阅读说明：本技术 一种从动物低核酸含量样品中提取病毒核酸的方法 (Method for extracting virus nucleic acid from animal low nucleic acid content sample ) 是由 梁伟能 赖鑫勇 梁伟滔 于 2020-06-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种能提高动物鼻咽拭子和咬绳唾液等杂质多基质复杂的样本的前处理方法,包括获取动物低核酸含量样品；低核酸含量样品的保护处理；样品混合液的离心处理,取下部包含纳米磁珠的沉淀部分作为待提取液待用；通过自动核酸提取仪对所述待提取液进行核酸提取等步骤。既能解决柱膜法操作繁琐,核酸回收率不高,也能解决传统自动磁珠法上样量小,不能提取颗粒物附着病毒核酸的问题,充分利用表面修饰磁珠的分散和收集方便的特点,进一步优化了传统自动磁珠法的操作方式,大大提高了动物鼻咽拭子和咬绳唾液等杂质多、基质复杂的样本的处理速度和核酸回收率。配合专用的PCR试剂,能较大幅度提高检测灵敏度,有效减少假阴性的产生。(The invention discloses a pretreatment method for a sample with complex impurity polybases, such as nasopharyngeal swab, sting saliva and the like of an animal, which comprises the steps of obtaining a sample with low nucleic acid content of the animal; protecting the sample with low nucleic acid content; centrifuging the sample mixed solution, and taking a sediment part containing the nano magnetic beads at the lower part as an extract to be used; and carrying out nucleic acid extraction on the extract to be extracted by an automatic nucleic acid extractor. The method can solve the problems that the column membrane method is complex to operate and the nucleic acid recovery rate is not high, the sample loading amount is small and the virus nucleic acid attached to particles cannot be extracted in the traditional automatic magnetic bead method, fully utilizes the characteristics of dispersion and convenient collection of surface modified magnetic beads, further optimizes the operation mode of the traditional automatic magnetic bead method, and greatly improves the processing speed and the nucleic acid recovery rate of samples with many impurities, complex matrix, such as animal nasopharynx swabs, biting saliva and the like. The special PCR reagent is matched, so that the detection sensitivity can be greatly improved, and the generation of false negative can be effectively reduced.)

一种从动物低核酸含量样品中提取病毒核酸的方法

技术领域

本发明涉及动物疫病检测技术领域，特别是一种用于早期动物疫病检测(荧光定量PCR法)前提升核酸提取效率方法，主要应用于从动物鼻咽拭子、咬绳唾液、环境等低核酸含量样品的核酸提取。

背景技术

在动物的疫病检测中，病毒核酸作为判断动物是否患病重要基础依据，因此，在样品中提取病毒核酸的效率直接影响疫病检测判断的准确性。现有提取核酸的方法主要有柱膜法和自动磁珠法。

其中柱膜法是将对核酸有吸附作用的官能团固定在离心柱膜上，通过加入不同的裂解试剂、洗涤试剂并反复离心，已达到核酸与杂质分离的目的，得到纯化的核酸。优点是得到的核酸纯度高，样品处理量大，缺点是操作繁琐，核酸回收率低，难于直接处理杂质多的样品，对吸附在颗粒物中的核酸更是无能为力(因为颗粒物会堵住柱膜，使实验难以进行，要提取杂质上附着的核酸，必须用稀释液把核酸从沉淀物中洗脱下来，再离心去沉淀才能过柱，非常麻烦，回收率还低)。

自动磁珠法是在磁珠表面修饰有对核酸有吸附作用的特定活性官能基团，通过不同的裂解液结合液洗涤液在特定的条件下能够与目的物质进行特异性结合，同时利用磁珠自身的磁性，在外磁场的作用下可以方便的实现定向移动与富集，从而达到核酸与杂质分离的目的，进而实现对目标物质的分离纯化，获得纯化核酸。优点是操作简单，可利用机械化实现高通量操作，配合核酸自动提取仪，在同一时间内可同时实现对数十样品的处理，效率直接提髙数十倍，极大的缩短了提取时间，满足了当前生物学高通量操作的要求，使得在大规模疫情爆发时能够进行快速筛查。此外，磁珠与核酸的特异性结合使得提取率大大增加，使得提取的核酸纯度高、浓度大，适合大规模养殖场发病时对无症状病例的快速筛查。缺点是取样量一般只有200到300μL，对感染早期病毒浓度低的样品就很容易出现漏检的情况。还有一个比较致命的问题是：部分动物的鼻咽拭子、咬绳中唾液样本中的病毒带有电荷，某些病毒会与样品中牙垢和饲料残渣紧密结合，而柱膜法或传统离心法因为不能处理杂质颗粒的原因，需要离心把颗粒物去掉，很大概率会把附着在颗粒物杂质上的病毒核酸也一并去掉，当遇到核酸含量低的样本时就很容易会导致提取不到足够的目标核酸，从而导致假阴性的产生。

发明内容

本发明上述问题，提供一种从动物低核酸含量样品中提取病毒核酸的方法。本发明的技术方案为：

一种从动物低核酸含量样品中提取病毒核酸的方法，包括以下步骤：

(1)获取动物低核酸含量样品；

(2)低核酸含量样品的保护处理，对低核酸含量样品添加样品电荷平衡液，得到样品混合液；

(3)样品混合液的离心处理，对样品混合液中加入纳米磁珠，进行离心处理，得到磁珠混合液；

(4)去除所述磁珠混合液上部的上清液，取所述磁珠混合液下部包含纳米磁珠的沉淀部分作为待提取液待用；

(5)通过自动核酸提取仪对所述待提取液进行核酸提取，得到病毒核酸。

作为本发明进一步地说明，所述低核酸含量样品为鼻咽拭子样品、咬绳唾液样品和环境样品。

更进一步地，所述步骤(2)中的电荷平衡液为包含抗生素的PBS溶液。

更进一步地，1L所述电荷平衡液中包含磷酸二氢钾(KH2PO4)0.20-0.4g，磷酸氢二钠(Na2HPO4.7H2O)1.2-1.8g，氯化钠(NaCl)8-10g，氯化钾(KCl)0.2-0.4g。

更进一步地，所述抗生素包括青霉素、链霉素和制霉菌素，所述青霉素在所述电荷平衡液中的浓度为2000IU/mL、所述链霉素在所述电荷平衡液中的浓度为2mg/mL，所述制霉菌素在所述电荷平衡液中的浓度为1000IU/mL。

更进一步地，所述电荷平衡液由经灭菌的稀盐酸调pH7.2—7.4。

更进一步地，所述步骤(3)中加入的纳米磁珠直径为10-15纳米。

更进一步地，步骤(4)中去除的上清液在所述磁珠混合液的占比大于等于四分之三，包含纳米磁珠沉淀部分的待提取液在所述磁珠混合液的占比小于等于四分之一。

更进一步地，所述步骤(5)中使用的核酸提取试剂盒为六个孔试剂盒，依次包括磁珠孔、裂解液孔、第一漂洗液孔、第二漂洗液孔、隔离孔和洗脱液孔。

更进一步地，所述六个孔试剂盒的裂解液孔中含有裂解液，裂解液组成包括3-6M盐酸胍、1％-4％曲拉通—100(Triton—100)、1.5％壬基酚聚氧乙烯醚(NP—40)、2％吐温-20(tween-20)、18mM三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl,pH7.0～7.5)、1.8mM乙二胺四乙酸(EDTA)、蛋白酶K20IU；其中所述蛋白酶K20IU外置，使用时加入。

本发明的有益效果：

本发明为动物疫病检测中动物鼻咽拭子和咬绳唾液等杂质多基质复杂的样本的前处理方法，既能解决柱膜法操作繁琐，核酸回收率不高，也能解决传统自动磁珠法上样量小，不能提取颗粒物附着病毒核酸的问题，充分利用表面修饰磁珠的分散和收集方便的特点，进一步优化了传统自动磁珠法的操作方式，大大提高了动物鼻咽拭子和咬绳唾液等杂质多、基质复杂的样本的处理速度和核酸回收率。配合专用的PCR试剂，能较大幅度提高检测灵敏度，有效减少假阴性的产生。通过创新的收集沉淀方式并巧妙利用磁珠提取基本不受颗粒物影响的特性，使用蛋白酶K及盐酸胍等裂解液使病毒中的核酸析出，并使用粒径较小的磁珠在颗粒物的缝隙中与核酸充分接触，利用纳米磁珠对核酸的吸附特性，最大限度的收集到了与附着在颗粒物上的核酸。同时在最初加入的磁珠又能结合整个样品中的游离核酸，达到了富集核酸的目的，有效弥补了自动核酸提取仪上样量不足的缺点。无论是游离的核酸，还是附着在颗粒物上的病毒核酸都得到了有效收集，核酸提取量达到了传统核酸提取一的2-4倍，柱膜法提取的3-8倍。

附图说明

图1为本发明病毒核酸提取方法的流程图。

具体实施方式

实施例：

下面结合附图对本发明实施例详细的说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

一种从动物低核酸含量样品中提取病毒核酸的方法，包括以下步骤：

(1)获取动物低核酸含量样品，该步骤中，包含以不同方式获得的多种动物低核酸含量样品，其中低核酸含量样品是指相对容易操作和获得的样品，例如鼻咽拭子样品、咬绳唾液样品和环境样品，这些样品中病毒带有电荷，某些病毒会与样品中牙垢和饲料残渣紧密结合杂质多、基质复杂；

(2)低核酸含量样品的保护处理，对低核酸含量样品添加样品电荷平衡液，与低核酸含量样品充分混合后得到样品混合液；

(3)样品混合液的离心处理，对样品混合液中加入纳米磁珠，进行离心处理，得到磁珠混合液；

(4)去除的上清液在所述磁珠混合液的占比大于等于四分之三，包含纳米磁珠沉淀部分的待提取液在所述磁珠混合液的占比小于等于四分之一；实际操作中，去除部分的上清液需要统一收集，高压灭菌后废弃，剩余部分沉淀及上清(含纳米磁珠)作为待提取液，可用于病毒核酸提取；

(5)通过自动核酸提取仪对所述待提取液进行核酸提取，得到病毒核酸。

以上方法过程中，步骤(2)中所使用的电荷平衡液可以是包含抗生素的PBS溶液，1L电荷平衡液中包含磷酸二氢钾(KH2PO4)0.20-0.4g，磷酸氢二钠(Na2HPO4.7H2O)1.2-1.8g，氯化钠(NaCl)8-10g，氯化钾(KCl)0.2-0.4g。以此为例在电荷平衡液的实际制备中，将上述磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾加入到大约800ml离子水充分搅拌溶解，然后加入稀盐酸调pH7.2—7.4，高温高压灭菌(15IB30mim),冷却后加入抗生素使之终浓度为：青霉素(2000IU/mL)、链霉素(2mg/mL)和制霉菌素(1000IU/mL)；加入抗生素后，pH值会降低，这时可用经灭菌的稀盐酸调pH7.2—7.4，最后定容到1L即得所述电荷平衡液。

以下分别针对鼻咽拭子样品、咬绳唾液样品、环境样品的提取方法进行说明：

鼻咽拭子样品：对待检动物进行鼻咽拭子样品采样，将采样后的鼻咽拭子头部置于1.5ml离心管中，加入样品电荷平衡液1.2ml，闭管后振荡30秒，静置10分钟备用。取出离心管中鼻咽拭子头部(约剩1.0ml液体)，往离心管中加入2.5微升纳米磁珠(磁珠直径10-15纳米)，轻轻振荡20秒，静置3分钟，4000转离心10秒，去除750微升上清液(上清液需统一收集，高压灭菌后才能废弃)，剩余约250微升沉淀及上清(含纳米磁珠)，使用一次性吸管把剩余沉淀及上清移到核酸提取仪深孔板的样品孔中。启动自动核酸提取仪进行正常核酸提取程序。

咬绳唾液样品：对待检动物进行咬绳唾液样品采样，将采样后新鲜咬绳置于采样袋中，往采样袋中加入样品电荷平衡液1.5ml,用手反复挤压采样袋中咬绳15秒，使样品电荷平衡液与咬绳中唾液充分混匀，静置5分钟，用力挤出1.5ml液体，使用一次性滴管吸取到1.5ml离心管中(尽量吸取样品袋中颗粒物)。往离心管中加入2.5微升纳米磁珠(磁珠直径10-15纳米)，轻轻振荡20秒，静置3分钟，4000转离心10秒，去除1250微升上清液(上清液需统一收集，高压灭菌后才能废弃)，剩余约250微升沉淀及上清(含纳米磁珠)，使用一次性吸管把剩余沉淀及上清移到核酸提取仪深孔板的样品孔中。启动自动核酸提取仪进行正常核酸提取程序。

环境样品：对待检动物进行环境样品采样，将采样后的拭子、纱布或颗粒等置于采样袋中，加入2ml样品电荷平衡液，用手把颗粒物挤碎，并使样品电荷平衡液与样品充分混合，静置10分钟，使用一次性滴管吸取1.5ml液体到1.5ml离心管中(尽量吸取样品袋中颗粒物)。往离心管中加入2.5微升纳米磁珠(磁珠直径10-15纳米)，轻轻振荡20秒，静置3分钟，4000转离心10秒，去除1250微升上清液(上清液需统一收集，高压灭菌后才能废弃)，剩余约250微升沉淀及上清(含纳米磁珠)，使用一次性吸管把剩余沉淀及上清移到核酸提取仪深孔板的样品孔中。启动自动核酸提取仪进行正常核酸提取程序。

利用自动核酸提取仪进行核酸提取的过程中，核酸提取试剂盒作为核酸提取仪配套使用的耗材，本实施例核酸提取方法过程中用到的核酸提取试剂盒为六个孔试剂盒。说明如下：

孔一为磁珠孔：含有磁珠0.6mg，磁珠为50～100nm二氧化硅包被磁珠；

孔二为裂解液孔：含有裂解液700μL，裂解液组成为3-6M盐酸胍、1％-4％曲拉通—100(Triton—100)、1.5％壬基酚聚氧乙烯醚(NP—40)、2％吐温-20(tween-20)、18mM三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl,pH7.0～7.5)、1.8mM乙二胺四乙酸(EDTA)、蛋白酶K20IU(使用时加入)；

孔三为第一漂洗液孔：含有第一漂洗液600μL，第一漂洗液组成为1.0-2.0M盐酸胍、0.5％到1.0％曲拉通—100(Triton—100)、0.5-1.0％吐温-20(tween-20)、18mM三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl,pH7.0～7.5)、1.8mM乙二胺四乙酸(EDTA)；

孔四为第二漂洗液孔：含有第二漂洗液600μL，第二漂洗液组成为1.7MNaCl、0.5％吐温-20(tween-20)、18mM三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl,pH7.0～7.5)、1.8mM乙二胺四乙酸(EDTA)；

孔五为隔离孔；

孔六为洗脱液孔：含有洗脱液100μL，洗脱液组成为18mM三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl,pH7.5～8.0)、1.5mM乙二胺四乙酸(EDTA)。

根据上述提取方法，对各种动物低核酸含量样品进行提取后得到的待提取液可以用所述六个孔试剂盒进行核酸提取，

核酸提取过程包括：

1、准备：使用前先向裂解液孔(第二孔)加入20IU蛋白酶K(1IU/μL)；

2、加样：向裂解液孔(第二孔)中加入上述待提取液250μL；

3、吸磁：将磁珠孔(第一孔)中的磁珠液快速震荡混合30S，吸磁30S；

4、裂解结合：将从第一孔中吸出的磁珠放入第二孔，70℃缓慢震荡480S，吸磁30S；

5、漂洗1：将从第二孔中吸出的磁珠放入第三孔，缓慢震荡60S，吸磁15S；

6、漂洗2：将从第三孔中吸出的磁珠放入第四孔，缓慢震荡60S，吸磁15S

7、洗脱：将从第四孔中吸出的磁珠取出，室温晾干120S，放入第六孔，80℃缓慢震荡120S，吸磁120S，提取出来的核酸最后保留在第六孔中；

8、弃磁珠：将从低六孔吸出的磁珠放回第一孔，快速震荡混合30S，弃入第一孔。

经上述操作后即得样品的病毒核酸提取结果，针对上述三种样品的提取测试，与传统磁珠法的前处理相比，以下分别给出三组Ct值实验测试对比数据：

鼻咽拭子样品核酸提取Ct值试验数据列表：

在该对比试验中，据PCR反应原理公式

Xn＝Xo(1+Ex)n

式中，n为扩增反应的循环次数；Xn为第n次循环后的产物量；Xo为初始模板量；Ex为扩增效率。

可知在实时荧光定量PCR反应中，在扩增产物达到阈值线时：

X_Ct＝X₀(1+E_x)^Ct

式中，X_Ct为荧光扩增信号达到阈值时的产物量；Xo为初始模板量；Ex为扩增效率；Ct为荧光扩增信号达到阈值时的循环次数。

注：下表中使用公式与此相同。

由上表知，使用新型处理方法得出的荧光扩增信号达到阈值时的循环次数(Ct值)比传统处理方法得出的平均Ct低0.9～2，平均Ct值低1.403，在扩增效率Ex在1～2时，可知新型收集的核酸含量比传统的核酸收集含量要高2～3倍。

咬绳唾液样品核酸提取Ct值试验数据列表：

在该对比试验中，通过上述表格核酸收集量的对比显示，相对于传统处理方法，使用新型处理方法得出的荧光扩增信号达到阈值时的循环次数(Ct值)比传统处理方法得出的平均Ct低1.5～2，平均Ct值低1.691，在扩增效率Ex在1～2时，可知新型收集的核酸含量比传统的核酸收集含量要高3～4倍。

环境样品核酸提取Ct值试验数据列表：

在该对比试验中，通过上述表格核酸收集量的对比显示，相对于传统处理方法，使用本发明处理方法得出的荧光扩增信号达到阈值时的循环次数(Ct值)比传统处理方法得出的平均Ct值低1.2～2，平均Ct值低1.473，，在扩增效率Ex在1～2时，可知新型收集的核酸含量比传统的核酸收集含量要高2～4倍。

以上仅就本发明较佳的实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例，其具体结构允许有变化，总之，凡在本发明独立权利要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明的保护范围内。