阅读说明：本技术 一种冻干保护剂及其在核酸扩增试剂中的应用 (Freeze-drying protective agent and application thereof in nucleic acid amplification reagent ) 是由 孙刚 朱晓进 范春雷 李铭夫 于 2020-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种冻干保护剂及其在核酸扩增试剂中的应用,所述冻干保护剂含有以下物质：海藻糖、甘露醇、β-环糊精、聚乙二醇8000和水。本发明的冻干保护剂可显著提高核酸扩增冻干试剂在室温条件下的运输和保存期限。另外,本发明通过减小试剂体积,缩短了冷冻干燥的工艺耗时,提高了生产效率,具有良好的应用前景。(The invention discloses a freeze-drying protective agent and application thereof in a nucleic acid amplification reagent, wherein the freeze-drying protective agent contains the following substances: trehalose, mannitol, beta-cyclodextrin, polyethylene glycol 8000 and water. The freeze-drying protective agent can obviously improve the transportation and storage life of the nucleic acid amplification freeze-drying reagent at room temperature. In addition, the invention shortens the time consumption of the freeze drying process and improves the production efficiency by reducing the volume of the reagent, thereby having good application prospect.)

一种冻干保护剂及其在核酸扩增试剂中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种冻干保护剂及其在核酸扩增试剂中的应用。

背景技术

尽管核酸扩增技术的发展早已成熟，并在生物医药领域实现了大规模产业化应用，但是核酸扩增试剂的运输和存储一直没能摆脱对冷链的依赖。核酸扩增试剂成分复杂，含有多种生物活性组分，任意一种组分的活性变化都会对试剂性能造成影响。为了保持试剂的生物活性，试剂厂家大多先将试剂的关键组分如酶类试剂与其他组分分开保存，然后进行冷链运输和冷冻保存。用户使用时，需按照特定的比例将各试剂组分混合使用。增加额外的操作步骤，不仅不便于用户操作，而且也增加了试剂交叉污染的风险。

冷冻干燥技术为核酸扩增试剂的运输和存储提供了新的方案。相比液体试剂，冻干试剂的生物活性更加稳定，并且可以做到全组分冻干，使用方便，用户加水就能快速复溶，无需混合试剂组分的操作。但是，冷冻干燥需要使用冻干保护剂，这无疑将向核酸扩增试剂中引入新的物质，影响试剂的工作效率。而且，冻干工艺本身也会导致核酸扩增试剂损失部分活性。最后，冻干工艺的耗时普遍需要20小时以上，增加了试剂生产的时间成本。因此，将冷冻干燥技术应用到核酸扩增试剂，需要进行系统性的研究和优化，做好试剂性能稳定性、活性损耗、成本效应等多方面的平衡。

CN105274192A、CN105349529A、CN106591432A等中国专利分别介绍了不同配方的冻干保护剂，及其在核酸扩增试剂方面的应用，初步证实了冷冻干燥技术对增强核酸扩增试剂稳定性方面的可行性。但是，上述专利普遍具有冻干体积较大的缺点，其冻干保护剂在缩短工艺耗时方面还有很大的改进空间。

发明内容

针对现有技术存在的上述技术问题，本申请的目的在于提供一种冻干保护剂及其在核酸扩增试剂中的应用，本申请提出一种适用于小体积核酸检测试剂的冻干保护剂，显著缩短了冻干工艺的耗时，降低生产成本的同时，提高了生产效率，具有大批量应用的广阔前景。

所述的用于核酸扩增试剂的冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂含有以下物质：海藻糖、甘露醇、β-环糊精和水。

所述的用于核酸扩增试剂的冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂含有以下物质：海藻糖、甘露醇、β-环糊精、聚乙二醇8000和水。

所述的用于核酸扩增试剂的冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂中，海藻糖质量浓度为35-45％，优选为40％；甘露醇质量浓度2％～5％，优选为5％；聚乙二醇8000质量浓度为1-3％，优选为2％；β-环糊精质量浓度为0.5-2％，优选为1％。

冻干保护剂在核酸扩增试剂中的应用，其特征在于，将所述冻干保护剂与核酸扩增试剂混合均匀，再进行冷冻干燥，即得到核酸扩增冻干试剂。

所述的冻干保护剂在核酸扩增试剂中的应用，其特征在于所述核酸扩增试剂包含以下成分：HiScript II逆转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、MgSO4、引物和荧光探针。

所述的冻干保护剂在核酸扩增试剂中的应用，其特征在于所述核酸扩增试剂不包含甘油，核酸扩增试剂的HiScript II逆转录酶和Taq DNA聚合酶均不含甘油。

所述的冻干保护剂在核酸扩增试剂中的应用，其特征在于冻干保护剂与核酸扩增试剂进行混合的体积比为1:3-5，优选为1:4。

所述的冻干保护剂在核酸扩增试剂中的应用，其特征在于所述冷冻干燥的工艺如下：

S1预冷冻阶段：于30-60分钟内温度下降至-50℃～-30℃并保持1-3小时；

S2升华干燥阶段：首先用20-40分钟抽真空至30-50Pa，再用2-4小时升温至-20℃～-10℃并保持2-5小时；

S3解析干燥阶段：首先用30-50分钟进一步抽真空至5-15Pa，再用1-3小时升温至10-25℃并保持1-4小时。

进一步地，所述冷冻干燥的工艺如下：

S1预冷冻阶段：于40分钟内温度下降至-40℃并保持2小时；

S2升华干燥阶段：首先用30分钟抽真空至40Pa，再用3小时升温至-15℃并保持3小时；

S3解析干燥阶段：首先用40分钟进一步抽真空至10Pa，再用2小时升温至20℃并保持2小时。

本发明公开了一种适用于核酸扩增试剂的冻干保护剂，以及适用于核酸扩增试剂的冷冻干燥工艺参数。本发明的冻干保护剂含有海藻糖、甘露醇、聚乙二醇8000和β-环糊精，可显著提高冻干试剂在室温条件下的运输和保存期限。另外，常规的核酸检测试剂，体积通常大于15μL，而本发明通过提高核酸检测试剂的组分浓度，将核酸检测试剂的体积缩小至5μL以下，这大大缩短了冷冻干燥的工艺耗时，提高了生产效率，具有良好的应用前景。

本发明使用海藻糖作为冻干保护剂的主要组分，其用途是为减少核酸扩增试剂中的酶类分子在冷冻干燥工艺中的活性损失。本发明使用甘露醇和聚乙二醇8000作为赋形剂，其用途是减少核酸检测试剂中有效成分(如引物、荧光探针、dNTP等)在冷冻干燥过程中的挥发损耗，同时使冷冻干燥后的核酸扩增试剂外型维持一定的物理结构和强度。甘露醇工作浓度2％～4％，优选的，浓度4％。聚乙二醇8000工作浓度1％～2％，优选的，浓度1％。

本发明通过提高核酸扩增试剂的组分浓度，减少其冻干前的初始体积，进而缩短冷冻干燥工艺的持续时间。为了防止试剂中的某些组分，如：引物、荧光探针、dNTP、MgSO4等因浓度升高结晶析出，进而影响酶类组分的活性，本发明使用了β-环糊精作为掩蔽剂，利用β-环糊精分子外部疏水、内部亲水的特性保护酶类分子，增强酶类分子在冷冻干燥过程中的生物活性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1：

冻干保护剂组分测试，操作步骤如下：

1.冻干保存液配制：依据表1配制7组冻干保护剂，并用ddH₂O定容至100mL。

表1冻干保护剂组分配制表

编组	海藻糖	甘露醇	聚乙二醇8000	β-环糊精
					1	40g	4g	2g	1g
2	40g	2g	2g	1g
					3	40g	-	2g	1g
4	40g	4g	1g	1g
					5	40g	4g	-	1g
6	40g	4g	2g	2g
					7	40g	4g	2g	-

表1中，海藻糖、甘露醇、聚乙二醇8000、β-环糊精均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，ddH₂O购自Thermo Fisher Scientific公司。

2.核酸扩增试剂配制：依照表2配制核酸扩增试剂，数量150测试。

表2核酸扩增试剂配制表

编号	组分	保存浓度	体积	工作浓度
					1	正向引物	20μM	0.2μL	0.8μM
2	反向引物	20μM	0.2μL	0.8μM
					3	荧光探针	20μM	0.1μL	0.4μM
4	dNTPMix	10mM	1.2μL	3mM
					5	MgSO4	100mM	0.8μL	20mM
6	HiScriptII逆转录酶	200U/μL	0.02μL	4U
					7	TaqDNA聚合酶	10U/μL	0.1μL	1U
8	ddH2O	-	1.38μL	-
					9	总体积	-	4μL	-

表2中：

正向引物序列：5’-ACCACCAACTGCTTAGCACCC-3’

反向引物序列：5’-GCAGTGATGGCATGGACTGT-3’

荧光探针序列：5’-FAM-TCCATGACAACTTTGGTATCGT-BHQ1-3’

引物和荧光探针、MgSO4订购自生工生物工程(上海)股份有限公司，HiScript II逆转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTP Mix订购自南京诺唯赞生物科技有限公司，ddH2O购自Thermo Fisher Scientific公司。

3.冷冻干燥

将按照表2配制的工作浓度下的核酸扩增试剂，与按照表1配制的7组冻干保护剂均以4:1的体积比混合均匀，分别得到7组核酸扩增体系混合液。每组核酸扩增体系混合液均以5μL/管分装至PCR管，每组12只PCR管。按照以下程序进行冷冻干燥：

预冷冻阶段，60分钟温度下降至-50℃，保持3小时；

升华干燥阶段，30分钟抽气至40Pa，4小时升温至-15℃，保持5小时；

解析干燥阶段，40分钟抽气至10Pa，3小时升温至20℃，保持4小时，即得到核酸扩增冻干试剂。

表2配制的核酸扩增试剂，与按照表1配制的7组冻干保护剂混合均匀，再进行冷冻干燥，分别得到7组核酸扩增冻干试剂，编号分别为组1～组7。

4.包装：迅速取出PCR管，盖紧管盖，装入含有干燥剂的真空包装袋，抽气避光保存，由此7组核酸扩增冻干试剂的PCR管分别进行外包装。

5.样本处理：使用多个咽拭子采集人口腔上皮细胞，混合洗脱至10mLPBS缓冲液的样本池。使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司)提取样本池中口腔上皮细胞核酸。每200μL样本洗脱至40μL体积，将洗脱液混合成洗脱液池。

6.试剂复溶：打开上述7组冻干试剂的PCR管外包装。观察并记录冻干试剂的外观形态，结果如表4所示。每组核酸扩增冻干试剂的PCR管均有12只，向每组的10管冻干试剂中均加入含口腔上皮细胞核酸的洗脱液，每管20μL；每组的剩余2管均加入20μL ddH2O，作阴性对照。

7.液体试剂对照组：本组为未经过冷冻干燥工艺的液体试剂对照组(即为表2配制的工作浓度下的核酸扩增试剂)，数量12测试，每测试4μL体积。向本组10管试剂管中加入含口腔上皮细胞核酸的洗脱液，每管16μL；剩余的2管均加入16μL ddH2O，作阴性对照。

8.逆转录PCR：依照表3设置RT-PCR反应程序。程序结束后计算各冻干组的Ct值均数和标准差。RT-PCR反应程序分为先后依次进行的三个反应阶段，分别为逆转录、预变性和指数扩增阶段，三个反应阶段的条件参数如表3所示。

表3 RT-PCR程序参数表

所述逆转录阶段，温度优选55℃，时间15分钟。所述预变性阶段，变性温度94℃，变性时间3分钟。所述指数扩增阶段，分为先后进行的变性反应过程和退火/延伸过程，变性温度94℃，变性时间15秒；退火/延伸温度58℃，退火/延伸时间30秒。

8.结果记录：

1)各组冻干试剂的外观记录如表4所示。从表4中可以看出，组1、组2、组4、组7的冻干试剂外观较为理想。

表4冻干试剂的外观

2)各组冻干试剂和液体对照试剂的10个阳性结果的Ct值均数和标准差如表5所示。与对照组的液体试剂相比，各组冻干试剂的性能均出现下降，组1的冻干试剂活性相对最好。

表5冻干试剂的Ct值均数和标准差

实施例2：

冷冻干燥工艺参数优化，操作步骤如下：

1.按照如下配方配制冻干保存液：海藻糖40g，甘露醇4g，聚乙二醇80002g，β-环糊精1g，ddH2O定容至100mL。

2.按照表2配制工作浓度下的核酸扩增试剂，数量60测试。

3.将按照表2配制的核酸扩增试剂，与实施例2步骤1配制的冻干保护剂均以4:1的体积比混合均匀，得到核酸扩增体系混合液。核酸扩增体系混合液以5μL/管分装至PCR管，将其平均分为4组，每组12只PCR管。

上述4组试剂分别进行冷冻干燥，冷冻干燥的程序均包括依次进行的预冷冻阶段、升华干燥阶段及解析干燥阶段，相应的运行参数表分别如表6.1、表6.2和表6.3所示。

表6.14组PCR管内的核酸扩增体系混合液进行预冷冻的运行参数对比表

表6.24组PCR管内的核酸扩增体系混合液进行升华干燥的运行参数对比表

表6.34组PCR管内的核酸扩增体系混合液进行解析干燥的运行参数对比表

表6.1、表6.2和表6.3中，组1-对照组，组2-缩减1小时预冷冻时间；组3-缩减1小时升温时间和2小时升华干燥时间；组4-缩减1小时升温时间和2小时解析干燥时间。

4.包装：迅速取出PCR管，盖紧管盖，装入含有干燥剂的真空包装袋，抽气避光保存，由此4组核酸扩增冻干试剂的PCR管分别进行外包装。

5.样本处理：使用多个咽拭子采集人口腔上皮细胞，混合洗脱至10mLPBS缓冲液的样本池。使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司)提取样本池中口腔上皮细胞核酸。每200μL样本洗脱至40μL体积，将洗脱液混合成洗脱液池。

6.试剂复溶：打开上述4组冻干试剂的PCR管外包装。观察并记录冻干试剂的外观形态。每组核酸扩增冻干试剂的PCR管均有12只，向每组的10管冻干试剂中均加入含口腔上皮细胞核酸的洗脱液，每管20μL；每组的剩余2管均加入20μL ddH2O，作阴性对照。

7.逆转录PCR：依照表3设置RT-PCR反应程序。程序结束后计算各冻干组的Ct值均数和标准差。

8.结果记录：

1)组1-组4的冻干试剂外观均结构完好，表面光洁，未见明显差别。

2)各组冻干试剂的Ct值均数和标准差如表7所示。组1-组4的冻干试剂活性未见明显差别。

表7冻干试剂的Ct值均数和标准差

实施例3

37℃温度下模拟运输试验，操作步骤如下：

1.冻干保存液配制：海藻糖40g，甘露醇4g，聚乙二醇80002g，β-环糊精1g，ddH2O定容至100mL。

2.按照表2配制工作浓度下的核酸扩增试剂，数量200测试。

3.将按照表2配制的核酸扩增试剂，与实施例3步骤1配制的冻干保护剂均以4:1的体积比混合均匀，得到核酸扩增体系混合液。核酸扩增体系混合液以5μL/管分装至PCR管，将其平均分为10组，每组12只PCR管。将其中的5组试剂，按照表6.1～6.3中组4的工艺参数进行冷冻干燥。另外5组试剂临时保存于-20℃冰柜。

4.包装：迅速取出经过冻干处理的PCR管，盖紧管盖，以12管/包的规格装入含有干燥剂的真空包装袋，抽气避光保存，标记为冻干试剂包。未经过冻干处理的PCR管，同样采用含有干燥剂的真空包装抽气避光保存，标记为液体试剂包。

5.模拟运输：将上述10组PCR管放入摇床，温度设置37℃，震荡速度100rpm。分别在放置的第1天、第3天、第7天、第10天和第14天，取出冻干试剂包和液体试剂包，存放于-20℃冰柜冷冻。模拟运输第14天后，统一评估冻干试剂的性能变化。

6.样本处理：使用多个咽拭子采集人口腔上皮细胞，混合洗脱至10mLPBS缓冲液的样本池。使用RNeasyMini Kit(QIAGEN公司)提取样本池中口腔上皮细胞核酸。每200μL样本洗脱至40μL体积，混合成洗脱液池。

7.试剂复溶：打开上述5组冻干试剂的PCR管外包装。观察并记录冻干试剂的外观形态。向每组的10管冻干试剂中加入含口腔上皮细胞核酸的洗脱液，每管20μL，每组的剩余2管加入20μL ddH2O，作阴性对照。

8.液体试剂对照组：打开上述5组液体试剂的PCR管外包装，向每组的10管液体试剂中加入含口腔上皮细胞核酸的洗脱液，每管20μL，每组的剩余2管加入20μL ddH2O，作阴性对照。

9.逆转录PCR：依照表3设置RT-PCR反应程序。程序结束后计算各冻干组的Ct值均数和标准差。

10.结果记录：

1)5组经过不同时间模拟运输测试的冻干试剂外观均结构完好，表面光洁，与未经过加速处理的冻干试剂相比，未见明显差别。

2)各组冻干试剂的Ct值均数和标准差如表8所示。与液体试剂相比，冻干试剂在模拟运输中表现出更加稳定的性能。

表8冻干试剂的Ct值均数和标准差

实施例4：

室温保存试验，操作步骤如下：

1.冻干保存液配制：海藻糖40g，甘露醇4g，聚乙二醇80002g，β-环糊精1g，ddH2O定容至100mL。

2.按照表2配制工作浓度下的核酸扩增试剂，数量200测试。

3.将按照表2配制的核酸扩增试剂，与实施例4步骤1配制的冻干保护剂均以4:1的体积比混合均匀，得到核酸扩增体系混合液。核酸扩增体系混合液以5μL/管分装至PCR管，将其平均分为10组，每组12只PCR管。将其中的5组试剂，按照表6.1～6.3中组4的工艺参数进行冷冻干燥。另外5组试剂临时保存于-20℃冰柜。

4.包装：迅速取出经过冻干处理的PCR管，盖紧管盖，以12管/包的规格装入含有干燥剂的真空包装袋，抽气避光保存，标记为冻干试剂包。未经过冻干处理的PCR管，同样采用含有干燥剂的真空包装抽气避光保存，标记为液体试剂包。

5.室温保存：将上述10组PCR管室温放置。分别在放置的第1天、第7天、第14天、第21天和第28天，取出冻干试剂包和液体试剂包，分别存放于-20℃冰柜冷冻。室温保存28天后，统一评估冻干试剂的性能变化。

6.样本处理：使用多个咽拭子采集人口腔上皮细胞，混合洗脱至10mLPBS缓冲液的样本池。使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司)提取样本池中口腔上皮细胞核酸。每200μL样本洗脱至40μL体积，混合成洗脱液池。

7.试剂复溶：打开上述5组冻干试剂的PCR管外包装。观察并记录冻干试剂的外观形态。向每组的10管冻干试剂中加入含口腔上皮细胞核酸的洗脱液，每管20μL，每组的剩余2管加入20μL ddH2O，作阴性对照。

8.液体试剂对照组：打开上述5组液体试剂的PCR管外包装，向每组的10管液体试剂中加入含口腔上皮细胞核酸的洗脱液，每管20μL，每组的剩余2管加入20μL ddH2O，作阴性对照。

9.逆转录PCR：依照表3设置RT-PCR反应程序。程序结束后计算各冻干组的Ct值均数和标准差。

10.结果记录：

1)5组经过不同室温保存测试的冻干试剂外观均结构完好，表面光洁，与未经过室温保存的冻干试剂相比，未见明显差别。

2)各组冻干试剂的Ct值均数和标准差如表9所示。冻干试剂尽管出现了性能的部分下降，但与液体试剂相比，在室温保存试验中表现出更加稳定的性能。

表9冻干试剂的Ct值均数和标准差

本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。