阅读说明：本技术 一种夏枯草黄酮的新应用 (New application of selfheal flavone ) 是由 郑俊霞 谢俊涛 黄智霖 陈鸿庚 黄家晋 王立抗 杨超 田文月 黄华容 张蓝月 苏 于 2020-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药技术领域,尤其涉及一种夏枯草黄酮的新应用。本发明公开了夏枯草黄酮的新应用,特别是在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用、在制备抑制细菌绿脓素药物中的应用、在制备抑制细菌弹性蛋白酶分泌药物中的应用和在制备抑制细菌生物膜形成药物中的应用。本发明夏枯草可以通过抑制群体感应系统达到细菌毒力因子的同时不抑制菌株生长,不易产生细菌耐药性的效果,发挥抑制铜绿假单胞菌的作用。另外,夏枯草黄酮是天然物质,其毒性和副作用很低,夏枯草黄酮可以单独使用,也可以作为抗生素的辅助治疗剂达到防治细菌感染的目的。(The invention relates to the technical field of medicines, in particular to a new application of selfheal flavone. The invention discloses a new application of selfheal flavone, in particular to an application in preparing a medicament for inhibiting a bacterial quorum sensing system, an application in preparing a medicament for inhibiting bacterial pyocyanin, an application in preparing a medicament for inhibiting bacterial elastase secretion and an application in preparing a medicament for inhibiting bacterial biofilm formation. The selfheal can achieve the effect of inhibiting bacterial virulence factors and bacterial strain growth simultaneously by inhibiting a quorum sensing system, is not easy to generate bacterial drug resistance, and plays a role in inhibiting pseudomonas aeruginosa. In addition, the prunella vulgaris flavone is a natural substance, has low toxicity and side effects, can be used independently, and can also be used as an auxiliary therapeutic agent of antibiotics to achieve the purpose of preventing and treating bacterial infection.)

一种夏枯草黄酮的新应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种夏枯草黄酮的新应用。

背景技术

由于抗生素具有较多优势,其在临床中得到了广泛应用,且临床疗效较为显著。但是随着抗生素的滥用,细菌耐药性问题也不断凸显，如能生成酶对抗生素的修饰或破坏、改变膜通透性、改变或产生新的靶位、主动外排抗生素等，因此寻找能代替抗生素的药物就显得尤为重要。

近年来，细菌群体感应(Quorum sensing，QS)系统已成为研究新型抗耐药菌药物的重要靶标。而群体感应系统是细菌克服宿主感染防御机制系统，其通过监控某些信号分子(又称自体诱导分子)的浓度来控制并协调整个细菌群体行为，共同对周围环境刺激做出反应，极大增强了整个细菌群体的生存能力。细胞间信号传递使得细菌能够克服宿主的防御机制。少量细菌产生的细胞外毒力因子可能引起宿主产生有效中和这些复合物的应答反应，然而达到某一密度的菌群毒力基因的共同表达，可能会使细菌分泌高水平的细胞外毒力因子，从而能够克服宿主防御机制。

因而，寻找能抑制细胞间信号传递的信号通路抑制剂，是解决细菌对抗生素耐药性的重要途径之一。常用的信号通路抑制剂有包括呋喃酮类化合物、吡咯酮类化合物、二酮呱嗪类化合物、取代的酰基高丝氨酸内酯类化合物、寡肽类化合物和激素类化合物，然而这些物质的抑制效果并不佳，甚至有协会对人体产生毒性及副作用。

我国药用植物近万种，有着非常丰富的中药和天然药物资源，为新药研发提供了基础，由此不少研究者把目光投向传统中药资源。而且，使用中药或天然药物进行抗菌、消炎，可以减少使用抗生素时造成的不良反应及副作用，也不易产生耐药性。寻找一种有抗菌消炎疗效的传统中药作为抗生素的替代性产品或辅助产品，将能很好地解决抗生素耐药性这一世界难题。

夏枯草(Prunella vulgaris L.)为唇形科植物，其药用部位为干燥果穗。主产于江苏、河南、湖北、湖南等地，具有清热泻火、散结、清肝、明目、止痛、消肿功效。现代临床多用于治疗甲状腺肿大、***核、乳腺增生、高血压、肺结核、急性黄疸型传染性肝炎等疾病。黄酮类化合物是夏枯草主要活性成分之一，虽已广泛应用于食品、医药等行业，但其研究主要集中在具有抗氧化、抗清除自由基、降压,以及消炎等方面，目前尚未发现其有抑制细菌群体感应系统的作用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了夏枯草黄酮的新应用，夏枯草黄酮可以通过抑制细菌群体感应系统达到抑制细菌绿脓素和抑制细菌弹性蛋白酶分泌以及细菌生物膜的形成，但不影响细菌的生长，不易产生细菌耐药性的效果。

其具体技术方案如下：

本发明提供了夏枯草黄酮在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用。

优选地，所述细菌包括铜绿假单胞菌。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述药物的剂型为口服制剂，优选为颗粒剂、胶囊剂、片剂或滴丸。

优选地，所述药物中夏枯草酮的有效剂量为10～90wt％，更优选为10～30wt％，辅料优选为10～90wt％，更优选为70～90wt％。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)会引起各种急性和慢性感染甚至导致宿主的死亡，是医院获得性感染的三大致病菌之一，目前，研究的较为清楚的铜绿假单胞菌的群体感应调控系统主要有三个：包括las,rhl及pqs系统，其中las及rhl系统是以高丝氨酸内酯(3-oxo-C12-HSL、C4-HSL)为信号分子的系统，pqs系统是以喹诺酮(PQS)为信号分子的系统。在调控网络中pqs系统起到las系统和rhl系统的关键纽带作用，一方面las和rhl控制着pqs的生成，另一方面pqs又影响着las和rhl的基因表达，两者之间存在微妙的平衡，从而调节一系列的毒力因子相关基因的表达。lasB是las系统的调控基因，其与毒力因子弹性蛋白酶的分泌有关，信号分子PQS的合成，需要由pqsA，pqsB、pqsC、pqsD、pqsE、phnAB以及pqsH等操纵子编码的酶参与。

本发明采用PAO1-lasB-gfp、PAO1-pqsA-gfp绿色荧光蛋白报告菌株来研究夏枯草黄酮对铜绿假单胞菌群体感应系统las和pqs通路的影响。实验结果表明夏枯草黄酮对lasB-gfp和pqsA-gfp的表达具有抑制作用，但不抑制铜绿假单胞菌的生长，使得铜绿假单胞菌不易产生耐药性。因此，本发明夏枯草黄酮在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用中，夏枯草黄酮用于抑制括lasB信号通路和pqsA信号通路。

本发明还提供了夏枯草黄酮在制备抑制细菌绿脓素药物中的应用。

优选地，所述细菌包括铜绿假单胞菌。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述药物的剂型为口服制剂，优选为颗粒剂、胶囊剂、片剂或滴丸。

优选地，所述药物中夏枯草酮的有效剂量为10～90wt％，更优选为10～30wt％，辅料优选为10～90wt％，更优选为70～90wt％。

铜绿假单胞菌pqsA可调控绿脓菌素的表达，因此，本发明还研究了夏枯草黄酮对铜绿假单胞菌的绿脓菌素分泌的影响。实验结果表明夏枯草黄酮通过抑制pqsA的表达，从而抑制绿脓菌素的分泌，降低铜绿假单胞菌的毒力和致病力。

本发明还提供了夏枯草黄酮在制备抑制细菌弹性蛋白酶分泌药物中的应用。

优选地，所述细菌包括铜绿假单胞菌，更优选为铜绿假单胞菌PAO1。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述药物的剂型为口服制剂，优选为颗粒剂、胶囊剂、片剂或滴丸。

优选地，所述药物中夏枯草酮的有效剂量为10～90wt％，更优选为10～30wt％，辅料优选为10～90wt％，更优选为70～90wt％。

铜绿假单胞菌LasB可调控弹性蛋白酶的表达，因此，本发明还研究了夏枯草黄酮对铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶分泌的影响。实验结果表明夏枯草黄酮通过抑制LasB的表达，从而抑制弹性蛋白酶的分泌，降低铜绿假单胞菌的毒力和致病力。

本发明还提供了夏枯草黄酮在制备抑制细菌生物膜形成药物中的应用。

优选地，所述细菌包括铜绿假单胞菌，更优选为铜绿假单胞菌PAO1。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述药物的剂型为口服制剂，优选为颗粒剂、胶囊剂、片剂或滴丸。

优选地，所述药物中夏枯草酮的有效剂量为10～90wt％，更优选为10～30wt％，辅料优选为10～90wt％，更优选为70～90wt％。

本发明还研究了夏枯草对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响。实验结果表明夏枯草黄酮对铜绿假单胞菌生物膜形成具有良好的抑制效果。

本发明上述技术方案中，夏枯草黄酮由夏枯草依次通过乙醇提取、大孔树脂层析纯化得到，具体制备步骤如下：

步骤1：将夏枯草粉碎，得到粉碎后的夏枯草；

步骤2：将粉碎后的夏枯草采用溶剂进行回流提取，除去不溶物，得到第一提取物；

步骤3：第一提取物采用大孔树脂柱层析法进行分离，得到从纯化后的夏枯草黄酮。

本发明步骤1中，所述夏枯草优选采用万能粉碎机进行粉碎。

本发明步骤2中，夏枯草与溶剂的质量比为1：10，溶剂选60％乙醇，采用过滤或离心除去不溶物，回流提取的温度为85℃，回流提取的时间为1.5h，回流提取2次；

所述除去不溶物之后，得到所述第一提取物之前，还包括：减压干燥。

本发明步骤3中，大孔树脂选用D101型号，大孔树脂先用无水乙醇浸泡24h活化，装柱后用纯化水洗至无醇味。上样，用2BV纯化水冲洗，4BV 80％乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液，最后减压干燥得到夏枯草黄酮。

从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

本发明提供了夏枯草黄酮的新应用，特别是在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用、在制备抑制细菌绿脓素药物中的应用、在制备抑制细菌弹性蛋白酶分泌药物中的应用和在制备抑制细菌生物膜形成药物中的应用。由实验结果可知，夏枯草黄酮可以有效抑制铜绿假单胞菌中lasB信号通路和pqsA信号通路，夏枯草黄酮还可以抑制铜绿假单胞菌绿脓素和弹性蛋白酶的分泌以及铜绿假单胞菌生物膜的形成，同时不抑制菌株生长。本发明夏枯草可以通过抑制群体感应系统达到细菌毒力因子的同时不抑制菌株生长，不易产生细菌耐药性的效果，发挥抑制铜绿假单胞菌的作用。另外，夏枯草黄酮是天然物质，其毒性和副作用很低，夏枯草黄酮可以单独使用，也可以作为抗生素的辅助治疗剂达到防治细菌感染的目的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例1中夏枯草黄酮液相色谱-质谱图；

图2为本发明实施例2中夏枯草黄酮对铜绿假单胞菌PAO1-lasB-gfp表达影响的结果图；

图3为本发明实施例2中夏枯草黄酮对铜绿假单胞菌PAO1-lasB-gfp生长影响的结果图；

图4为本发明实施例2中提供的夏枯草黄酮抑制铜绿假单胞菌PAO1-lasB-gfp表达的IC50值(5.5h)的统计结果图；

图5为本发明实施例3中夏枯草黄酮对铜绿假单胞菌PAO1-pqsA-gfp表达影响的结果图；

图6为本发明实施例3中夏枯草黄酮对铜绿假单胞菌PAO1-pqsA-gfp生长影响的结果图；

图7为本发明实施例3中夏枯草黄酮抑制铜绿假单胞菌PAO1-pqsA-gfp IC50值(3.75h)的统计结果图；

图8为本发明实施例4中夏枯草黄酮对铜绿假单胞菌绿脓菌素分泌影响的结果图；

图9为本发明实施例5中夏枯草黄酮对铜绿假单胞菌弹性蛋白酶分泌影响的结果图；

图10本发明实施例6中夏枯草黄酮对生物膜抑制影响的结果图。

具体实施方式

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中所用原料均为市售或自制，其中PAO1-lasB-gfp绿色荧光蛋白报告菌株、PAO1-pqsA-gfp绿色荧光蛋白报告菌株以及铜绿假单胞菌PAO1均从南洋理工大学获得。

实施例1：夏枯草黄酮的制备

(1)将100g夏枯草放入万能粉碎机中进行粉碎，得到粉碎后的夏枯草。

(2)将100g粉碎后的夏枯草置于2000ml圆底烧瓶中，加入体积分数60％的乙醇中浸泡过夜后进行2次加热回流提取，回流提取的温度为85℃，每次1.5h，过滤除去不溶物，滤液减压干燥，得到第一提取物。

(3)将提取物用大孔树脂柱层析法进行纯化分离，大孔树脂选用D101型，大孔树脂先用无水乙醇浸泡24h活化，装柱后用纯化水洗至无醇味。上样，先用2BV纯化水冲洗，再用4BV 80％乙醇溶液进行洗脱并收集得到洗脱液，最后将洗脱液减压干燥得到夏枯草黄酮，其中，夏枯草黄酮与乙醇的质量比为1：10。

从图1夏枯草黄酮液相质谱图的数据可知，本实施例成功制得夏枯草黄酮。

实施例2：夏枯草黄酮对铜绿假单胞菌PAO1-lasB通路的影响

测试样品：取实施例1的夏枯草黄酮(PV-OF)，用100％DMSO配制成200μM的储备液。

实验方法：将夏枯草黄酮在96孔微量滴定板中与ABTGC培养基混合用二倍稀释法混合最终每孔中有100μL含药的ABTGC培养基。取PAO1-lasB-gfp菌株在37℃，200rpm的LB培养基中培养12-16小时的培养物，在ABTGC培养基中稀释至600nm(OD600)的最终光学密度为0.02(2.5×10⁸CFU/mL)。接着，在96孔微量滴定板的每孔中加入100μL的细菌悬浮液，使得每孔中夏枯草黄酮的最终浓度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625μM。并在同一个96孔板上设置10μmol异硫氰酸酯类化合物Iberin阳性对照组(Positive)、0.2％DMSO溶剂对照组以及200μL均为PAO1-lasB-gfp菌株的细菌对照组(Bacteria)。将96孔微量滴定板在37℃的Tecan Infinate 200Pro读板仪中孵育至少16小时，其中每隔15分钟测量以下参数：OD600，GFP荧光信号(激发波长485nm，发射波长535nm)。所有测试样品和对照的抑制测定均一式三份进行。

实验结果：图2中夏枯草黄酮对PAO1-lasB通路抑制的实验结果表明，各组lasB-gfp的表达水平随培养时间增大呈现先增后降，然后逐渐稳定的趋势；夏枯草黄酮对lasB-gfp报告基因的表达具有抑制作用，在菌株对数生长期的4-7h，夏枯草黄酮对菌株lasB-gfp的荧光有显著的抑制作用，且呈现量效关系，浓度越高，夏枯草黄酮对菌株lasB-gfp荧光的抑制作用越强。由图3可知，各组PAO1-lasB-gfp菌株生长情况相近，而且与夏枯草黄酮的浓度无关。说明本发明夏枯草黄酮在不影响报告菌株生长的情况下，可以抑制细菌群体感应系统的lasB通路。图4表明，在培养5.5h时，夏枯草黄酮对铜绿假单胞菌lasB-gfp的抑制的IC50为58.17μg。

实施例3：夏枯草黄酮对铜绿假单胞菌PAO1-pqsA通路的影响

测试样品：取实施例1夏枯草黄酮，用100％DMSO配制成200μM的储备液。

实验方法：取过夜培养好的PAO1-pqsA-gfp绿色荧光蛋白报告菌株，实施实施例2实验方法步骤。

实验结果：图5中夏枯草黄酮对PAO1-pqsA通路抑制的实验结果表明，各组pqsA-gfp的表达水平随培养时间增大呈现先增后降，然后逐渐稳定的趋势；夏枯草黄酮对pqsA-gfp报告基因的表达具有抑制作用，在菌株对数生长期的4-7h，夏枯草黄酮对菌株pqsA-gfp的荧光有显著的抑制作用，且呈现量效关系，浓度越高，夏枯草黄酮对菌株pqsA-gfp荧光的抑制作用越强。由图6可知，各组PAO1-pqsA-gfp菌株生长情况相近，而且与夏枯草黄酮的浓度无关。说明本发明所述的夏枯草黄酮在不影响报告菌株生长的情况下，可以抑制细菌群体感应系统的pqsA通路。图7表明，在培养3.75h时，夏枯草黄酮对铜绿假单胞菌pqsA-gfp抑制的IC50为119.1μg。

综合本发明实施例2和实施例3的实验结果，说明本发明实施例制得的夏枯草黄酮可以通过抑制细菌群体感应系统的两种信号通路，同时不抑制菌株生长，从而达到抑制细菌产生耐药性的效果。因此，该化合物可用于制备细菌群感抑制剂。

实施例4：夏枯草黄酮对铜绿假单胞菌绿脓菌素分泌的影响

测试样品：取实施例1的夏枯草黄酮，用100％DMSO配制成100mg/ml的储备液，以红霉素作为阳性对照(Ery)，以0.2％的DMSO作为溶剂对照(DMSO+control)。

实验方法：取培养好之后的铜绿假单胞菌PAO1，于100mL锥形瓶，内含已经灭菌好的30mL ABTGC培养基，加入相应浓度的夏枯草黄酮以及等量的细菌至最终OD600＝0.01，放入37℃摇床，200r/min，培养24小时。细菌生长24小时以后，均全部混匀先测OD600，细菌培养24小时之后，取5mL菌液，10000rpm/min，4℃离心10min，离心后取上清液40mL加入3mL氯仿提取，后将氯仿层(下层)移至新管，加入0.3倍氯仿的0.2M HCL，离心后取上层测OD520。

实验结果：从图8中可以看出，实施例1夏枯草黄酮抑制铜绿假单胞菌的绿脓菌素的分泌，其效果略逊于阳性药物红霉素，但仍可证实实施例1夏枯草黄酮具有抗铜绿假单胞菌作用，通过抑制pqsA系统，抑制细菌的绿脓菌素的分泌，从而降低细菌的致病力。

实施例5：夏枯草黄酮对铜绿假单胞菌弹性蛋白酶分泌的影响

测试样品：取实施例1的夏枯草黄酮作为实验组(PV-OF)，以红霉素(Ery)和呋喃酮(Fur)为阳性对照组，用100％DMSO配制成100mg/ml的储备液。以0.2％的DMSO作为溶剂对照(DMSO+control)。

实验方法：待灭菌后的培养基冷却至室温后，向其中加入夏枯草黄酮至所需浓度，并将培养过夜的铜绿假单胞菌PAO1标定在OD600＝0.01加入到锥形瓶中，放置于37℃摇床，200r/min，培养24小时。细菌生长24小时以后，均全部混匀先测OD600，细菌培养24小时之后，取5mL菌液，10000r/min，4℃离心10min。并用0.22μm过滤器过滤一次，遵照试剂盒EnzChekfi Protease Assay Kit E6638操作步骤，用1×reaction buffer配置弹性蛋白浓度到50μg/mL，细菌上清液和已经配好的底物各加100μL，稍稍混匀之后，立马放入酶标仪，每隔10min，连续4小时测荧光(激发波长400nm，发射波长450nm)，荧光含量的高低表示弹性蛋白酶含量的多少，其中检测所得OD值均除以OD600以除去细菌密度的影响。

实验结果：图9的实验数据表明，各实验组弹性蛋白酶水平随时间延长呈缓慢上升的趋势，夏枯草黄酮的抑制效果优于红霉素，略低于呋喃酮类化合物，远强于DMSO溶剂对照组，证实本发明所述的黄酮具有抗铜绿假单胞菌作用，通过抑制LasB系统，抑制细菌的弹性蛋白酶分泌，从而降低细菌的致病力，能够作为新型的群体感应抑制剂。

实施例6：夏枯草黄酮的生物膜抑制实验

测试样品：取实施例1的夏枯草黄酮作为实验组(PV-OF)配制成200μg/mL，10μmol阿奇霉素(AQ)为阳性对照，0.2％DMSO为阴性对照。

实验方法：往孔板中分别加入100μL所准备的待测样品，接种100μL菌液。设置阴性对照组(LB培养基及菌液各100μL)。置于37摄氏度温箱中孵化。20h后，吸取孔内表层菌液，蒸馏水洗涤三次，洗去浮游细菌。干燥或者烘箱烘干后，加入220μL浓度为1％的结晶紫，室温放置30min，然后蒸馏水小心洗涤3次；加入230μL 95％乙醇溶解生物膜-结晶紫复合物，酶标仪630nm波长处测定孔板吸光度值，平行测定三次。

实验结果：图10的实验数据表明夏枯草黄酮对铜绿假单胞菌的生物膜具有较好的抑制效果，其抑制效果与阳性药阿奇霉素相似，说明可以通过抑制细菌的群体感应系统，从而达到能够在降低细菌毒力及致病力的同时不抑制细菌的生长，不易产生细菌耐药性的效果。

实施例7：抗铜绿假单胞菌群体感应颗粒剂

夏枯草黄酮 10mg

乳糖 15mg

淀粉浆 3mg

本实施例抗铜绿假单胞菌颗粒剂的制备步骤如下：

将夏枯草黄酮与乳糖混合10min～15min，再加入10％淀粉浆制软材，过14目筛，制粒后干燥；接着过12目筛，整粒后干燥，得到抗铜绿假单胞菌颗粒剂。

实施8：抗铜绿假单胞菌群体感应胶囊剂

本实施例抗铜绿假单胞菌胶囊剂的制备步骤如下：

将夏枯草黄酮与乳糖混合10min～15min，加入微晶纤维素混合10min～15min，再加入滑石粉混合3min～5min，接着将混合物装入明胶胶囊壳，得到抗铜绿假单胞菌胶囊剂。

实施例9：抗铜绿假单胞菌群体感应片剂

本实施例抗铜绿假单胞菌片剂的制备步骤如下：

将夏枯草黄酮与乳糖混合10min～15min，加入10％淀粉浆制软材，过14目筛，制粒后干燥，过12目筛整粒，再加入交联聚维酮和硬脂酸镁，混合3min～5min，混合均匀后压片，得到抗铜绿假单胞菌片剂。

实施例10：抗铜绿假单胞菌群体感应滴丸

夏枯草黄酮 10mg；

聚乙二醇 60mg；

本实施例抗铜绿假单胞菌滴丸的制备步骤为：

分别称取夏枯草黄酮和聚乙二醇，将聚乙二醇加热至熔融后，搅拌下加入夏枯草黄酮，混匀得到混合液；将混合液加入于滴丸机的滴制装置内，通过滴头滴入冷凝液中，调整滴丸机的温度控制系统，滴丸机的滴头温度保持在80℃，冷凝液的梯度温度保持在35℃，滴管口内径3mm；最后取出药丸，除去表面冷凝液，即得抗铜绿假单胞滴丸。

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。