所示)，其大小与两个干扰臂之和加载体内含子大小一致；HindⅢ和XhoⅠ酶切，大小为424bp和150bp，条带正好与干扰臂及载体内含子大小相符；用SphI和XhoⅠ酶切，大小为574bp和424bp(图7，泳道4下面箭头所示)，其大小也与干扰臂加内含子(574bp)和一条干扰臂的大小(150bp)一致。

(2)干扰株的验证

在大麦条纹病菌病原菌的原生质体再生体系上转化干扰载体pSilent pgssk2，获得42个转化子，随机选择2株pgssk2干扰突变体，进行RT-PCR及western blot验证。经潮霉素特异性引物Hyg-1/Hyg-2(表1)PCR检测，3个突变体均具有1026bp预期潮霉素片段(图8)；荧光定量PCR结果表明，以未转化野生株为对照(WT)(P≤0.01)，pgssk2基因的转录水平在RNAi干扰株△pgssk2-7和△pgssk2-21显著下降，△pgssk2-7和△pgssk2-21突变体的相对表达量下降值分别为：43.4％和44％，△pgssk2-7和△pgssk2-21表达量下降与野生株的表达量下降呈显著差异(P≤0.01)。进一步进行western blot验证。PGSLN蛋白纯化结果见图9，获得154KD左右片段；表达结果如图10所示，与荧光定量结果一致，western blot验证△pgssk2-7和△pgssk2-21的条带较弱，这些结果证实本研究已经获得了pgssk2的基因干扰株。

(3)pgssk2基因与细胞壁完整性的相关性

为了检测野生株和干扰株的细胞壁完整性。接种到几种细胞壁抑制剂CR(100μg/mL)、SDS(0.01％)和CFW(200μg/mL)平板(图14)，其中CFW是通过与菌丝细胞壁的几丁质结合，抑制真菌细胞壁组装几丁质和β-1,4-葡聚糖。CR是通过与细胞壁中的β-1,3-葡聚糖结合，阻碍了细胞壁成分的正常组装；SDS可降低细胞膜稳定性，细胞壁受损可使真菌敏感性增加。干扰株菌丝在SDS平板上的相对生长率明显低于WT，在SDS平板上的增长率分别为：△pgssk2-7，56.0％；△pgssk2-21，55％；WT，63.2％(P≤0.05)(图15)。

进一步测定了几丁质含量，发现干扰株中△pgssk2-7和△pgssk2-21的几丁质含量较WT降低，但不显著(0.85％和0.82％对比0.99％；P≤0.05)(图16)。这些结果表明，pgssk2没有参与细胞壁几丁质合成调控。

实施例5

本实施例提供一种大麦条纹病致病基因pgssk2在调控大麦条纹病菌致病性方面的应用，该应用的验证包括如下步骤：

(1)大麦条纹病菌pgssk2基因的RNAi载体构建

按照以pgssk2为靶标的反向重复RNAi载体pSilent pgssk2构建的设计(图6)，通过酶切和连接构建了pSilent pgssk2载体，依据pSilent pgssk2载体上的限制性位点对其进行酶切分析，经HindⅢ酶切在150bp左右处出现了特异条带(图7，泳道1下面箭头所示)，其大小与两个HindⅢ酶切位点之间载体的内含子大小相符；用KpnⅠ和SphI酶切，大小为424bp左右(图7，泳道2下面箭头所示)，与干扰臂片段大小一致；用XhoⅠ酶切，大小为998bp(图7，泳道3下面箭头所示)，其大小与两个干扰臂之和加载体内含子大小一致；HindⅢ和XhoⅠ酶切，大小为424bp和150bp，条带正好与干扰臂及载体内含子大小相符；用SphI和XhoⅠ酶切，大小为574bp和424bp(图7，泳道4下面箭头所示)，其大小也与干扰臂加内含子(574bp)和一条干扰臂的大小(150bp)一致。

(2)干扰株的验证

在大麦条纹病菌病原菌的原生质体再生体系上转化干扰载体pSilent pgssk2，获得42个转化子，随机选择2株pgssk2干扰突变体，进行RT-PCR及western blot验证。经潮霉素特异性引物Hyg-1/Hyg-2(表1)PCR检测，3个突变体均具有1026bp预期潮霉素片段(图8)；荧光定量PCR结果表明，以未转化野生株为对照(WT)(P≤0.01)，pgssk2基因的转录水平在RNAi干扰株△pgssk2-7和△pgssk2-21显著下降，△pgssk2-7和△pgssk2-21突变体的相对表达量下降值分别为：43.4％和44％，△pgssk2-7和△pgssk2-21表达量下降与野生株的表达量下降呈显著差异(P≤0.01)。进一步进行western blot验证。PGSLN蛋白纯化结果见图9，获得154KD左右片段；表达结果如图10所示，与荧光定量结果一致，western blot验证△pgssk2-7和△pgssk2-21的条带较弱，这些结果证实本研究已经获得了pgssk2的基因干扰株。

(3)pgssk2基因与大麦条纹病菌致病性的相关性

为了评价pgssk2的致病性，本研究将野生株及干扰株的菌栓接种大麦叶片。接种WT和△pgssk2-7和△pgssk2-21菌株的大麦叶片均呈现感染的症状，出现黄褐色病斑(图17-A)。接种野生株及干扰株的大麦种子播种20天后观察大麦生长趋势(图17-D)。感染WT和△pgssk2-7和△pgssk2-21菌株的大麦植株均生长较弱，表现出现条纹叶表面(图17-B；与非寄生期相比，WT寄生期pgssk2转录水平显著降低(P≤0.01)，寄生菌株pgssk2相对表达上升(图17-E)。这个结果表明，pgssk2没有参与发病机制。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

<110> 甘肃农业大学

<120> 一种大麦条纹病致病性基因 pgssk2及其应用

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<212> DNA

<213> 大麦条纹病菌-麦类核腔菌（Pyrenophora graminea）

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1 taactttctg tacatcctcg ccctcctgcg gcgcctggtg cgtcgagaag ctatccggcg

61 aagcggcaag gtggttgagt agtttatgca agagaaagtg cagccatact aggttagttt

121 ttgggtggaa ttggcgccag atgtgctgat ctacgacttt tggtgccatt cggcgggatg

181 atgagggttt gggttcagag tgttttctgg gtgagtgtcg gggggtctcg ggtaaggagt

241 cgggattgga ttcgaagcgg atatgtgtgt ttttgcgtgg tgagcgacgg ggggttattg

301 gaggttgttg tgcctcctcc tctacttcat catgtgtcga tggaggtgag ggctcggctt

361 gcagggggtt gtcgaataaa gccgcgccgc gcatataccg gtaaatctcg tattggtatt

421 cttcgctcgc gtcgccttgg aagagtgcgg gatccttgtc tagatccagg taagcgacat

481 cgacgacgtc gtcttgtccg tcgtcgccag atgtggtgct cgagatgtgt gataggtcga

541 tatcatcctg ggatagcgag ggcacgatgt cggcgcggga tagcgtgtaa tcaatgactg

601 tggtttccag gcccgtgaag cggaatttgc ggcgtaaagg gtcgcggatg aggggctgca

661 atacgtctcc gtctgtgcgt gaagaccgca cgcagatgtt gccgagatgc aggtcgcgat

721 gctcgaatcg acatgcttct tctgctttgc ctagacttat tgctacaccc caaaagacgt

781 cccagacttc ccatatggaa ctcaaaccgc cgttctccat catcttttcg cagtcagtac

841 cggcgtcttg catctcaacg acggcccaga gttggttttc atcgtagctg gcttttttgc

901 tgggatctgg gaactcgctt ttcttgccgc gaggacgaga cttgttccat tccttccagg

961 cgtcgttgaa ggacgttgaa ggtctaccct ggacaatagt gaggtcacgg aaaacggtga

1021 agccaggtat gtgagtcagg ttctggagga gcctaacctc tgaaactaca tcctcaacat

1081 gcgatttcca ttgatcctcc tcctctcgtt gagccatctc cttttccatc tgcgcttcgc

1141 gatctcgaac cgcgcgcgtg tgtagttggc atgggagtgg gacatctggt ggtgtcttga

1201 gggccacgat cttgagcacc gattcttctg tgacaccatt cgcggaagat gtagcagata

1261 gtcggtatac ctctgaaaaa gacgcttccg caatctttgt gatttcgaaa tgcggttcta

1321 gttcgcctaa ccagtcttgg aagcccacaa tcctctttct gtcactgaga gccagtagcg

1381 gagacgcata ggcagagtaa acggtttcag gctcaggtgt tggttccggg gtaggtaact

1441 gtggtcttcg ttgcttcgat ctaggacgta tgggtgtctc ctcatttctt gtgacctcgc

1501 cagctgtggg gataggggta gggacaagtc gcttcttctc cttcttcttt ttcgaaccgg

1561 actggacctg gccatgagtt tcgttcaaag cgttgatgtt ccgatcgctc agaactttgc

1621 gcggtttcct tggcttcttt agcatggcgg ggtcttcttc taccggggcc ctgatgtcca

1681 aagctcgcat gctttcctcc agagcatcgt agattggaat cgaattctct tttgcggtat

1741 ctggatcggt cgcggacgat tccagtggtc tagattgttt ctttgtgatg cgcacttttg

1801 gcgaattcct tggttgctcc atttgtaaac cctcaaaccc cttctccaac gccgacatgt

1861 catcatcctt ctgcttctgt tgtgctgttg actctgctgc tgtcaagagc tgatgccgcc

1921 aatcatttgt tgtgttgcta gccacatttt ggctccccac gactttgtgc gcaacatcct

1981 tctctggcga cagaaacttt gtataggcag gccgcccccc agttctcttc ttcccgtata

2041 caatttttgg tggcatgtca ggcggctgag cgaatagtat ggctgttgac gttaggtcgg

2101 gcgtctggct ggacctgcca gggtcgcttt gcacgggtcc acgtgggaaa ctctaagcga

2161 ggacaaaccg ttgacccggc aacagacagg gttctgacac atgcgtatcg atagtcacaa

2221 gcagagaagc agagaagtac aatctcacac gattaacatt acaatcaaaa gctactttgt

2281 tctccggcgc cagcctcatc agtcgcaata tcaaaacaaa gcctctcgcc ccgagacgat

2341 catattgtgt acggtaaaac gggtgtccag cctccctttt ctaaagccaa gaaagatatt

2401 acataggaaa ggtgtgtagc aaggtttgtc tgaaagacaa gtgtatggcg agtgcgtcca

2461 tgaccaatga gaaaacgcca agtgcaacaa taagtagacc cagaatattg acgaaactaa

2521 agaaaaagac ccatggaaaa catgagggcc gtgcaaaatg gtgttatgtc aatttacaac

2581 cgaataactt ttgatatttg gtaggcgagg aaaatcgtgc aacgcatagc agggaagaaa

2641 gcaacaggca gacttgtgac tccgtacaac cgaagaggcg tgtgagtgtg aaagctgagc

2701 ttactcatct ccgcttccgc tttcaattgg cggtgtctcg gcctcttcct gcagcaccgg

2761 aggcgggacg agactcttgc gcttattttt cctttcagct tccgcatcct tgttcgtacc

2821 gtttgtatcc ggtggagcgg ccgcgagtgt tgggctgggg gtaactggtt tcttgtttgg

2881 ggcaatactc gcatagctac cggagagctt cgatgtggtg tcattgttct cagacttgtc

2941 ggcaaaatct ttccacttgc gccaaccgtc gaaatcgatc agggcttgca tgcatcccca

3001 ttctttgact ttgcgctcga gccagacgaa gttgacgggc tgcagtgtgt tagtgaaagc

3061 taatggaaaa gaagtctatc cttcttacct ttgtcaagaa atcgttgcag ccagccgcca

3121 atgcctcatg cctatcactt tgcagcgaac tggcagtgag ggcgacaata atgacagggc

3181 tcttgaacat gcccttgtca ccaagccggt cgtctgcaac tagctcatct ttgcccttgg

3241 catcctggcc gagcctgtta ttgggcgctt cgctgcttcc actgctgaag acgccaatgc

3301 tgttgacacg ctccaatctc ctaatctcct ttgtcgcctc gagaccgttc atgacgggca

3361 gctgaatgtc catgagtacc aagtggaaac caccagcctt ccacttggtc acggcctcct

3421 ttccattcat tgcgcgctgc cagcggactt tgagacgctg cataaaagct cccaagactc

3481 gcaggttgat aatgttatct tccacaatga gcacgttgat aggtggcact gacccatcga

3541 gcaatccagc aggcaagctg ggtgcctcga gtggagcctt cttccgcttc ttcttcggct

3601 gaggcgacga gatacgcggg gtcggcggag ttgactcatg gagggttggt tggtgtgtga

3661 tgaggtcggc agtagcggga ggtgtgggta tcgggttatt cgatgcagcc gagttcttcg

3721 cgtcagatgc cgtggagtca tggcgcggac ggttgggagg acgggcggac gtggcagagg

3781 aggggatgcc gccgccaagg gtagtgggcg aggcagtaag ggtcctgggg tatttcggcc

3841 gatgtgcatg gagtggccca cgccttgtgc ctccgggtga aggcagggca ggcagctgtc

3901 cggtgttgag cacagcgata gagtgcgaag cgtgggggag gggcatgcgg gtgtcgtgct

3961 gctgctggct cgtacccatg ccagctgggg agggcgcgat aacgggcatg gggggaaaat

4021 actcggtttg ttgatggagg ccatcctcgt ggtgcgcata gtatagtggg acgcgcggcg

4081 atggttttgg cgtccttcgt tggggcacgt cgatgatgag agcctctgcg acagtctgac

4141 caccaggaaa gtagaggtcg agtgtcctgc atatgtcctc ctcaggcccc agggtgcgct

4201 ccgctccacg ttgggcgtcg cgcggcgcaa tgcgaagagt gacatcgggc gagtcgaagc

4261 tccgccccag ggagtttgcg tactttcgga gaatcatatc acgcacatcg tcgaccaggt

4321 cgtcctcgcg gatctgcacg agcgtggccg aagcattggg ccgcttgacc cagatcttgc

4381 ggtgcaacat ttgggcgcta ggctggactg tcggactcag tagagcaggt ggcaacgcag

4441 gcgcaggcga aattgaaggt gatggcagtg gtagtggcag cggcagtggc agtggtgatg

4501 gggacgtgga tgtcgatgcc gaaggcgtag cagatgcgtc gatcgtgtcg ctgcctggag

4561 ccaacagcga gagcgacgac gtctgttgct ggggactgct atattcgaga acagcgggaa

4621 caggcgtagg ctcctccagt gtcagctctg gacatacaag aggctcgtcg gcagtgctgg

4681 tgggtatatg cccgttgggt gctgtattct cggcggcttc gggcgcgccc gcctcggcca

4741 gcttctgcaa cgagacgctc ttgcgtagcg agctgccgac ccgggcttgt ggatgtctct

4801 cgctgcccgc agaggatgtc aaggagcgcg tcgctgtcga ggcggagctg cctcttctga

4861 gcagcttgga acggaccttg tgcagccgcg acttgatgtt gctcat