阅读说明：本技术 抗产气荚膜梭菌α毒素全人源单分子抗体7D-mFc及其应用 (Fully human monomolecular antibody 7D-mFc for resisting clostridium perfringens alpha toxin and application thereof ) 是由 张国利 田园 岳玉环 陈萍 刘楚含 吴广谋 李泽鸿 刘雨玲 王冬冬 雍伟 邓欣 于 2020-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了抗产气荚膜梭菌α毒素全人源7D-mFc单分子抗体及其应用,它的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；抗产气荚膜梭菌α毒素全人源7D-mFc单分子抗体在制备治疗和预防产气荚膜梭菌α毒素中毒的药物的应用；一种产气荚膜梭菌α毒素的检测试剂,它包括氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的产气荚膜梭菌α毒素全人源7D-mFc单分子抗体。(The invention discloses a fully human 7D-mFc monomolecular antibody for resisting clostridium perfringens alpha toxin and application thereof, wherein the base sequence of the antibody is shown as SEQ ID NO. 3; the amino acid sequence is shown as SEQ ID NO. 4; the application of the fully human 7D-mFc monomolecular antibody for resisting the clostridium perfringens alpha toxin in preparing the medicine for treating and preventing the clostridium perfringens alpha toxin poisoning; a detection reagent for clostridium perfringens alpha toxin comprises a clostridium perfringens alpha toxin fully-humanized 7D-mFc monomolecular antibody with an amino acid sequence shown as SEQ ID NO. 4.)

抗产气荚膜梭菌α毒素全人源单分子抗体7D-mFc及其应用

技术领域

本发明属于生物工程及疾病防治领域，具体涉及抗产气荚膜梭菌α毒素全人源单分子抗体7D-mFc的制备方法及其应用。

背景技术

产气荚膜梭菌(C .perfringens)又称魏氏梭菌(C .welchii)，广泛存在于自然环境中，并见于几乎所有温血动物的消化道内，属于人和动物肠道内正常菌群的成员。产气荚膜梭菌能引起羔羊痢疾和羔羊、牛犊、仔猪、家兔、雏鸡的坏死性肠炎、肠毒血症等疾病，发病急、死亡率高，是严重危害养殖业的重要疾病，是近年来我国家畜“猝死症”的主要病原，给各国畜牧业发展带来巨大经济损失。各型产气荚膜梭菌均产生α毒素(CPA)，本菌能引起人类气性坏疽及多种动物的肠毒血症和坏死性肠炎，当家畜被感染后其体内产生α毒素抗体，因此α毒素抗体是诊断产气荚膜梭菌病的重要依据之一。

根据主要致病的毒素α、β、ε和ι，将该菌分为A、B、C、D、E 毒素型，其中α 毒素是各类型产气荚膜梭菌均产生也是最重要的致病毒素之一，具有磷脂酶C (phospholipase C,PLC)、鞘磷脂酶(sphingomyelinase, SMase)和多种生物活性，而且也是A 型产气荚膜梭菌最主要的致毒因子。近年来对于产气荚膜梭菌α 毒素的研究主要集中在基因表达、酶学活性分析、对氨基酸的定点突变以及α毒素与靶细胞的作用方式等方面，但尚不清楚α毒素突变位点的选择和突变前后分子结构的变化，酶学特性和结构特征，以及其分子结构与酶活性之间的关系。产气荚膜梭菌α毒素是一种不畏氧的细菌毒素，可以水解卵磷脂形成磷脂胆碱和不溶性的甘油二脂，使红细胞发生溶血和分解卵黄磷脂。纯化浓缩的产气荚膜梭菌α毒素作为生物武器可以制成气溶胶形式释放，也可以释放在水和食物中，该生物战剂可引起人多系统多器官的严重反应，如缺乏食欲、恶心呕吐、胃部痉挛疼痛、脓血样腹泻；呼吸困难、喘息咳嗽、口腔咽喉疼痛、痰中带血；皮肤灼痛、红肿、瘙痒、皮疹或水泡，更严重的可以引起死亡。α毒素是第一个被发现既有酶活性又有毒素特性的细菌蛋白，具有冷热溶血效应，即α毒素在37℃与红细胞作用时，红细胞并不发生裂解，只有当红细胞变冷至4℃时，才会发生裂解，这种冷热溶血效应，发现在小鼠红细胞、家兔红细胞、绵羊红细胞和马红细胞上。α毒素对胰酶敏感，2.5%的胰酶与α毒素在37℃作用1 h，即可使其完全失活。另外，把α毒素加热至60℃-70℃时，就可以使其失活，当进一步加热至100℃时，有的可以恢复部分活性。α毒素结构基因大小为1194 bp，编码产物由398个氨基酸组成，其中有28个氨基酸是信号肽，其余的370个氨基酸构成成熟蛋白，相对分子量为43000Da，等电点pI为5.1。α毒素分为两个结构域，即α螺旋结构的N端结构域以及参与膜蛋白结合的C端结构域，经大量实验证明，α毒素的N端与C端具有不同的活性，N端具有磷脂酶C活性，C端具有鞘磷脂酶活性，只有两者协同，才能具有溶血活性与致死活性。α毒素是产气荚膜梭菌最重要的致病因子，至今尚无有效的治疗方法。关于抗α毒素人源化抗体的研究，在国内基本属于空白，研究抗产气荚膜梭菌α毒素治疗性抗体有广阔的应用前景。

单链抗体（Single-chain antibody）又称为单链抗体可变区段（Single-chainantibody variable fragment，sc Fv），它由抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一段柔性的连接肽（Linker）连接而成。单链抗体分子量为27000-30000 Da，是保留亲代抗体全部抗原结合活性较小的功能结构单位。这种抗体的VH和VL折叠后形成只具有一个抗原结合位点的抗体，只能与一个抗原决定簇特异性结合。目前单链抗体主要有三种制备方法：（1）把重链可变区、轻链可变区、连接肽三者的混合物直接进行PCR扩增产生单链抗体；（2）先将VL和连接肽进行连接，再通过PCR将VH连入产生sc Fv；（3）将 VH和VL分别与linker相连形成 VH-linker、VL-linker、将其余扩增带有酶切位点的VH上游引物和VL下游引物一起进行PCR扩增，形成scFv。研究发现，由于VH和VL的连接方向和方法的差异所形成的单链抗体会有所不同，而VH和VL连接linker方向的不同对单链抗体的特异性和亲和力没有明显影响，都能够构建具有抗原结合力的scFv，但是在原核表达系统VL-VH的表达量超出VH-VL大约20倍。

目前，人源单链抗体的制备，大部分都是利用噬菌体展示技术构建一个依托于噬菌体载体或者噬菌粒载体的噬菌体展示文库，通过目的抗原与抗体特异性结合，经过几轮淘选和富集过程，筛选到所需要的阳性克隆或者目的抗体，利用ELISA和PCR等技术对其进行定性定量分析，详见中国专利ZL201410771046.3和ZL201410771048.2，利用上述专利获得的抗产气荚膜梭菌α毒素人源化单链抗体再次进行基因操作，使之与突变了铰链区的人IgG mFc片段基因融合，表达和制备活性和稳定性俱佳的全人源单分子抗体。

发明内容

本发明的目的是为克服异源性抗体的多种副作用，免除异源性抗体进行人源化改造的繁琐步骤和高成本的问题，而提供一种分子量小，体内穿透能力强，迅速到达受损组织和细胞发挥抗毒素作用的，产气荚膜梭菌α毒素全人源ScFv-mFc单分子抗体。

抗产气荚膜梭菌α毒素全人源7D-mFc单分子抗体，它的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

抗产气荚膜梭菌α毒素全人源7D-mFc单分子抗体，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

抗产气荚膜梭菌α毒素全人源7D-mFc单分子抗体在制备治疗和预防产气荚膜梭菌α毒素中毒的药物的应用。

一种检测产气荚膜梭菌α毒素的检测试剂盒，它包括氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的产气荚膜梭菌α毒素全人源7D-mFc单分子抗体。

本发明提供了抗产气荚膜梭菌α毒素全人源7D-mFc单分子抗体，它的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；抗产气荚膜梭菌α毒素全人源7D-mFc单分子抗体在制备治疗和预防产气荚膜梭菌α毒素中毒的药物的应用；一种检测产气荚膜梭菌α毒素的检测试剂，它包括氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的产气荚膜梭菌α毒素全人源7D-mFc单分子抗体。产气荚膜梭菌α毒素全人源7D-mFc单分子抗体，它是从噬菌体抗体库Source bioscience筛选出来的，是全人源抗产气荚膜梭菌α毒素抗体，并通过基因工程技术与突变了铰链区的人IgG mFc片段融合表达，既可以实现中和毒素的治疗作用，同时克服了异源性抗体的多种副作用，免除了异源性抗体进行人源化改造的繁琐步骤和高成本，由于单分子抗体分子量小，体内穿透能力强，迅速到达受损组织和细胞发挥抗毒素作用，并且加入人IgG Fc片段后，其体内稳定性增加，半衰期延长，可提高毒素体内清除率，因此达到经济和高效的双重目的。α毒素与产气荚膜梭菌其他类型毒素具有一定的同源性，该抗体药物有可能对其他类型的毒素具有抑制和治疗效果，也可作为检测试剂检测产气荚膜梭菌α毒素。突变了铰链区的人IgG mFc片段为CPPCP中半胱氨酸进行突变，铰链序列突变为APPGP，意在防止分子内和分子间形成二硫键。

附图说明

图1 重组表达质粒P300-trxA-SUMO-7D-mFc的PCR和双酶切鉴定；M：DL2000 DNAMarker；1：重组表达质粒P300-trxA-SUMO-7D-mFc 的PCR扩增产物； 2：重组表达质粒P300-trxA-SUMO-7D-mFc BamHⅠ和EcoRⅠ；3：P300-trxA-SUMO-7D-mFc EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切电泳；

图2 工程菌在诱导后的表达结果；M：蛋白质Marker；1：阴性对照；2：诱导菌体；

图3 纯化后的7D-mFc蛋白；M:Marker；1-7: 7D-mFc纯化蛋白。

具体实施方式

实施例1重组表达质粒P300-trxA-SUMO-7D-mFc的构建

根据Genbank中公布的人体IgG的全序列，设计并合成包含突变铰链区的mFc片段，合成基因序列依次为EcoRⅠ-CH2-SacⅠ-CH3-XhoⅠ，并克隆入pMD19-T载体中，构建质粒pMD19-T-mFc，然后转入E.coli JM109中，制成穿刺菌种保存。

将P300-trxA-SUMO（PTS）表达载体 用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后纯化回收，与pMD19-T-mFc同样双酶切后纯化回收的mFc片段用T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒PTS-mFc，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，含Amp抗性的琼脂平板进行初步筛选。挑选单菌落于LB液体培养基中培养；用质粒回收试剂盒提取质粒，PCR鉴定，产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，获得702bp左右的条带，大小与***的目的基因相符，并进行序列的测定，证明mFc目的片段正确***载体中，成功构建了重组质粒PTS-mFc。

利用从人源噬菌体库中筛选获得的抗产气荚膜梭菌α毒素中和性scFv抗体7D工程菌株为模板，利用合成的ScFv特异性引物扩增7D基因，两端分别加入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点：

P1：5’-GGCGGATCCATGGCCGAGGTGCAGCTGTT-3’；

P2：5’-CTTGAATTCCCGTTTGATTTCCACCTTGG-3’。

扩增片段克隆入构建的PTS-mFc表达载体中，得到PTS-7D-mFc表达载体，进行PCR鉴定和酶切鉴定（见图1）。

实施例2 7D-mFc的表达、纯化及蛋白性质研究

将重组质粒PTS-D7-mFc转化表达菌-大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达后，SDS-PAGE结果显示：重组蛋白7D-mFc在80KD左右处有一明显表达带，大小与理论值相符，7D-mFc的表达量占菌体总蛋白的25.6%（见图2）。

融合蛋白的纯化：诱导表达菌体超声裂解后，取其上清，以20-45% 饱和硫酸铵分步沉淀，沉淀以20mM Tris-cl +0.5M Nacl (pH 8.0)重悬后进行Cu²⁺金属螯合层析，分别以50mM、200mM咪唑洗脱，目的蛋白在200mM咪唑洗脱峰中，以20mMTris-cl +10mM Nacl (pH8.0)平衡G-25凝胶过滤层析柱脱盐，按100:1加入SUMO蛋白酶，30℃酶切2h，蛋白酶切物补足咪唑至20mM ，再次进行Cu²⁺金属螯合层析，收集流川目的蛋白峰进行rProtein-A亲和层析，缓冲系统为20mM Tris-cl (pH 8.0)，然后以50mM 甘氨酸-盐酸 (pH 3.0)洗脱，目的蛋白进行Superdex 75 凝胶过滤层析，获得纯度在95%以上的7D-mFc蛋白质（图3）。

实施例3 全人源抗产气荚膜梭菌α毒素单分子抗体7D-mFc的生物活性鉴定

取50% Egg Yolk Emulsion（海清生物，货号HB8295）4℃ 10000×g离心20min，取上清，用生理盐水1:10倍稀释，在细胞培养板中，每孔加入100µL稀释的卵黄液，每孔加入5µg 纯化的CPA毒素以及5µg 7D-mFc，同时以7D ScFv作为另一组，用生理盐水做阴性对照，仅加CPA毒素做阳性对照，每个样品做复孔测定，37℃放置2 h，读取OD620平均值，结果显示7D-mFc较单纯7D抑制卵磷脂分解活性有显著提高。

实施例4 利用ELISA法比较抗体的滴度

利用非竞争酶免疫法测定7D-mFc和7D单链抗体的滴度，分别以2.5 µg/mL、1.25µg/mL、0.625µg/mL和0.3125 µg/mL包被α毒素，将7D-mFc和7D浓度调整到10^-6 mol/L，倍比稀释1:2~1:512，用1:5000倍稀释的Protein A-HRP抗体作为二抗，OPD显色，测定OD490nm吸光值，每个样品做双孔测定，取OD平均值。结果显示7D-mFc比7D单链抗体的滴度高10-50倍。

实施例5 7D-mFc和7D scFv动物体内CPA毒素中和救治实验

利用纯化的CPA毒素进行攻毒剂量研究，以96小时为攻毒全程时间，确定了CPA毒素对昆明系小鼠的腹腔攻毒LD50为30μg/Kg体重。取24只昆明系小鼠随机分为4组，雌雄各半，设阳性和阴性对照组各一组，7D-mFc和7D两个救治组，除阴性对照组外其余各组分别腹腔给予5倍LD50的CPA毒素，攻毒1小时后阳性对照组给予PBS缓冲液安慰剂治疗，救治组分别给予20μg/Kg体重纯化的7D-mFc和7D scFv。阴性对照组救治时继续给予PBS缓冲液。结果：阳性对照组动物死亡率100%，7D-Fc组全部存活，7D scFv组1只死亡，阴性对照组无异常。由此可见，7D-mFc组小鼠保护率达到100%，较7D scFv组抗毒素效果好。

实施例6 7D-mFc和7D scFv动物体内半衰期测定

建立7D scFv血药浓度ELISA测定方法，以5 µg/mLα毒素包被ELISA板，将7D-Fc和7D浓度调整到2 µg/mL为起始，以小鼠血浆倍比稀释1:2~1:512，用1:5000倍稀释的Protein A-HRP抗体作为二抗，OPD显色，测定OD490nm吸光值，每个样品做双孔测定，取OD平均值与浓度绘制曲线。

取32只昆明系小鼠随机分为2组，雌雄各半随机，组别分别为7D-mFc和7D scFv组，每组分别按20μg/Kg体重单次腹腔注射纯化的7D-Fc和7D scFv。分别设定8个采血时间点：即给药前及给药后5 min、30 min、60 min、90 min、2 h、2.5 h、3 h；每组每个时间点采集2只小鼠血浆测定血药浓度，采用WinNonlin 7.0软件计算并绘制血药浓度-时间曲线。

通过系统的实验证明筛选获得的抗CPA单链抗体7D scFv 和7D-mFc均具有中和毒素和实验动物保护能力。其中7D-mFc较单链抗体中和毒素能力大幅提高，且体内半衰期延长4倍左右。预计在人体内可以实现中和毒素的治疗作用，同时又克服了异源性抗体的多种副作用，免除了异源性抗体进行人源化改造的繁琐步骤和高成本，再由于单分子抗体分子量小，体内穿透能力强，迅速到达受损组织和细胞发挥抗毒素作用，达到经济和高效的双重目的。

序列表

<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所

<120> 抗产气荚膜梭菌α毒素全人源单分子抗体7D-mFc及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

atggccgagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttagcagct atgccatgag ctgggtccgc 120

caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcagggattc cgaagcatgg tgggcgtaca 180

agttacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcgaaa 300

ggtgggacga tgtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc gagcggtgga 360

ggcggttcag gcggaggtgg cagcggcggt ggcgggtcga cggacatcca gatgacccag 420

tctccatcct ccctgtctgc atctgtagga gacagagtca ccatcacttg ccgggcaagt 480

cagagcatta gcagctattt aaattggtat cagcagaaac cagggaaagc ccctaagctc 540

ctgatctata gggcatcccg tttgcaaagt ggggtccaat caaggttcag tggcagtgga 600

tctgggacag atttcactct caccatcagc agtctgcaac ctgaagattt tgcaacttac 660

tactgtcaac aggggtcggc gcgtcctgcg acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc 720

aaacgggaat tcgacaaaac tcacacagct ccaccgggcc cagcacctga actcctgggg 780

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 960

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080

tccaaagcca aagagctcgg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140

cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1320

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422

<210> 1

<211> 473

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Gly Ile Pro Lys His Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Thr Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

130 135 140

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

145 150 155 160

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

165 170 175

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val

180 185 190

Gln Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

195 200 205

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

210 215 220

Gly Ser Ala Arg Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

225 230 235 240

Lys Arg Glu Phe Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Pro Gly Pro Ala Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

340 345 350

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Glu Leu Gly Gln

355 360 365

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

370 375 380

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

385 390 395 400

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

405 410 415

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

420 425 430

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

435 440 445

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

450 455 460

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470