阅读说明：本技术 一种显微染色鉴别肝肠胞虫的方法及其专用装置 (Method for identifying liver enterocytozoon by microscopic staining and special device thereof ) 是由 乔毅 沈辉 万夕和 蒋葛 王李宝 黎慧 史文军 成婕 孙瑞健 秦亚丽 李浩澜 于 2021-01-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种显微染色鉴别肝肠胞虫的方法及其专用装置,属于肝肠胞虫的检测领域。该方法包括以下步骤：在普通显微镜的镜座上设置激发波长为360-400nm的紫外光源；取待测样品置于载玻片上,取等体积的染色液与待测样品混合均匀,再取等体积的背景降低液混合均匀,盖上盖玻片,染色2-4min,置于改造后的显微镜载物台上,开启紫外光源,在显微镜下观察直径大小为0.75-1.50μm的圆形或椭圆形的亮蓝色物质,即为肝肠胞虫。该方法能够降低检测成本,提高检测效率,且对设备和操作人员的技术依赖性低,能够在养殖现场进行肝肠胞虫的检查,具有快捷、高效、低成本、易操作等优点,有助于对虾养殖过程中肝肠胞虫的防控。(The invention discloses a method for identifying liver enterocytozoon by microscopic staining and a special device thereof, belonging to the field of detection of liver enterocytozoon. The method comprises the following steps: an ultraviolet light source with the excitation wavelength of 360-400nm is arranged on a microscope base of a common microscope; placing a sample to be detected on a glass slide, taking an equal volume of staining solution to be uniformly mixed with the sample to be detected, then taking an equal volume of background reducing solution to be uniformly mixed, covering the glass slide, staining for 2-4min, placing on a modified microscope stage, starting an ultraviolet light source, and observing a circular or elliptical brilliant blue substance with the diameter of 0.75-1.50 mu m under a microscope, namely the liver enterocytozoon. The method can reduce the detection cost, improve the detection efficiency, has low technical dependence on equipment and operators, can be used for detecting the enterocytozoon in the culture site, has the advantages of rapidness, high efficiency, low cost, easy operation and the like, and is beneficial to the prevention and control of the enterocytozoon in the prawn culture process.)

一种显微染色鉴别肝肠胞虫的方法及其专用装置

技术领域

本发明属于肝肠胞虫的检测领域，涉及一种显微染色鉴别肝肠胞虫的方法及其专用装置，尤其涉及一种基于普通显微镜改进的肝肠胞虫的观察方法以及其检查设备在对虾养殖过程中肝肠胞虫感染的现场检查应用。

背景技术

肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，简称EHP)属于微孢子虫科、肠胞虫属，是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫。成熟的孢子呈椭圆形，长度0.75-1.50um，后端有一个空泡，胞内含一个细胞核，5-6个极丝圈，1个与极丝相连的锚盘，和1层电子致密的孢子壁。

虾肝肠胞虫是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫，2009年在泰国生长缓慢的斑节对虾中被首次发现分离，2013年EHP在国内首次发现，据报道，EHP侵染对虾肝胰腺部位，感染了虾肝肠胞虫的对虾一般不像白斑综合征(WSD)等病原造成的急性、大规模死亡现象，而是造成对虾摄食量下降，生长缓慢甚至停滞，导致虾的规格参差不齐。

目前肝肠胞虫的检测虽然以分子手段为主，但是显微镜观察能直观的观察到肝肠胞虫的数量和形态特征，能够更好地判定肝肠胞虫的感染严重程度。已有的肝肠胞虫的荧光显微镜观察技术，主要利用孢子壁的特殊结构与特殊染料结合后在荧光的激发下呈现亮蓝色荧光，从而判定南美白对虾是否感染肝肠胞虫。

但是荧光显微镜的价格昂贵，仪器操作复杂，该检测方法多在实验室进行，无法应用到对虾养殖生产现场。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种显微染色鉴别肝肠胞虫的方法，本发明所要解决的另一技术问题是提供一种显微染色鉴别肝肠胞虫的专用装置，便于在对虾养殖生产现场直接应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种显微染色鉴别肝肠胞虫的方法，包括以下步骤：

1)对普通光学生物显微镜的光源进行改造，以激发波长为360-400nm的紫外光源取代普通光源，实现紫外光源强度能够进行连续调节；

2)用PBS缓冲液溶解Fluorescent Brightener 28至Fluorescent Brightener 28终浓度为1％w/v，然后加入Evan’s Blue染料至Evan’s Blue染料终浓度为0.1％w/v，作为染色液；

3)取待测样品置于载玻片上，取等体积的染色液与待测样品混合均匀，再取等体积的背景降低液混合均匀，盖上盖玻片，染色2-4min，将制作好的载玻片置于改造后的显微镜载物台上，开启紫外光源，在显微镜下观察直径大小为0.75-1.50μm的圆形或椭圆形的亮蓝色物质，即为肝肠胞虫。

进一步的，步骤2)中，PBS缓冲液的pH值为7.2-7.4。

进一步的，步骤3)中，背景降低液为KOH溶液。

进一步的，步骤3)中，KOH溶液的浓度为10％w/v。

进一步的，步骤3)中，待测样品的制备方法为：取虾肝胰腺组织通过组织匀浆后制备而成。

进一步的，步骤3)中，染色3min。

一种显微染色鉴别肝肠胞虫的专用装置，由普通光学显微镜改造而成，普通光学生物显微镜的镜座上开设有放置光源的凹槽，所述光源为激发波长为360-400nm的紫外光源。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

1)本发明通过改进普通显微镜结构，简化染色操作方法，利用改进的普通显微镜对肝肠胞虫进行检查，可根据视野中肝肠胞虫的数量来判定对虾感染肝肠胞虫的严重程度，指导养殖生产，降低经济损失；

2)本发明能够极大的降低检测成本，提高检测效率，其检测质量和精度无影响，且对设备和操作人员的技术依赖性降低，可在对虾养殖生产中进行推广应用，对对虾养殖过程中的肝肠胞虫防控具有重大意义。

附图说明

图1是本申请显微染色鉴别肝肠胞虫的专用装置图；

图2是应用本发明方法检测到的肝肠胞虫的显微镜图；

图3是应用本发明方法检测到的肝肠胞虫的显微镜图；比例尺为5μm；

图4是应用本发明方法检测到的肝肠胞虫的显微镜图；比例尺为5μm。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1

一种显微染色鉴别肝肠胞虫的改进装置，如图1所示，包括目镜1、镜筒2、调焦螺旋3、镜臂4、转换器5、物镜6、载物台7、镜座8、底座9；在镜座8上开设有放置光源的凹槽，光源为激发波长为360-400nm的紫外光源10，其光源强度可进行连续调节。

使用上述改进的显微镜鉴别肝肠胞虫的方法，包括以下步骤：

S1、试剂配制

染色液的配制：取适量的Fluorescent Brightener 28试剂(购自Sigma公司)，用pH为7.2的PBS溶解Fluorescent Brightener 28至Fluorescent Brightener 28终浓度为1％w/v，加入适量Evan’s Blue染料(购自Sigma公司)至Evan’s Blue终浓度为0.1％w/v，配制好的染色液低温避光保存。

背景降低液的配制：取适量KOH配制到终浓度10％w/v，常温保存备用。

S2、样品制备

取南美白对虾肝胰腺组织(0.05-0.2g)于1.5mL EP管中，用一次性研磨棒进行研磨，如果是虾苗可以取多只对虾虾苗的肝胰腺组织匀浆后备用。

S3、样品染色

用微量移液器取5μL制备的样品于载玻片上，取等体积1％的染色液与样品混合均匀，再取5μL 10％的KOH溶液混合，盖上盖玻片，染色3min。

S4、样品观察

将制作好的载玻片置于改进后的显微镜载物台上，开启紫外光源，如图2-4所示，在显微镜下观察直径大小为0.75-1.50μm的圆形或椭圆形的亮蓝色物质，该物质即为肝肠胞虫。

对比例1

除以下技术参数外，其余同实施例1。

显微镜使用Nikon Ni荧光显微镜，改变激发波长，其检测鉴别肝肠胞虫的对比结果如表1。

表1改进的显微镜与Nikon Ni荧光显微镜检测鉴别肝肠胞虫的对比结果

对比例2

南美白对虾常见寄生虫病有固着类纤毛虫病(如钟形虫、聚缩虫、累枝虫，通常寄生在体表，有时与其他原生动物和丝状细菌一起，对宿主造成严重危害)和微孢子虫病(如肝肠胞虫)，使用改进的显微镜进行检测鉴别，具体方法同实施例1。

表2改进的显微镜检测鉴别肝肠胞虫的特异性

改进的显微镜	钟形虫	聚缩虫	累枝虫	肝肠胞虫
					检测结果(有/无)	无	无	无	有
形状大小	无	无	无	直径0.75-1.5μm圆形椭圆形

对比例3

除以下技术参数外，其余同实施例1。

将分离纯化的已知肝肠胞虫浓度为10⁷个/mg组织分别用健康南美白对虾肝胰腺组织稀释成10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷倍的组织匀浆液，然后进行S3样品染色的操作步骤：用微量移液器取5μL制备的样品于载玻片上，取等体积1％的染色液与样品混合均匀，再取5μL 10％的KOH溶液混合，盖上盖玻片，染色3min。观察样品：将制作好的载玻片置于改进后的显微镜载物台上，开启紫外光源，如图2-4所示，在显微镜下观察直径大小为0.75-1.50μm的圆形或椭圆形的亮蓝色物质，该物质即为肝肠胞虫。

结果发现，采用本申请方法检测鉴别肝肠胞虫的灵敏度高(最低检测限可达10³个/mg组织)。

需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。