阅读说明：本技术 一种中性粒细胞的吞噬能力的检测方法 (Method for detecting phagocytic capacity of neutrophil ) 是由 王明义 刘鹏 丛海燕 于 2020-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种中性粒细胞的吞噬能力的检测方法,其解决了现有吞噬检测方法不符合实际,存在吞噬性能检测成本较高,不适合普及,抗生素使用较多导致与实际临床数据结果相比差异比较大,检测数据结果不准确,实验结果不稳定的技术问题。本发明提供一种中性粒细胞的吞噬能力的检测方法,中性粒细胞的吞噬能力为中性粒细胞经第一感染信号刺激后对第二种病原菌的吞噬能力,第一感染信号为被微需氧的细菌感染,第二种病原菌为活的异养兼性厌氧菌,采用细菌涂布接种培养,计数菌落数目,可广泛应用于医学检测技术领域。(The invention discloses a method for detecting phagocytosis capability of neutrophils, which solves the technical problems that the existing phagocytosis detection method is not practical, the phagocytosis performance detection cost is high, the existing phagocytosis detection method is not suitable for popularization, the difference of the actual clinical data result is large due to more antibiotics, the detection data result is inaccurate, and the experimental result is unstable. The invention provides a method for detecting phagocytic capacity of neutrophils, which is characterized in that the phagocytic capacity of the neutrophils is the phagocytic capacity of the neutrophils on second pathogenic bacteria after the neutrophils are stimulated by a first infection signal, the first infection signal is infected by microaerophilic bacteria, the second pathogenic bacteria are live heterotrophic facultative anaerobes, bacterial coating inoculation culture is adopted, the number of colonies is counted, and the method can be widely applied to the technical field of medical detection.)

一种中性粒细胞的吞噬能力的检测方法

技术领域

本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种中性粒细胞的吞噬能力的检测方法。

背景技术

在人体中，血液循环中约70％的白细胞为中性粒细胞，正常人骨髓每天可生成大量、新鲜、成熟的中性粒细胞，胞内含有许多中性的颗粒，身为先天免疫系统的“先行者”，中性粒细胞在机体抵御病原微生物的入侵中起着重要作用。中性粒细胞“身兼”有趋化、吞噬、杀菌等多种功能，在机体被病原体感染后，多种趋化因子作用于中性粒细胞，滚动、粘附并越过内皮屏障，顺着趋化剂的梯度逐渐向感染部位迁移，进入感染灶，通过其一系列的杀菌功能杀伤致病体以维持机体健康，例如通过“呼吸爆发”、脱颗粒、NETs等途径对病原体进行诱杀，因此其免疫调节作用十分重要。其中吞噬作用是中性粒细胞发挥免疫功能的重要功能之一，中性粒细胞通过吞噬细菌及异物并触发呼吸爆发或氧爆发，产生活性氧簇和多种溶酶体酶有效杀伤吞噬的微生物。

中性粒细胞的主要功能就是吞噬进入人体的异物，在一定条件下，把中性粒细胞和细菌放在一起，中性粒细胞会吞噬细菌，可以反映中性粒细胞的功能是否正常。中性粒细胞的吞噬率、吞噬指数是目前常用的评价中性粒细胞吞噬功能的两个指标。常用方法为Wirhgt-Gemsa复合染色法染色，先低倍镜观察血涂片，再与油镜下观察100个中性粒细胞吞噬病原菌的情况。根据公式计算吞噬率、吞噬指数。吞噬率＝100个中性粒细胞中吞噬细菌的细胞数/100*100％。吞噬指数＝100个中性粒细胞中吞噬细菌的总数/100。但此方法需要染色，还需在显微镜下辨认细胞结构、吞噬细菌与否、计数细胞与细菌，实验结果的准确性与操作人员的辨识水平相关性较大，实验结果不稳定。现有技术中，吞噬实验一般是应用单一的常见条件致病病原菌(比如大肠埃希菌)或荧光微球(颗粒)作为被吞噬物。但是，临床常见多种菌(二种、三种)并发感染情况，所以现有的吞噬实验检测数据结果与实际临床数据结果相比差异比较大，且并发感染时检测吞噬能力，需要针对多种菌使用多种抗生素，造成检测的中性粒细胞的吞噬能力不准确。而后出现的荧光显微镜下观察中性粒细胞吞噬法和流式细胞仪检测中性粒细胞吞噬功能法，需要荧光染料和特殊仪器，成本较高，不适合普及。中性粒细胞的吞噬率、吞噬指数是目前常用的评价中性粒细胞吞噬功能的两个指标。但此方法需要特殊染色，还需在显微镜下辨认细胞结构、吞噬细菌与否、计数细胞与细菌，实验结果的准确性与操作人员的辨识水平相关性较大，实验结果不稳定。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的缺点和不足，提供了一种可以准确评价中性粒细胞在吞噬能力，检测成本低，操作简便、简单易行，实验结果更接近临床数据、且重复性好，为吞噬实验提供新的实验方法与思路的中性粒细胞的吞噬能力的检测方法。

为此，本发明提供一种中性粒细胞的吞噬能力的检测方法，中性粒细胞的吞噬能力为中性粒细胞经第一感染信号刺激后对第二种病原菌的吞噬能力，第一感染信号为被微需氧的细菌感染，第二种病原菌为活的异养需氧菌。

优选的，第一感染信号为被幽门螺杆菌感染，第二种病原菌为活的大肠埃希菌、或葡萄球菌、或链球菌。

优选的，具体步骤包括：

步骤(1)采用体外共培养方法，将中性粒细胞经第一感染信号刺激：在微需氧条件下，采用体外共培养技术将幽门螺杆菌和中性粒细胞进行共培养，中性粒细胞和幽门螺杆菌共同培养相互发生作用后，中性粒细胞经第一感染信号刺激，即得到中性粒细胞被第一感染信号幽门螺杆菌感染刺激后的体外共培养体系；

步骤(2)二次加菌体外共培养，中性粒细胞经步骤(1)中的被第一感染信号刺激后对第二种病原菌的吞噬作用：在正常有氧条件培养，将第二种病原菌活菌和步骤(1)的体外共培养体系，进行共培养1h后，步骤(1)体外共培养体系中的幽门螺杆菌暴露在此有氧条件下1h便会失去活性，因此继续在有氧条件培养1h，不会干扰被幽门螺杆菌感染刺激后的中性粒细胞对第二种病原菌的吞噬及培养分析；

步骤(3)评价中性粒细胞经第一感染信号刺激后对第二种病原菌的吞噬能力方法，即检测被第一感染信号幽门螺杆菌感染后的中性粒细胞吞噬第二种病原菌的能力的方法：采用细菌涂布接种培养方法计数两组中性粒细胞接种平板后的菌落数目。

优选的，在步骤(1)中，采用体外共培养方法具体步骤为：将幽门螺杆菌接种于有活的中性粒细胞的孔板内；幽门螺杆菌浓度为1.0×10E6—2.0×10E7CFU/mL，中性粒细胞浓度为1.0×10E5—2.0×10E6个/mL。

优选的，第二种病原菌为大肠埃希菌；中性粒细胞和幽门螺杆菌的浓度以1：10、中性粒细胞和大肠埃希菌的浓度以1:10共培养组。

优选的，在步骤(2)中，二次加菌体外共培养具体步骤为：将第二种病原菌大肠埃希菌活菌接种于步骤(1)中有幽门螺杆菌的孔板内，大肠埃希菌浓度均为：1.0×10E6—2.0×10E7CFU/mL。

优选的，在步骤(3)中，采用细菌涂布接种培养方法计数两组中性粒细胞接种平板后的菌落数目，具体步骤为：

在步骤(2)二次加菌体外共培养的已加入第二种病原菌大肠埃希菌的共培养组细胞中，加入一定浓度的抗生素作用，杀灭培养基中的细胞外细菌后，收集细胞用无菌PBS洗涤一次，再加入无菌水，震荡混匀裂解中性粒细胞，取裂解液涂布接种血平板，培养过夜、计数菌落数。

优选的，抗生素为抗生素青链双抗(青霉素链霉素)。

优选的，在步骤(3)中，计数菌落数方法为：釆用Microsoft Excel、GraphPadPrism 5.0软件进行统计学分析，吞噬系数＝菌落数目x 5÷细胞计数，组间两两比较符合正态分布，釆用LSD-t检验。

本发明的有益效果是：

(1)本发明的中性粒细胞的吞噬能力的检测方法，采用人外周血中性粒细胞与第一感染信号(幽门螺杆菌)体外建立共培养模式，在孵育体系内加入第二种病原菌(大肠埃希菌活菌)，幽门螺杆菌为微需氧菌，暴露在空气中1h左右失去活性，因此有氧条件下不会干扰细胞对第二种病原菌的吞噬及培养分析，不需要额外添加抗生素杀灭幽门螺杆菌，避免了此时添加的抗生素对第二种病原菌大肠埃希菌存活的影响，可以准确评价中性粒细胞在第一感染信号(幽门螺杆菌感染)刺激后对第二种病原菌(活的大肠埃希菌)的吞噬能力，可以准确评价中性粒细胞在吞噬能力，具有检测成本低，操作简便、简单易行，实验结果更接近临床数据、且重复性好，为吞噬实验提供新的实验方法与思路，具有显著的进步。

(2)现有吞噬实验一般是应用单一的常见条件致病病原菌(比如大肠埃希菌)或荧光微球(颗粒)作为被吞噬物；但是临床常见多种菌(二种、三种)并发感染情况，本发明的中性粒细胞的吞噬能力的检测方法，采用两种病原物，意在模拟多种菌感染情况，且无需用抗生素对第一感染信号菌体进行杀灭，因此，本发明的检测方法检测出来的中性粒细胞的吞噬性能，更接近实际临床情况，检测数据结果更准确，且重复性好。

(3)本发明的检测方法中，利用微需氧的细菌幽门螺杆菌的微需氧生存特性，仅需微需氧条件及有氧条件的转变，不添加对第一感染信号菌体进行杀灭的抗生素，就能评价出中性粒细胞对第二种菌的吞噬情况，具有检测成本低，操作简便、简单易行，且实验结果更接近临床数据。

附图说明

图1是本发明实施例提供的其中一组实验组中大肠埃希菌菌落生长情况图；

图2是本发明实施例中的数据结果统计表(多组平行实验组试验数据统计平均值)。

具体实施方式

下面具体实施例对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。本发明中所使用的方法如无特殊规定，均为常规的方法；所使用的原料和装置，如无特殊规定，均为常规的市售产品。

本发明提供的中性粒细胞的吞噬能力的检测方法，中性粒细胞的吞噬能力为中性粒细胞经第一感染信号刺激后对第二种病原菌的吞噬能力，第一感染信号为被微需氧的细菌感染，第二种病原菌为活的异养兼性厌氧菌。第一感染信号为被幽门螺杆菌感染，第二种病原菌为活的大肠埃希菌。

具体步骤包括：

步骤(1)、取人体外周血，采用密度梯度离心法分别分离出其中的中性粒细胞；

步骤(2)、将步骤(1)中分离出来的中性粒细胞按4.0×10E5个/孔的密度接种于24孔板，在孵箱(37℃，5％CO₂)中培养2h；

步骤(3)、采用体外共培养方法，将中性粒细胞经第一感染信号刺激：在微需氧条件(5％O₂、10％CO₂和85％N₂)下，向步骤(2)接种中性粒细胞的24孔板中加入幽门螺杆菌(H.pylori)与血清共孵育30min，采用体外共培养技术将幽门螺杆菌和中性粒细胞进行共培养，继续培养1h；中性粒细胞和幽门螺杆菌共同培养相互发生作用后，中性粒细胞经第一感染信号刺激，即得到中性粒细胞被第一感染信号幽门螺杆菌感染刺激后的体外共培养体系；

实验组为：将幽门螺杆菌接种于有中性粒细胞的24孔板内后，微需氧条件培养1h；幽门螺杆菌为4.0×10E6CFU/mL，中性粒细胞为4.0×10E5个/mL，500μL/孔；

设置对照组为：中性粒细胞的24孔板中不接种幽门螺杆菌，即仅接种中性粒细胞，中性粒细胞为4.0×10E5个/mL，500μL/孔。

步骤(4)、二次加菌体外共培养，中性粒细胞经步骤(3)中的被第一感染信号刺激后对第二种病原菌的吞噬作用：

取新培养的质控菌株大肠埃希菌(E.coli)(ATCC 25922)，制成悬液，测定OD600值并计算大肠埃希菌的菌体浓度，按中性粒细胞:大肠埃希菌比值1:10接种菌体于细胞的培养体系中，具体接种步骤为；

在正常有氧条件培养孵箱(37℃，5％CO₂)，将第二种病原菌大肠埃希菌活菌和步骤(3)的体外共培养体系，进行共培养1h后，步骤(3)体外共培养体系中的幽门螺杆菌暴露在此有氧条件下1h便会失去活性，因此继续在有氧条件培养1h，不会干扰被幽门螺杆菌感染刺激后的中性粒细胞对第二种病原菌大肠埃希菌的吞噬及培养分析；

实验组为：将第二种病原菌大肠埃希菌活菌接种于步骤(3)中有幽门螺杆菌的24孔板内，大肠埃希菌均为4.0×10E6CFU/mL；

对照组为：将第二种病原菌大肠埃希菌活菌接种于步骤(3)中无幽门螺杆菌的24孔板内，大肠埃希菌均为4.0×10E6CFU/mL。

步骤(5)、评价中性粒细胞经第一感染信号刺激后对第二种病原菌的吞噬能力方法，即检测被第一感染信号幽门螺杆菌感染后的中性粒细胞吞噬第二种病原菌大肠埃希菌的能力的方法：采用细菌涂布接种培养方法计数两组中性粒细胞接种平板后的菌落数目。

在步骤(5)中，在实验组中性粒细胞与幽门螺杆菌、大肠埃希菌共培养组细胞和对照组中性粒细胞与大肠埃希菌培养组细胞中，分别加入一定浓度的抗生素青链双抗(青霉素链霉素)作用30min，杀灭培养基中的细胞外细菌(大肠埃希菌)，收集细胞用1ml无菌PBS洗涤一次，再加入无菌水0.5mL，震荡混匀裂解中性粒细胞10min，取0.1mL裂解液涂布接种血平板，培养过夜、计数菌落数。

计数菌落数方法为：釆用Microsoft Excel、GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析，吞噬系数＝菌落数目x 5÷细胞计数，组间两两比较符合正态分布，釆用LSD-t检验。

用无菌水裂解细胞涂布接种、计数细菌菌落数，误差小，可以准确评价中性粒细胞在第一感染信号(幽门螺杆菌感染)刺激后对第二种病原菌(活的大肠埃希菌)的吞噬能力，可以为吞噬实验提供新的实验方法与思路。

以上仅是本发明的实施例而已，例如，第二种病原菌为活的异养需氧菌，例如活的大肠埃希菌、或葡萄球菌、或链球菌；在步骤(1)中，采用体外共培养方法具体步骤为：将幽门螺杆菌接种于有活的中性粒细胞的孔板内；幽门螺杆菌浓度为1.0×10E6—2.0×10E7CFU/mL，中性粒细胞浓度为1.0×10E5—2.0×10E6个/mL；在步骤(2)中，二次加菌体外共培养具体步骤为：将第二种病原菌大肠埃希菌活菌接种于步骤(1)中有幽门螺杆菌的孔板内，大肠埃希菌浓度均为：1.0×10E6—2.0×10E7CFU/mL，实验组为：中性粒细胞和幽门螺杆菌的浓度以1：10、中性粒细胞和大肠埃希菌的浓度以1：10共培养组；对照组为：中性粒细胞与大肠埃希菌以1：10共培养组；均可以实现本发明的中性粒细胞的吞噬能力的检测方法。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作详细描述。

1材料与方法

1.1RPMI 1640培养基为HyClone公司产品；胎牛血清为浙江天杭生物科技股份有限公司产品；PBS粉末购于无锡傲锐东源生物科技有限公司；抗生素购自索莱宝公司；血平板购自郑州安图生物工程股份有限公司；

1.2人外周血中性粒细胞采集自健康志愿者，细胞培养均釆用含10％胎牛血清的RPMI 1640,在37°培养箱中培养；细胞取生长良好，细胞存活率(台盼蓝拒染法)＞95％的细胞进行实验。

1.3方法

实验设2组：

实验组：中性粒细胞和幽门螺杆菌以1：10、中性粒细胞和大肠埃希菌以1：10浓度共培养组。

对照组：中性粒细胞与大肠埃希菌以1：10共培养组；

1.3.1将中性粒细胞按4.0×10E5个/mL接种于6孔板内，500μL/孔，设定3个复孔，对照组仅接种中性粒细胞，实验组接种中性粒细胞和幽门螺杆菌，微需氧条件培养1h；幽门螺杆菌为4.0×10E6CFU/mL，中性粒细胞为4.0×10E5个/mL，500μL/孔；

1.3.2将上述共培养体系与大肠埃希菌行体外共培养是在有或无幽门螺杆菌的24孔板中接种大肠埃希菌。

1.3.3细菌涂布接种培养方法

在中性粒细胞与大肠埃希菌培养组细胞；中性粒细胞与幽门螺杆菌、大肠埃希菌共培养组细胞中，

分别加入一定浓度的抗生素作用30min，杀灭培养基中的中性粒细胞外细菌，收集中性粒细胞用无菌PBS洗涤一次，再加入无菌水0.5mL，震荡混匀裂解中性粒细胞10min，取0.1mL裂解液涂布接种血平板，培养过夜、计数菌落数；

1.3.4釆用Microsoft Excel、GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析，吞噬系数＝菌落数目x 5÷细胞计数，组间两两比较，若符合正态分布，釆用LSD-t检验:以p<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组中大肠埃希菌菌落生长情况，结果显示(如图1所示)：

在中性粒细胞、幽门螺杆菌、大肠埃希菌共培养体系的实验组的中性粒细胞吞噬大肠埃希菌的数目为12个，对照组中无幽门螺杆菌存在的体系中的中性粒细胞吞噬大肠埃希菌的数目为10个，在实验组与对照组中，中性粒细胞吞噬大肠埃希菌的数量差异无统计学意义。与现有技术中的评价中性粒细胞的吞噬能力的常用指标为吞噬率和吞噬指数，其常用检测方法为Wirhgt-Gemsa复合染色法染色，需要操作人员的辨识水平常导致实验结果不稳定相比，本发明的方法的实验结果的准确性显著提高，而且本发明中的检测方法不需要特殊染色，不添加对第一感染信号菌体进行杀灭的抗生素，不需要显微镜下辨认细胞与细菌，只需裂解细胞涂布接种、计数细菌菌落数，省时省力，误差小，准确性高，对于医学检测技术领域具有巨大影响。

3.讨论

中性粒细胞在机体抵御病原微生物的入侵中起着重要作用，当病原体入侵人体后，中性粒细胞在多种因子的作用下被激活，滚动、粘附并越过内皮屏障，向感染部位迁移，进入感染灶，通过其一系列的杀菌功能杀伤致病体以维持机体健康。其中吞噬作用是中性粒细胞发挥免疫功能的重要功能之一，中性粒细胞通过吞噬细菌及异物并触发呼吸爆发或氧爆发，产生活性氧簇和多种溶酶体酶有效杀伤吞噬的微生物。

中性粒细胞的吞噬能力变现为中性粒细胞经第一感染信号刺激后对第二种病原菌的吞噬能力，第一感染信号为被微需氧的细菌感染，第二种病原菌为活的异养兼性厌氧菌。第一感染信号为被幽门螺杆菌感染，第二种病原菌为活的大肠埃希菌。

在本发明的检测方法中，被微需氧的细菌幽门螺杆菌感染作为第一感染信号，其生长条件为微需氧；异养兼性厌氧菌大肠埃希菌作为感染病原菌，是异养兼性厌氧菌，在有氧或缺氧的情况下，都可以进行相应的生活活动；幽门螺杆菌为微需氧菌，暴露在空气中1小时便会失去活性，因此二次加菌培养时，在有氧条件下不会干扰中性粒细胞对第二种病原菌(大肠埃希菌)的吞噬及培养分析，因此使用幽门螺杆菌模拟第一感染信号相比于其他致病菌，不需要添加对第一感染信号菌体进行杀灭的抗生素，不会影响第二种病原菌(活的大肠埃希菌)的存活，可以准确评价中性粒细胞在第一感染信号(幽门螺杆菌感染)刺激后对第二种病原菌(活的大肠埃希菌)的吞噬能力。现有技术中评价中性粒细胞的吞噬能力的常用指标为吞噬率和吞噬指数，其常用检测方法为Wirhgt-Gemsa复合染色法染色，先低倍镜观察血涂片，再与油镜下观察100个中性粒细胞吞噬病原菌的情况，再根据公式计算吞噬率、吞噬指数(吞噬率＝100个中性粒细胞中吞噬细菌的细胞数/100*100％。吞噬指数＝100个中性粒细胞中吞噬细菌的总数/100)。但此方法需要染色，染色质量的高低与操作人员的专业技术水平相关性大，还需在显微镜下辨认细胞结构、吞噬细菌与否、计数细胞与细菌，因此实验结果的准确性与操作人员的辨识水平相关性较大，常导致实验结果不稳定。但本发明中的检测方法不需要特殊染色，不需要显微镜下辨认细胞与细菌，只需裂解细胞涂布接种、计数细菌菌落数，误差小，准确性高。

另外，现有技术中，吞噬实验一般是应用单一的常见条件致病病原菌(比如大肠埃希菌)或荧光微球(颗粒)作为被吞噬物。但是，临床常见多种菌(二种、三种)并发感染情况，本发明的检测方法中采用两种病原物，意在模拟多种菌感染情况。因此，与现有技术中的吞噬实验结果相比，本发明的检测方案更接近实际临床情况，检测中性粒细胞的吞噬结果更接近与实际临床情况，检测数据结果更准确、误差小。

此外，本发明的检测方法中利用微需氧的细菌幽门螺杆菌微需氧生存特性，仅需微需氧条件及有氧条件的转变，无需添加杀灭第一种感染信号的抗生素，就能评价中性粒细胞对第二种菌的吞噬情况，整体操作简便、省时省力，结果统计更直观，通用性强。

综上，本发明的中性粒细胞的吞噬能力的检测方法，检测成本低，条件温和，操作简便，省时省力，检测中性粒细胞的吞噬结果更接近与实际临床情况、且重复性好，检测数据结果更准确、误差小，可普及型强，为吞噬实验提供新的实验方法与思路。

以上仅是本发明的实施例而已，不能以此限制本发明的保护范围，例如，第二种病原菌为活的异养需氧菌，例如活的大肠埃希菌、或葡萄球菌、或链球菌；在步骤(1)中，采用体外共培养方法具体步骤为：将幽门螺杆菌接种于有活的中性粒细胞的孔板内；幽门螺杆菌浓度为1.0×10E6—2.0×10E7CFU/mL，中性粒细胞浓度为1.0×10E5—2.0×10E6个/mL；在步骤(2)中，二次加菌体外共培养具体步骤为：将第二种病原菌大肠埃希菌活菌接种于步骤(1)中有幽门螺杆菌的孔板内，大肠埃希菌浓度均为：1.0×10E6—2.0×10E7CFU/mL，实验组为：中性粒细胞和幽门螺杆菌的浓度以1：10、中性粒细胞和大肠埃希菌的浓度以1：10共培养组；对照组为：中性粒细胞与大肠埃希菌以1：10共培养组；均可以实现本发明的中性粒细胞的吞噬能力的检测方法。

惟以上所述者，仅为本发明的具体实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围，故其等同组件的置换，或依本发明专利保护范围所作的等同变化与修改，皆应仍属本发明权利要求书涵盖之范畴。