阅读说明：本技术 用于经由多视图成像的三维荧光偏振的系统和方法 (System and method for three-dimensional fluorescence polarization via multi-view imaging ) 是由 H.施罗夫 A.库马尔 S.B.梅塔 P.J.拉里维尔 R.奥尔登伯格 Y.吴 T.钱德 于 2018-05-31 设计创作，主要内容包括：公开了用于三维荧光偏振激发的系统和方法,该系统和方法生成三维或更多维度的荧光分子的位置和取向的图。(Systems and methods for three-dimensional fluorescence polarization excitation are disclosed that generate maps of the position and orientation of fluorescent molecules in three or more dimensions.)

用于经由多视图成像的三维荧光偏振的系统和方法

技术领域

本公开涉及用于三维荧光偏振激发的系统和方法，并且具体地涉及荧光显微镜，该荧光显微镜生成三维或更多维度的荧光分子的位置和取向的图。

背景技术

包括荧光蛋白的大多数荧光团吸收并发射光作为偶极子(dipole)。这创造了机会以不仅揭示荧光团及其所结合的分子组装体的位置，而且揭示它们的取向。被装备来激发和/或检测偏振荧光的偏振光显微镜已经利用了此机会。分子组装体的取向和动力学确定细胞功能或疾病的方向性。例如，在伤口愈合或转移期间的定向细胞迁移依赖于生成朝向迁移方向的净力的模式化的肌动蛋白网络的流动。

通过使用用于偶极子激发的偏振光或偶极子发射的偏振分析或两者来揭示分子取向。然而，当前的显微镜从单个视图方向照射样品并对样品成像。相应地，激发光和发射的荧光的偏振主要在垂直于照射/视图方向的平面中限定，如图2A和图2B所示。平行于照射/视图方向的偶极子既不能被激发也不能被有效地检测，因而使得难以或甚至不可能确定与三维结构结合的荧光团的完整取向分布。

正是基于这些观察，构思和开发了本公开的各个方面。

具体实施方式

如本文所述，用于扩展荧光偏振成像的系统和方法，以使由样品发射的荧光染料的偶极子矩可以被激发而与偶极子的三维取向无关。在一方面，偶极子从多个方向被激发，从而确保即使偶极子不利地取向为沿着检测物镜的轴向(传播)轴，样品的激发也沿着多个取向发生。在一个实施例中，双视图倒置选择性平面照射显微镜(dual-view invertedselective-plane illumination microscope，diSPIM)被用于照射样品，并检测样品从彼此为不平行关系的两个不同方向发射的所得的偏振荧光发射。在一个实施例中，样品的偏振分辨激发和发射的偏振荧光的落射检测，沿着用于激发样品并检测发射的荧光的相同的激发/检测物镜的焦平面，来捕获激发偶极子的三维取向。在一个实施例中，以交替的激发顺序的样品的偏振分辨激发和由样品发射的荧光的非平行检测，捕获激发偶极子的三维取向在各个检测目标的轴向或子午平面上的大部分投影。在一个实施例中，系统包括与一个或多个检测器进行操作性通信的处理器，一个或多个检测器用于捕获与在由一个或多个物镜透镜检测到的样品所发射的偏振荧光发射中检测到的，每个激发偶极子的位置和三维取向有关的数据。处理器可操作用于计算在被照射的样品所发射的荧光发射中检测到的每个体素中的激发偶极子的三维取向和位置。在一些实施例中，系统捕获具有不同激发极化的多个图像，以使处理器可以确定由一个或多个检测器检测到的每个激发偶极子的位置和三维取向。参考附图，在图1-4中示出了用于确定被照射的样品的每个体素的三维偶极子取向和位置的系统的实施例，并一般地指示为100。

参考图1，示出了被标示为100的荧光显微镜系统的一个实施例。在一方面，荧光显微镜系统100可操作以确定从被照射的样品114发射的荧光发射中的激发偶极子的位置和取向。

在一些实施例中，荧光显微镜系统100包括光源102，光源102用于发射由第一偏振光学器件129偏振的光束101，第一偏振光学器件129用于将光束101偏振为偏振光103。在一些实施例中，第一偏振光学器件129可以包括波片、偏振器和/或一个或多个液晶以使光束101偏振。在一些实施例中，光源102可以是用于发射激光束的激光器；然而，在其他实施例中，光源102可以是光的其他源，例如发射能够偏振的光束的灯。

在一些实施例中，偏振光103可以由分束器106分离成分离的偏振光103A和103B。在一些实施例中，第一二向色镜(dichroic mirror)134将分离的偏振光103A重定向通过第一物镜透镜108，第一物镜透镜108可以包括第二偏振光学器件130，用于将分离的偏振光103A进一步偏振为分离的偏振光103C，以用于沿第一轴300照射样品114。如所示出的，二向色镜136将分离的偏振光103B重定向通过第二物镜透镜110，第二物镜透镜110可以包括第三偏振光学器件132，用于将分离的偏振光103B进一步偏振为分离的偏振光103D，以沿着相对于第一轴300呈正交关系的第二轴302照射样品114。

当样品114被照射时，样品114基本上沿着与第一轴300正交的平面发射的那些偏振荧光发射105被第一物镜透镜108检测到，而样品114沿着基本上平行于第一轴300的平面发射的那些偏振荧光发射105未被第一物镜透镜108检测到。另外，样品114基本上沿着与第二轴302正交的平面发射的那些偏振荧光发射105被第二物镜透镜110检测到，而样品114沿着基本上平行于第二轴302的平面发射的那些偏振荧光发射105未被第二物镜透镜110检测到。在这种布置中，第一物镜108和第二物镜110之间的正交关系允许荧光显微镜系统100检测激发偶极子而不管其取向轴如何。在其他实施例中，第一物镜108和第二物镜110可以相对于彼此以不平行的角度取向。

在一种布置中，由第一物镜透镜108检测到的偏振荧光发射105可以由第一二向色镜134重定向通过第一镜筒透镜122，以由第一检测器116检测。在进一步的布置中，由第二物镜透镜110检测到的荧光发射105可以由第二二向色镜136重定向通过第二镜筒透镜124，以由第二检测器118检测。

在一些实施例中，第三物镜112可以位于样品114的平面304下方，并且沿着第三轴306取向，第三轴306分别相对于第一轴300和第二轴302形成135度角。第三物镜透镜112用于检测在样品114的平面304下方并以垂直于样品114的平面304的角度发射的荧光发射105。在一些实施例中，由第三物镜112检测到的荧光发射105可以被成像通过第三镜筒透镜126，以由第三检测器120检测。在一些实施例中，第三物镜112可以以分别相对于第一轴300和第二轴302的非平行的角度取向。

在一些实施例中，第一检测器116、第二检测器118和第三检测器120与一个或多个处理器128可操作地通信，一个或多个处理器128利用一个或多个算法来基于分别从第一检测器116、第二检测器118和第三检测器120捕获的荧光发射105的图像计算激发偶极子的位置和三维取向。

在一些实施例中，尽管也考虑了其他类型或种类的物镜透镜，第一物镜透镜108和第二物镜透镜110可以是例如尼康Nikon 0.8NA、Nikon 0.8NA、Nikon 1.1NA、特种光学器件0.71NA透镜。

在一些实施例中，荧光显微镜系统100可以以落射检测操作模式(图2A)或正交检测操作模式(图2B)来操作。在图2A中所示的落射检测操作模式中，例如第一物镜透镜108的单个物镜透镜将偏振光线聚焦在沿轴A的方向上以照射样品114，并且然后同一物镜检测由样品发射的所得荧光发射。在这种检测模式下，第一物镜108检测样品沿垂直于第一物镜108的轴的平面发射的偏振荧光发射。

如图3A和图3B所示，在荧光显微镜系统100的落射检测操作模式下，例如第一物镜108的同一物镜照射样品114，并且然后检测沿着相对于第一物镜108的轴300呈非平行关系的平面304取向的那些发射偶极子的偏振荧光发射。在这种布置中，当第一物镜108照射样品114并检测所得偏振荧光发射时，第二物镜110是未激活的。以交替的方式，一旦第一物镜108完成照射和检测的顺序，第二物镜110然后照射样品114，并且然后检测那些不以与第二物镜110平行的关系取向的激发偶极子的偏振荧光发射。换句话说，第一物镜108检测第二物镜110无法检测到的那些激发偶极子的偏振荧光发射，并且反之亦然。

在图2B所示的正交检测操作模式下，两物镜布置交替地照射并检测沿垂直于各个检测物镜的轴的平面的所得偏振荧光发射。具体地，第一物镜108照射样品114，并且然后第二物镜110检测沿着相对于第二物镜110的轴呈不平行关系的平面取向的那些激发偶极子。以交替的方式，第二物镜110然后照射样品114，并且第一物镜108检测沿着相对于第一物镜108的轴呈不平行关系的平面取向的那些激发偶极子。以这种方式，第一物镜108和第二物镜110能够检测到沿着不直接平行于相应物镜的轴的轴取向的那些激励偶极子，使得第一物镜108和第二物镜110共同地能够检测沿任何特定取向对准的激励偶极子。

如图4A和图B所示，在正交检测操作模式下，荧光显微镜系统100利用以上讨论的两物镜布置来交替照射和检测沿着相对于各个检测物镜的轴呈非平行关系的平面取向的那些激发偶极子的所得荧光发射。参考图4A，在第一操作顺序中，第一物镜108沿第一物镜108的轴300照射样品114，这生成从样品114发射的荧光发射。第二物镜110然后检测来自沿着相对于第二物镜110的轴302呈非平行关系的平面取向的那些激发偶极子的荧光发射。参考图4B，在第二操作顺序中，第二物镜110沿第二物镜110的轴302照射样品114，这生成从样品114发射的荧光发射。第一物镜108然后检测来自沿着相对于第一物镜108的轴300呈非平行关系的平面取向的那些激发偶极子的荧光发射。照射和检测的交替顺序允许荧光显微镜系统100检测由激发偶极子发射的荧光发射，而无论每个相应的激发偶极子的取向如何，因为激发偶极子沿着相对于第一物镜108或第二物镜110呈不平行关系的平面取向。

在一些实施例中，处理器128基于分别由第一物镜108、第二物镜110和第三物镜112检测到的第一荧光发射、第二荧光发射和第三荧光发射的图像为每个激发偶极子生成位置和取向。这样，处理器128生成以至少三维取向结合到一个或多个三维结构的检测到的激发偶极子的取向分布。

另外，可以通过第一偏振光学器件129、第二偏振光学器件130和/或第三偏振光学器件132来任意改变激光束101的偏振状态。对于每个偏振状态，检测器128可以收集第一、第二和/或第三荧光发射105的图像。

在一些实施例中，不需要分束器106，并且第一、第二和第三物镜透镜108、110和112中的每一个可以具有专用光源101，其不必独立于其他两个光源102。

测试

构建了原型显微镜系统，使得可以简化该方法以进行实践。原型显微镜系统包括具有不对称物镜的diSPIM(1.1NA，Nikon；0.71NA，特殊光学器件，对应于图1中所示的第一物镜110和第二物镜108)，不对称物镜配备有偏振光学器件以通过每个物镜产生偏振激发。为了证明该方法，对利用AlexaFluor 488鬼笔环肽(phalloidin)进行免疫染色的肌动蛋白丝进行成像。该标记物与肌动蛋白丝牢固结合，产生取决于结合的丝和偏振激发的相对取向的强偏振荧光。首先通过利用不同取向的108(0°、45°、90°和135°，图5中的示例，左侧)引入的偏振照射激发样品，通过110收集荧光，并且然后通过利用通过110的偏振照射(也是0°、45°、90°和135°的取向，通过108收集荧光)重复此过程，获得八个体积堆叠体。

接下来，运用预测每个体素中的平均取向的算法在处理器上执行重构。该算法使用激发和辐射过程的模型来预测平均偶极子取向与仪器测量的强度之间的关系。为了从所测量的强度中恢复平均偶极子取向，将对象扩展到球谐函数并在角频率空间中求解线性化重构问题。如图5A所示，示例原始数据(固定U2OS细胞中的Alexa Fluor鬼笔环肽标记肌动蛋白)示出与利用不同偏振的照射光(通过0.71NA物镜透镜(第一物镜透镜108)引入)获得的成像体积对应的最大强度投影图像，并通过1.1NA物镜透镜(第二物镜透镜110)收集。在每个图像的插图中都指示了输入照射的取向。该数据加上通过第一物镜透镜108收集的附加的一组4个体积(通过第二物镜透镜110以不同的取向激发，通过第一物镜透镜108收集)形成重构算法的输入数据，图5B示出了重构的结果。根据数据的示例投影示出了每个体素内部的取向(棕色字形)。在一方面，重构允许我们从利用不同取向的照射捕获的多视图荧光图像中得出取向。

从前述内容应当理解的是，尽管已经图示和描述了特定实施例，但是可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对其做出各种修改，这对于本领域技术人员将是显而易见的。这样的改变和修改在所附权利要求书所限定的本发明的范围和教导内。