阅读说明：本技术 落射顶锥壳层光超解析系统及显微镜 (Light super-resolution system for epi-tip cone shell and microscope ) 是由 江安世 朱丽安 张炜堃 林彦颖 于 2019-03-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种落射顶锥壳层光超解析系统及落射荧光显微镜。落射顶锥壳层光超解析系统包含：发光元件、透镜组及物镜。发光元件发出的激发光通过透镜组后折射为环形光,并聚焦至物镜的后物镜后焦平面,物镜将环形光聚焦形成环形光锥并聚焦于样本位置,环形光锥具有固定的厚度。此外,激发及取像皆使用同一物镜,进而达成落射荧光显微镜。(The invention provides an epi-illumination tip cone shell light super-resolution system and an epi-illumination fluorescence microscope. The falling-incidence top cone shell light super-resolution system comprises: light emitting element, lens group and objective lens. The exciting light emitted by the light-emitting element is refracted into annular light after passing through the lens group and is focused to a back focal plane of the objective lens, the objective lens focuses the annular light to form an annular light cone and focuses the annular light cone on a sample position, and the annular light cone has a fixed thickness. In addition, the same objective lens is used for both excitation and image capture, thereby achieving the fluorescence microscope.)

落射顶锥壳层光超解析系统及显微镜

技术领域

本发明涉及一种落射顶锥壳层光超解析系统，特别涉及一种产生环形光锥的落射顶锥壳层光超解析系统及包含其的落射荧光显微镜。

背景技术

现今对生物组织的研究中，透过光学显微镜来观察是不可或缺的技术，一般的光学显微镜须将样本制成薄片，再以光源辅助使其便于观察。而在将样本制成薄片的时候，不可避免的会对组织产生破坏，甚至使样本原本应具有的特征消失。

然而，当要观察的样本具有厚度时，反射光仅能观察表面，而穿透光又难以穿透样本，造成对样本观察或是摄影上的困难。为了解决这个问题，应用荧光的荧光显微术应运而生。此种荧光显微术即是透过对目标组织接合荧光蛋白，或是直接对组织以荧光染剂染色以进行后续观察。

接着，含有荧光物质的样品在受到激发光的照射下产生荧光，使得观察者收集这些荧光讯号后，得到样品的荧光影像；但随着照射的时间以及强度，会让可发光的荧光分子数量逐渐减低，最终，因荧光分子用罄而无法观察荧光影像。

在传统样品激发的方式(垂直穿透)下观察厚样品，由于不论是在观察/取像样品的哪一层(垂直深度的位置)，都可能同时地造成非观察层(即，非影像焦平面)荧光分子的耗竭，以至于越后面取像层的讯号越衰弱，甚至与噪声无异。

为解决上述问题，在现有技术中，已知使用双镜头层光显微术(light-sheet)及双光子显微术(two-photon)来避免非焦光平面的荧光分子消耗，但双镜头层光显微术为了同时只激发整个成像平面的荧光分子，需要较复杂的光路设计，而后者使用的双光子雷射原售价昂贵，在实际应用上会产生不小的限制。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种落射顶锥壳层光超解析系统，在能够针对特定取像平面的荧光物质进行激发，得到具有深度信息的影像并能建构出立体图像之余，还能简化构造，降低装置成本。

根据本发明的目的，提供了一种落射顶锥壳层光超解析系统，包含：发光元件，产生第一激发光；透镜组，由多个透镜组成，透镜组包含第一透镜以及第二透镜；其中第一透镜为锥透镜，第一透镜位于发光元件与第二透镜之间，第一透镜与第二透镜隔有第一预定距离，第一透镜的锥面背向发光元件，并将第一激发光折射为厚度固定的环形激发光；第二透镜将环形激发光聚焦至物镜后焦平面；分色滤镜，用于反射环型激发光；以及物镜，为凸透镜，位于物镜后焦平面与样本之间，将聚焦的环形激发光扩张至样本宽度，并将环型激发光聚焦于样本位置；其中环形激发光聚焦于样本位置前的能量低于激发阈值，而聚焦于样本位置时的能量总和高于激发阈值。

优选地，落射顶锥壳层光超解析系统可进一步包含放大镜片组，位于发光元件与透镜组之间，由一对凸透镜组成，将第一激发光从第一宽度扩张至第二宽度，并将第一激发光准直。

优选地，落射顶锥壳层光超解析系统的第二透镜可包含锥透镜及微透镜阵列，锥透镜的锥面面向第一透镜并将环型激发光准直后照射至微透镜阵列，微透镜阵列将该环形激发光以微透镜阵列中的多个微凸透镜分别聚焦，构成多个第二激发光，多个第二激发光呈环形排列，且多个第二激发光的焦点位于物镜后焦平面。

优选地，微透镜阵列为最密堆积或棋盘堆积。

优选地，第二透镜为凸透镜。

优选地，发光元件可包含滤色片，用于改变第一激发光的波长。

本发明还提供了一种落射荧光显微镜，包含上述的落射顶锥壳层光超解析系统；影像撷取装置，撷取样本所发出的荧光；载物台，位于样本位置且承载样本；调节轮，调节载物台的高度；以及目镜，用于成像至影像撷取装置。

[发明的作用与效果]

承上所述，依本发明的落射顶锥壳层光超解析系统，其可具有一或多个下述优点：

(1)透过本发明的落射顶锥壳层光超解析系统，可以对有厚度的样本进行荧光激发。

(2)在激发样本中的荧光物质时，可以仅激发特定区域的荧光物质，使其他区域的荧光物质仍保留荧光活性。

(3)可以透过激发不同深度的样本以得到立体的样本信息，并且可以透过简单的结构来降低装置的成本。

(4)可透过本发明的落射荧光显微镜，使用更高数值孔径的物镜，以达成更佳的影像分辨率和质量。

附图说明

图1为依据本发明实施例的落射顶锥壳层光超解析制系统的结构示意图。

图2为依据本发明另一实施例的落射顶锥壳层光超解析制系统的结构示意图。

图3为传统荧光显微镜的光路的特性，其中(A)为传统荧光显微镜照射样本时的光路示意图、(B)为对应于(A)中光路在不同高度的激光强度的示意图、(C)为光路在XY、XZ剖面的示意图。

图4为传统荧光显微镜的光路施用于样本后残余的荧光的照片。

图5为依据本发明的落射顶锥壳层光超解析系统的光路的特性，其中(A)为本发明的落射顶锥壳层光超解析系统照射样本时的光路示意图、(B)为对应于(A)中光路在不同高度的激光强度的示意图、(C)为光路在XZ剖面的示意图。

图6为依据本发明的落射顶锥壳层光超解析系统的光路施用于样本后残余的荧光的照片。

附图标记说明

1、2：落射顶锥壳层光超解析系统

10、110：发光元件

100、1100：第一激发光

101、1101：环形激发光

102：第二激发光

1104：聚焦的环形激发光

106：激发光束

107：环形光锥

20、120：透镜组

21、121：第一锥透镜

22：第二锥透镜

123：第三凸透镜

200、1200：第一宽度

201、1201：第二宽度

202：样本宽度

30：微透镜阵列

300、1300：样本位置

301、302：样本

40、140：物镜后焦平面

50、150：放大镜片组

51、151：第一凸透镜

52、152：第二凸透镜

60、160：目镜

70、170：影像撷取装置

80、180：分色滤镜

具体实施方式

为利了解本发明的技术特征、内容与优点及其所能达成的功效，将本发明配合附图，并以实施例的表达形式详细说明如下，而其中所使用的图式，其主旨仅为示意及辅助说明书之用，未必为本发明实施后的真实比例与精准配置，故不应就所附的图式的比例与配置关系解读、侷限本发明于实际实施上的权利范围。

以下将参照相关图式，说明依本发明的落射顶锥壳层光超解析系统的实施例，为使便于理解，下述实施例中的相同元件以相同的符号标示来说明。

请参照图1，图1为依据本发明实施例的落射顶锥壳层光超解析系统应用于共轭焦荧光显微镜的结构示意图。落射显微镜指激发光通过物镜照射在样本上，且样本被激发后所产生的被激发光透过相同物镜放大，以透过目镜观察的显微镜。本发明实施例的落射顶锥壳层光超解析系统1可包含：发光元件10、透镜组20、微透镜阵列30、物镜40、放大镜片组50、目镜60、影像撷取装置70以及分色滤镜80。

发光元件10发出具有第一宽度200的第一激发光100，为控制环形光锥的厚度，可在第一激发光100的光路上设置放大镜片组50，放大镜片组50可由第一凸透镜51、第二凸透镜52组成，透过第一凸透镜51将第一激发光100折射后，通过第二凸透镜52将扩张至第二宽度201后的第一激发光100准直以得到具有第二宽度201的第一激发光。透镜组20可由锥面彼此相对的第一锥透镜21与第二锥透镜22组成，当第一激发光100通过第一锥透镜21时，将被折射为厚度固定的环形激发光101，并由第二锥透镜22将环形激发光101准直，第一锥透镜21与第二锥透镜22之间具有第一预定距离。

准直后的环形激发光101接着通过微透镜阵列30，此微透镜阵列30可为棋盘堆积或最密堆积。棋盘堆积为微透镜在平面上以彼此垂直的两方向上延伸排列，每个微透镜与四个微透镜相邻接，构成类似棋盘的方正结构；最密堆积为每个微透镜与六个微透镜相邻接，构成类似蜂巢的六边形结构，在平面上能够堆积最多微透镜的排列方式。微透镜阵列30可以将平行的光源分别聚焦为构成多个第二激发光102，且多个第二激发光102呈环形排列，并且分别聚焦于物镜后焦平面400上，且此时多个第二激发光102所构成的环形的直径与准直后的环形激发光101直径相同。

接着，呈环形排列的多个第二激发光102通过凸透镜的物镜40时，将会被折射成具有样本宽度202的圆锥状激发光，并且聚焦于样本位置300。此处透过微透镜阵列30聚焦而改变光的行进路线，并且配合物镜的凸透镜特性，可以使圆锥状激发光的样本宽度202维持固定，而不会在光路的不同位置出现不同宽度，可以确保在样本位置300处的光束不会发生形变，进而可以确保在样本位置300处的激发光强度足以激发其中的荧光物质。在激发光抵达样本位置300后，此处的样本中的荧光物质将会被超过阈值的激发光激发而开始发出荧光。

在包含依据本发明的落射顶锥壳层光超解析系统1的落射荧光显微镜中，可包含目镜60及影像撷取装置70，样本被激发后所产生的荧光可以经由目镜60成像后以影像撷取装置70撷取，以进行后续的影像处理。此荧光显微镜还可包含承载样本的载物台以及调节样本位置的调节轮。此荧光显微镜可为一般的显微镜，亦可为共轭焦显微镜，可在目镜60与影像撷取装置70之间进一步包含具有针孔的档板，以阻挡非来自物镜后焦平面的散射光进入影像撷取装置70，藉此提升所得到的影像的清晰度并得到更高的对比度。在另一个实施例中，可以透过调节第一预定距离来改变环形激发光101的直径，环形激发光101直径的变化会影响环形激发光101通过微透镜阵列30的位置，进而改变后续聚焦后样本位置300的位置。例如当第一预定距离缩短时，环形激发光101的直径变小，在通过微透镜阵列30聚焦时所产生的多个第二激发光102所构成的环形的直径也会变小，在经过物镜40后聚焦的样本位置300将会离物镜40更近。

在此种落射荧光显微镜中，由于可以选择数值孔径更高的物镜来作为激发和取像的镜头，所成像的物理分辨率便可以显著的提升。在作为随机定域光学重组超解析显微镜时，此一镜头的特性可以显著的提升定域点的精确度和重组影像的分辨率。

此外，发光元件10还可以包含滤色片以提供适合激发各种不同荧光物质的光源，亦可以直接具有多种光源。在其他的实施例中，发光元件10仅发出单种激发光，而在激发光的光路上设置滤色片以达成对应不同荧光物质的效果，例如设置在发光元件10与放大镜片组50之间、放大镜片组50与透镜组20之间、透镜组20与微透镜阵列30之间、微透镜阵列30与物镜40之间，或任何适当的位置。

接着参考图2，图2为依据本发明另一实施例的落射顶锥壳层光超解析制系统2的结构示意图。在此实施例中，可以利用一个第三凸透镜123取代第二锥透镜22以及微透镜阵列30；为利用第一锥透镜121和第三凸透镜123在适当间距下做出环形光直径约略等于物镜140的后孔径且环形光径不随距离变化，而在第三凸透镜123的后聚焦面上聚焦成细线的环形激发光1104。而此时第三凸透镜123距离物镜140的距离将必须为第三凸透镜123的焦距，且环形光的直径也需小于等于物镜140的后孔径。相较于原本实施例中，第二锥透镜122和物镜140之间的距离除了机构限制外，其他则基本上不受限制。

接着以实际例子对本发明的落射顶锥壳层光超解析系统应用于共轭焦荧光显微镜，并以具有厚度的样本(果蝇眼)说明本发明的效果。

首先将样本以荧光染剂进行染色，接着分别以传统激发光束以及包含本发明的落射顶锥壳层光超解析系统对样本进行荧光激发，之后再以共轭焦荧光显微镜对样本取像，以观察荧光物质消耗的状况。为使本发明的环形光锥效果更为明显，在激发时将激发光强度控制为可激发荧光物质的强度。

图3为传统荧光显微镜的光路的特性，如图3的(A)所示，当激发光束106以圆柱状通过具有厚度的样本301时，在激发光束106对样本中的荧光物质在对应于图3的(A)的高度所施加的激发光强度如图3的(B)所示，不管在任意高度中激发光强度均高于阈值。图3的(C)的上图为以XY平面为剖面的示意图，下图则为以XZ平面为剖面的示意图，当激发光束106通过时，在Z轴上的任意XY剖面皆可以看到如图3的(C)的上图的被激发样本分布呈圆形(白色处)，而在XZ平面上可以看到如图3的(C)的下图所示的被激发样本分布呈长条型(白色处)，即是整个圆柱状的光柱所经过的样本中的荧光物质皆会被激发。

图4为以传统激发光束激发后，再将整体样本激发观察的照片，在图4的(A)、(D)中可以看出样本中间有黯淡的圆形痕迹(箭头处所示)，即为图3的(C)的上图所示的XY剖面的实际例子。而在图4的(B)、(C)中则可以看到黯淡的长条型痕迹(箭头处所示)，即为图3的(C)的下图所示的XZ剖面的实际例子。此即为传统激发光束将路径中样本的荧光物质消耗殆尽的证据。

图5是本发明的落射顶锥壳层光超解析系统的光路的特性，图5的(A)为其所产生的环形光锥107通过有厚度的样本302时的示意图，对应于图5的(A)的对样本在不同高度所通过的激发光量如图5的(B)所示，由于单一的激发光的激发光强度均低于阈值而不会激发样本中的荧光物质，仅有在样本位置处(激发光交会处)会超出阈值，而因此激发样本中的荧光物质。因此，以本发明的落射顶锥壳层光超解析系统所产生的环形光锥的路径(白色处)会如图5的(C)所示呈现X型，并且仅有在环形光锥所交会的样本位置(圆圈斜纹处)的样本会被激发。

图6为使用本发明的落射顶锥壳层光超解析系统的激发光激发后再将整体样本激发观察的照片(为使效果清楚，此处使用高于阈值的激发光强度)。图6的(A)及(D)可见到类似环形的圆形痕迹(箭头处)，为较样本位置略下方(远离物镜)的XY剖面处的照片，显示样本302在经过本发明的环形光锥激发后，在其下方的样本仍具有未被激发的荧光物质可供激发。在图6的(B)中的光源方向为从右侧向左侧，图6的(C)中的光源方向为从下侧向上侧，其中隐约可见有X字型的黯淡痕迹(箭头处)，此X字型即为环形光锥在XZ剖面所经过的路径，显示了本发明的激发光束调制系统确实可以产生环形光锥，并且聚焦于所需的位置。如此，透过本发明的落射顶锥壳层光超解析系统可以对取像平面的样本进行荧光激发，透过影像撷取装置撷取影像和Z轴调节机构上升或下降后，即能透过影像软件拼凑出指定样本部位的立体影像。以上所述仅为举例性，而非为限制性者。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改或变更，均应包含于后附的申请专利范围中。