阅读说明：本技术 一种从迷迭香中提取咖啡酸的方法 (Method for extracting caffeic acid from rosemary ) 是由 罗华 张有发 黄六仔 卢小刚 于 2020-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从迷迭香中提取咖啡酸的方法,该方法包括以下步骤：(1)将迷迭香破碎,用乙醇在80～83℃提取,得提取液,将提取液固液分离,得澄清的提取液；(2)将澄清的提取液浓缩至Brix40～60%,冷却,加入碳源；(3)将以乳酸菌和酵母菌构成的混菌液接种至步骤(2)中,调整pH值,发酵得到液体；(4)将液体加水至Brix11～12%,并将pH值调至4~6,固液分离,得澄清液；(5)将澄清液加入大孔吸附树脂中,洗涤大孔吸附树脂、减压浓缩至Brix30～35%；(6)对浓缩液脱色过滤,再次浓缩,干燥得咖啡酸提取物。该方法有效成分含量高、对环境友好、提取效率高,成本较低、适合工业化生产。(The invention discloses a method for extracting caffeic acid from rosemary, which comprises the following steps: (1) crushing rosemary, extracting with ethanol at 80-83 ℃ to obtain an extracting solution, and carrying out solid-liquid separation on the extracting solution to obtain a clear extracting solution; (2) concentrating the clear extracting solution to Brix 40-60%, cooling, and adding a carbon source; (3) inoculating the mixed bacteria liquid consisting of lactic acid bacteria and saccharomycetes into the step (2), adjusting the pH value, and fermenting to obtain liquid; (4) adding water into the liquid until the Brix 11-12% is reached, adjusting the pH value to 4-6, and carrying out solid-liquid separation to obtain a clarified liquid; (5) adding the clarified liquid into macroporous adsorption resin, washing the macroporous adsorption resin, and concentrating under reduced pressure until Brix 30-35%; (6) decolorizing and filtering the concentrated solution, concentrating again, and drying to obtain caffeic acid extract. The method has high effective component content, environment friendliness, high extraction efficiency, low cost, and suitability for industrial production.)

一种从迷迭香中提取咖啡酸的方法

技术领域

本发明涉及一种从迷迭香中提取咖啡酸的方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

迷迭香系唇形科迷迭香属植物。为常绿灌术，是一种具有丰富使用价值的植物，原产于地中海地区，现在世界各国广泛栽培，在2000多年前一些欧洲国家就将迷迭香用于增强记忆力、治疗语言障碍、调理月经、生发、助消化和保肝。《本草拾遗》中记载迷迭香“辛，温，无毒。主恶气。”目前，我国云南、贵州、广西、海南和新疆等地均有大面积栽种。

对于该植物研究，国外有大量报导和专利，其成分主要为二萜酚类、黄酮类、三萜类和精油等，广泛应用于药品、化妆品和食品等方面。现今迷迭香也广泛用作食品添加剂，其抗菌抗氧化作用能够改善食品品质，延长保鲜时间。近年来，迷迭香的关注度不断上升，关于迷迭香的化学成分和药理作用的报道众多。迷迭香所含成分迷迭香酸是在体内以结合物或甲基化形式被吸收和代谢，被吸收的迷迭香酸大部分被降解成咖啡酸、阿魏酸和桂皮酸的结合物和，或甲基化形式，然后逐渐分泌在尿中。具有抗茵、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗凋亡、清除自由基与免疫抑制等多种药理作用，特别是它对心肌细胞损伤的保护作用，抗神经细胞凋亡，诱导T细胞凋亡，抗癌，及对阿尔茨海默β-淀粉样原纤维有很强的抗淀粉样产生的作用，等等，使之具有非常广阔的应用前景和市场价值。

咖啡酸又名水解咖啡鞣酸、3，4-二羟基肉桂酸、3-(3，4-二羟基苯基)-2- 丙烯酸，为桂皮酸类化合物；为黄色结晶，微溶于冷水，易溶于热水及冷乙醇。普遍存在于当归、川芎等常用植物药中，通常存在于菊科、蔷薇科、无患子科、毛茛科、水龙骨科、芸香科、蓼科、 败酱科、唇形科以及杜仲科植物的花、叶或果实当中。具有抗菌、抗病毒、抗蛇毒、抗腹泻、抗生育及抗肿瘤等多种药理活性，还具有凉血止血功能，常用于治疗高血压、冠心病、心律 失常等疾病。作为羟基肉桂酸的代表化合物，咖啡酸具有很强的抗氧化活性。

目前尚未发现从迷迭香中提取制备咖啡酸的报道。主要通过从富含咖啡酸的植物中提取咖啡酸，而植物中的咖啡酸的含量通常不高，直接从迷迭香中获取咖啡酸更是收获甚少，因此需要寻找新的途径获取咖啡酸。

研究发现迷迭香中含有较多的迷迭香酸和少量的咖啡酸，本发明提出一种咖啡酸的制备方法，将迷迭香酸提取出来后通过发酵转化为咖啡酸，从而大大提高了从迷迭香中获取咖啡酸的产率，并且实现了迷迭香资源的高效利用。

发明内容

本发明目的是提供一种高效、经济的从迷迭香中提取咖啡酸的方法，同时提高提取物中咖啡酸的含量。

一种从迷迭香中提取咖啡酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将迷迭香破碎，用乙醇在80～83℃提取，将提取液固液分离，得澄清的提取液；

S2、将步骤S1所得的澄清的提取液浓缩至Brix40～60%，得浓缩液，加入碳源；

S3、将发酵菌接种至步骤S2的加入碳源的浓缩液中，调pH值至4～6，发酵得到咖啡酸液体；

S4、将步骤S3的咖啡酸液体加水至Brix11～12%，调pH值至4～6，经固液分离，得澄清的上清液；

S5、将步骤S4所得上清液，加入到大孔吸附树脂中，先用水洗涤大孔吸附树脂除去未被吸附的杂质；再用pH4~6的解吸液洗涤大孔吸附树脂，收集洗涤后的解吸液，经减压浓缩至Brix30～35%；

S6、对浓缩液进行脱色过滤，将该滤液再次浓缩，干燥得咖啡酸提取物。

优选地，所述步骤S1中是将迷迭香破碎至直径0.5cm以下。

优选地，所述步骤S1中乙醇浓度为50%～60%。

乙醇浓度为50%～60%，是因为迷迭香咖啡酸在这个浓度溶解性比较合适，也可以避免尽可能少的带入醇溶性的杂质，增加后期处理过程的负担，提高生产效率。

优选地，步骤（1）所述的提取为渗漏提取。

优选地，所述碳源为葡萄糖。

优选地，所述固液分离为过滤或离心。

优选地，所述发酵菌为按照质量百分比计，包括10～90％的乳酸菌， 10～90％的酵母菌。

优选地，所述发酵菌为按照质量百分比计，包括60-80%的乳酸菌， 20～40％的酵母菌。

优选地，所述发酵菌为按照质量百分比计，包括70%的乳酸菌， 30％的酵母菌。

咖啡因是一种黄嘌呤生物碱化合物，通过生物转化制备咖啡因，而乳酸菌和酵母菌是植物类生物发酵最有效的生物菌，乳酸菌和酵母菌都是益生菌类菌种，理论上通过大量乳酸菌发酵，无氧酵解而生成乳酸的发酵过程，乙醇发酵同为生物体内二种主要的发酵形式，能促进发酵顺利进行。再配以少量酵母菌发酵，是在有氧的情况下,把糖分解成二氧化碳和水且酵母菌生长较快，在缺氧的情况下,酵母菌把糖分解成酒精和二氧化碳,从而使发酵过程膨胀，更利于咖啡因的生物转化过程。因此，优选乳酸菌占比更多的比例。

优选地，所述发酵温度为35～37℃下周期为7～10天。

优选地，调pH的溶液为稀盐酸。

优选地，所述大孔吸附树脂为NKA-9大孔树脂、D1O1大孔树脂、D301大孔碱性树脂、D201大孔碱性树脂、001×7Na732。

优选地，所述大孔吸附树脂为中极性大孔吸附树脂。

优选地，所述大孔吸附树脂为NKA-9大孔树脂、D1O1大孔树脂。

更优选地，所述大孔吸附树脂为NKA-9大孔吸附树脂。

NKA-9大孔吸附树脂是以二乙烯苯为骨架结构的吸附剂，连接在主链上的苯环是一个电子分布均匀的平面，对于一些性质相近的分子和多种环状芳香族化含物有很强的吸附能力，且随被吸附分子的亲油性加强而增加。广泛用于银杏黄酮、多酚、咖啡酸等的分离。它近年来在天然产物的分离中,尤其是对水溶性化含物的分离、纯化显示其独特效果。

优选地，所述解吸液为体积百分比浓度为50～60%的乙醇溶液。

优选地，所述脱色过滤用活性炭滤布，所述活性炭滤布目数为325目。

优选地，所述干燥为真空干燥或喷雾干燥，干燥至咖啡酸提取物的水分不超过5%。

目前类似物质的通常采用的是醇提，浓缩后用低温长时间沉淀除去杂质，主要缺陷是温度要求高（4℃以下）、杂质去除不完全，从而导致生成本高，而且有效成分含量低、难于产业化。而采用传统化学合成方法制备咖啡酸，存在反应时间长、纯度不理想、产品中有害物质残留高，造成咖啡酸产品不理想等。本发明是经过60%～65%乙醇提取出迷迭香酸和咖啡酸，浓缩之后，通过发酵将迷迭香酸转化为咖啡酸，从而大大提高了从迷迭香中获取咖啡酸的产率，并且实现了迷迭香资源的高效利用。在树脂柱分离之前，本发明还将所得液体加水至Brix10～12%，并将用酸调pH值至4～6，在此条件下，溶液中杂质在酸性条件下迅速沉淀，不需低温长时间静置，立即分离，极大缩短了生产周期。再上大孔吸附树脂柱分离，产品有效成分高。用325目活性炭滤布对浓缩液进行脱色过滤，可以去除部分有色物质和水不溶性杂质。目前常用的提取方法，提取物中目标产物的含量一般在10～20%，而用本发明的方法，提取物中咖啡酸的含量能达到50～60%。本发明制备出的产品主要用于药品原料。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、本方法中咖啡酸的提取连贯性好，工艺简单，适合工业推广。

2、本发明采用由乳酸菌、酵母菌构成的混菌与迷迭香酸在pH值为4～6，Brix40～60%下进行发酵得到咖啡酸，发酵过程中含有参与酚类化合物代谢的6-P-β葡糖苷酶，Gallate脱羧酶和p-香豆酸羧酶将迷迭香酸转化为咖啡酸，从而实现咖啡酸的含量的提高。

3、本发明采取渗漏法提取咖啡酸，在短时间内使得迷迭香中的有效成分快速充分溶出，反应条件温和，有利于对活性物质的结构保护，而且不会引入新的有机杂质，保证最终产品的安全性，也减少环境污染。

4、本方法工艺合理、有效成分含量高、提取效率高，操作简单，适合工业化生产。

5、本发明所制备的提取物纯度稳定，咖啡酸含量在50～60%之间。

6、本发明的溶剂可以回收再利用，经济环保。

附图说明

图1为实施例1中迷迭香咖啡酸对不同浓度乙醇提取影响条件选择图析；

图2为实施例1中迷迭香咖啡酸对不同比例发酵液影响条件选择图析；

其中将乳酸菌：酵母菌配比为A1:9、B3:7、C5：5、D7：3、E9：1；

图3为实施例2中迷迭香咖啡酸对不同大孔吸附树脂条件选择图析；

其中A: NKA-9大孔树脂、B:D1O1大孔树脂、C: D301大孔碱性树脂、D: D201大孔碱性树脂、E:001×7Na732

图1-图3的纵坐标均为产物中咖啡酸的含量。

图4为实施例3中咖啡酸高效液相色谱检测图。

具体实施方式

以下将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

称取干燥迷迭香碎500g，加乙醇（30%、40%、50%、60%、70%、80%）10L，回流提取2小时，过滤，滤液减压浓缩至Brix40～60%，放置，冷却，放入葡萄糖50g混匀。将70％乳酸菌，30％酵母菌的混菌液5mL加入到浓缩液中，混合均匀，温度控制在37℃，保温培养7天，所得液体加水至Brix10～12%，并将用稀盐酸调pH值调4~6，经离心，得澄清的离心液；将离心清液以通过NKA-9大孔吸附树脂；上柱完毕后，用纯水以洗脱去树脂不吸附的杂质，再用PH4~6的50~60%的乙醇溶液解吸，当流出液为弱酸性时，开始接收液体，上完咖啡酸溶液后再用去离子水冲洗至中性，停止上水及接液，经减压浓缩至Brix30～35%，用325目性活性炭滤布对浓缩液进行脱色过滤，再次浓缩，真空干燥，检测咖啡酸含量。

如图1结果所示，乙醇浓度30%~40%时，咖啡酸的含量为22.1%~42.7%，随着乙醇的比例的增加，咖啡酸含量逐渐增加。在乙醇浓度为60时，咖啡酸的含量为57.1%，达到最高值，而后又随着乙醇浓度的增加而有所下降。

因此，优选乙醇浓度为50%~60%进行提取。

实施例2

称取干燥迷迭香碎500g，加60%~65%乙醇10L，回流提取2小时，过滤，滤液减压浓缩至Brix40～60%，放置，冷却，放入葡萄糖50g混匀。将乳酸菌：酵母菌配比为（A1:9、B3:7、C5：5、D7：3、E9：1）的混菌液5mL加入到浓缩液中，混合均匀，温度控制在37℃，保温培养7天，所得液体加水至Brix10～12%，并将用稀盐酸调pH值调4~6，经离心，得澄清的离心液；将离心清液以通过NKA-9大孔吸附树脂；上柱完毕后，用纯水以洗脱去树脂不吸附的杂质，再用PH4~6的50~60%的乙醇溶液解吸，当流出液为弱酸性时，开始接收液体，上完咖啡酸溶液后再用去离子水冲洗至中性，停止上水及接液，经减压浓缩至Brix30～35%，用325目性活性炭滤布对浓缩液进行脱色过滤，再次浓缩，真空干燥，检测咖啡酸含量。

如图2结果所示，乳酸菌：酵母菌配比为1:9时，咖啡酸的含量仅为14.8%，随着乳酸菌的比例的增加，咖啡酸含量逐渐增加。在乳酸菌：酵母菌配比为7:3时，咖啡酸的含量为57.4%，达到最高值，而后又随着乳酸菌的增加而下降。

因此，优选配比为70％乳酸菌，30％酵母菌的混菌液进行发酵。

实施例2

称取干燥迷迭香碎500g，加60%~65%乙醇10L，回流提取2小时，过滤，滤液减压浓缩至Brix40～60%，放置，冷却，放入葡萄糖50g混匀。将配比为70％乳酸菌，30％酵母菌的混菌液5mL加入到浓缩液中，混合均匀，温度控制在37℃，保温培养7天，所得液体加水至Brix10～12%，并将用稀盐酸调pH值调4~6，经离心，得澄清的离心液；将离心清液以通过大孔吸附树脂（A: NKA-9大孔树脂、B:D1O1大孔树脂、C: D301大孔碱性树脂、D: D201大孔碱性树脂、E:001×7Na732）；上柱完毕后，用纯水以洗脱去树脂不吸附的杂质，再用PH4~6的50~60%的乙醇溶液解吸，当流出液为弱酸性时,开始接收液体，上完咖啡酸溶液后再用去离子水冲洗至中性,停止上水及接液，经减压浓缩至Brix30～35%，用325目性活性炭滤布对浓缩液进行脱色过滤，再次浓缩，真空干燥，检测咖啡酸含量。

如图3所示结果，不同的吸附树脂对总香豆素的含量影响非常明显。吸附用树脂为D1O1，总香豆素含量仅有12.6%。而吸附用树脂为D301和NKA-9，总香豆素含量能达到42.4%和58.4%。

因此，优选中极性NKA-9大孔树脂。

实施例3

称取干燥迷迭香碎10kg，投入200L提取罐中，并加60%~65%乙醇120L，开搅拌；打开夹套蒸汽加热至80～83℃时，打循环2小时然后开始正常渗漉，收集渗漏液至Brix值小于1%，停止收集，过滤，滤液减压浓缩至Brix40～60%，放置，冷却，放入葡萄糖1kg混匀。将配比为70％乳酸菌，30％酵母菌的混菌液10mL加入到浓缩液中，混合均匀，温度控制在37℃，保温培养7天，所得液体加水至Brix10～12%，并将用稀盐酸调pH值调4~6，经离心，得澄清的离心液；将离心清液以25L/h的流速通过25L的NKA-9大孔吸附树脂；上柱完毕后，用150L纯水以50L/h的流速洗脱去树脂不吸附的杂质，再用PH4~6的50~60%的乙醇溶液25L以10L/h的流速解吸，当流出液为弱酸性时,开始接收液体。上完咖啡酸溶液后再用去离子水冲洗至中性,停止上水及接液，经减压浓缩至Brix30～35%，用325目性活性炭滤布对浓缩液进行脱色过滤，将该滤液再次浓缩到固形物含量达50%以上，真空干燥，得干燥块462g，咖啡酸含量为57.3%。咖啡酸的液相色谱数据如图4A所示。

实施例4

称取干燥迷迭香碎300kg，投入5000L提取罐中，并加60%~65%乙醇3000L，开搅拌；打开夹套蒸汽加热至80～83℃时，打循环2小时然后开始正常渗漉，收集渗漏液至Brix值小于1%，停止收集，过滤，滤液减压浓缩至Brix40～60%，放置，冷却，放入葡萄糖30kg混匀。将配比为70％乳酸菌，40％酵母菌的混菌液300mL加入到浓缩液中，混合均匀，温度控制在37℃，保温培养7天，所得液体加水至Brix10～12%，并将用稀盐酸调pH值调4~6，经离心，得澄清的离心液；将离心清液以1000L/h的流速通过1000L的NKA-9大孔吸附树脂；上柱完毕后，用3000L纯水以2000L/h的流速洗脱去树脂不吸附的杂质，再用PH4~6的50~60%的乙醇溶液1500L以500L/h的流速解吸，当流出液为弱酸性时,开始接收液体。上完咖啡酸溶液后再用去离子水冲洗至中性，停止上水及接液，经减压浓缩至Brix30～35%，用325目性活性炭滤布对浓缩液进行脱色过滤，将该滤液再次浓缩到固形物含量达50%以上，真空干燥，得干燥块13.27kg，咖啡酸含量为58.1%。咖啡酸的液相色谱数据如图4B所示。经过放大提取，总香豆素的提取率也是58.1%，与小试水平保持一致，同时色谱图要表示其产品组成和含量高度一致，极大的提高了工业生产中的咖啡酸的含量，工业应用前景优异。

上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。