阅读说明：本技术 夏枯草水提物在制备防治寨卡病毒感染的药物中的应用 (Application of selfheal aqueous extract in preparation of medicine for preventing and treating Zika virus infection ) 是由 李耿 龙海珊 喻良文 吕东勇 刘小虹 于 2019-12-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及夏枯草水提物在制备防治寨卡病毒感染的药物中的应用。本发明应用中的夏枯草水提物对寨卡病毒有明显的抑制作用,可用于制备防治寨卡病毒感染的药物。本发明所述的防治寨卡病毒感染的药物是由夏枯草水提物医学上可接受的辅料制成临床上可接受的固体或液体口服制剂。(The invention relates to an application of a selfheal aqueous extract in preparing a medicament for preventing and treating Zika virus infection. The selfheal aqueous extract applied in the invention has obvious inhibition effect on Zika virus and can be used for preparing medicaments for preventing Zika virus infection. The medicine for preventing and treating Zika virus infection is a clinically acceptable solid or liquid oral preparation prepared from medically acceptable auxiliary materials of a selfheal aqueous extract.)

夏枯草水提物在制备防治寨卡病毒感染的药物中的应用

技术领域

本发明涉及含来自夏枯草植物的未确定结构的药物制剂，具体涉及唇形科夏枯草植物在制药中的新用途。

背景技术

寨卡病毒分为两个主要谱系，即非洲谱系和亚洲谱系。寨卡病毒(Zika virus)在分类上属黄病毒科、黄病毒属，属于单股正链RNA病毒，全长10,794kb，具有一个开放阅读框编码病毒多聚蛋白，5’和3’非编码区位于开放阅读框两侧。ZIKV编码的多聚蛋白可以在宿主细胞蛋白酶和病毒NS2B-NS3蛋白酶作用下裂解成为3个结构蛋白(糖蛋白E、包膜糖蛋白prM/M、核衣壳蛋白C)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)，结构蛋白位于氨基端，非结构蛋白位于羧基段，具有丝氨酸蛋白酶、RNA解旋酶和RNA依赖RNA聚合酶(RdRP)功能。近年，ZIKV在世界范围内大规模流行，有研究表明，ZIKV可以触发先天性小头畸型(Congenital microcephaly)、格林-巴利综合症(Guillain-barre syndrome)和其他神经系统症状。寨卡病毒除了通过蚊虫传播和性传播之外，ZIKV还可以通过母婴传播，这是导致小头症的主要原因。目前，全球有许多研究机构正在进行寨卡病毒疫苗的研发，但是治疗寨卡病毒尚无特效药物或者疫苗，应对该病毒主要以防蚊灭蚊等预防方式为主。对于寨卡病毒进一步的研究是十分必要的，并且对于寻找一种有效治疗寨卡病毒的药物迫在眉睫。

夏枯草属于唇形科植物夏枯草的干燥果穗，味辛、苦，性寒，归肝、胆经，具有清肝明目、消肿散结等功效，用于治疗目赤肿痛、目珠夜痛、头痛眩晕、瘿瘤瘰疬、乳痈乳癖等。现代临床多用于甲状腺疾病、乳腺增生、高血压、皮肤病、淋巴瘤等疾病的治疗，以及配合他药治疗失眠、***增生、肺结核、囊肿、急慢性咽炎、手足皲裂脱皮、咯血、子宫肌瘤、***、癫症、***等。目前对夏枯草的抗病毒研究主要集中在抗HSV、RSV、HIV，以及埃博拉病毒等，尚且文献中未见有关夏枯草抗寨卡病毒的研究。

本发明所要解决的技术问题是提供夏枯草在制药中的新用途。

上述新用途具体是，夏枯草水提物在制备防治寨卡病毒感染的药物中的应用。

上述应用中，所述的药物是夏枯草水提物与常规用量的医学上可接受的辅料制剂制成的临床可接受的固体或液体口服制剂。

上述应用中，所述的固体口服制剂具体是临床上可接受的颗粒剂、胶囊剂或片剂。

上述应用中，所述的液体口服制剂具体是临床上可接受的口服液。

上述应用中，所述的夏枯草水提物可采取本领域常用的方法提取得到，本发明人推荐的方法如下所述：

取夏枯草药材，加入10倍剂量的水，回流提取30分钟，放冷，滤过，取滤液，浓缩，干燥，即得夏枯草水提物。

本发明所述的固体口服制剂的制备方法为药典上所规定的常规制备方法，即将夏枯草水提物与固体口服制剂常用的辅料按临床上可接受配比混合制得。

本发明所述的液体口服制剂的制备方法为药典上所规定的常规制备方法，即将夏枯草水提物与液体口服制剂常用的辅料按临床上可接受配比混合制得，搅匀，滤过，罐装，灭菌，即得。

本发明所述的固体口服制剂或液体口服制剂具有抗寨卡病毒的作用，可以用于防治寨卡病毒的感染。

以下通过实验来进一步说明本发明的药物的安全性和有益效果。

本发明采用细胞病变抑制实验(CPE现象)来研究夏枯草对寨卡病毒的抑制作用，观察夏枯草水提物对Vero细胞的毒性作用和对寨卡病毒的抑制作用，利用MTT法测定夏枯草的水提物的半数有毒浓度和半数有效浓度。并通过RNA提取，而后采用RT-PCR法检测夏枯草抗寨卡病毒的作用；通过Western blot法检测夏枯草水提物在Vero细胞中对寨卡病毒蛋白表达的影响。

一.细胞实验

1.实验材料

1.1细胞株

C6/36细胞株：白蚊伊蚊细胞株(C6/36)购自上海中科院细胞库；

Vero-E6细胞株：绿猿猴肾上皮细胞株(Vero-E6)由武汉大学病毒学国家重点实验室馈赠；

寨卡病毒株：SZ01/2016，亚洲型，由广东省疾病预防控制中心CDC馈赠。

1.2受试药物

受试样品：下述实施例1制备的夏枯草水提物。

1.3病毒株

Zika Vrius(GenBank accession KU963796)来源于广东省疾病预防控制中心，在C6/36细胞中进行扩增，上清液通过0.45μm微孔滤膜过滤后储存于-80℃。病毒滴度由空斑实验在Vero细胞测定。

1.4试剂和仪器

新生小牛血清及DMEM培养基(Gibco公司)；DMSO(Sigma公司)；胰蛋白(美国DIFCO公司)。Olympus PM-6倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)。

2.方法

2.1夏枯草在Vero、HeLa细胞上毒性浓度的测定

将细胞培养瓶中生长状态适宜的Vero、Hela细胞以2×10⁴/100μl/孔接种于96孔板中(白色平底)，于37℃5％CO2孵育过夜。将药物用细胞生长培养液(含10％血清)按终浓度500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000和4500μg/mL稀释。吸去培养基，每孔分别加入100μl对应的药物溶液。同时设置空白组(只含有PBS不含细胞)以及正常细胞作为对照。48小时后分别向每孔中加入20μL/孔的5mg/mL的MTT溶液，置于含5％CO2的37℃恒温培养箱中作用4h。(同时弃去四周PBS溶液，加入MTT溶液做调零组)。4h后，取出96孔板。轻轻甩去MTT溶液，静置1min，再次甩去MTT溶液。分别加入150μL/孔的DMSO溶液，振荡10min，于490mm处测OD值。

细胞存活率计算公式：

细胞存活率％＝(药物组-空白组)/(正常组-空白组)×100％计算50％毒性浓度为药物半数有毒浓度(TC₅₀)。

上述方法所得到的Vero细胞存活率与夏枯草水提物浓度关系的曲线如图1所示；按上述方法所得到的HeLa细胞存活率与夏枯草水提物浓度关系的曲线如图2所示。

2.2寨卡病毒滴度的测定

将细胞瓶中成片生长的Vero细胞用胰蛋白酶消化计数，以2×10⁵个细胞/ml/孔接种到12孔板中，置于含5％CO2，30℃恒温培养箱培养18h。吸去培养基，加入稀释好的不同浓度的病毒稀释液100μl/孔，再加400μl/孔培养基补充至500μl，另取无血清的DMEM培养基500μl/孔做空白对照。混匀，置于含5％CO2，30℃恒温培养箱吸附2h。吸去病毒液，加入1ml/孔0.8％CM-2％FBS-DMEM培养液，置于含5％CO2，30℃恒温培养箱培养7d。加入1.5ml/孔4％多聚甲醛固定液，室温固定过夜。弃上清，加入250μl/孔1％结晶紫溶液，室温孵育30min，计数空斑，Pfu/ml＝空斑数×(1000/100)×稀释因子的倒数。

2.3夏枯草水提物在Vero细胞中对寨卡病毒诱导细胞病变的影响

用无菌PBS配制成夏枯草药物的母液。将Vero、Hela细胞均匀地接种至96孔细胞培养板中，待细胞生长至4×10⁴个/孔时更换成无血清的DMEM培养基，加入终浓度为100，75，50，25，10，2，1，0.1，0.01μM DMEM培养基梯度稀释的待测药物，37℃细胞培养箱孵育1h。孵育后每孔加入感染复数(multiplicity of infection)MOI＝0.5的寨卡病毒，37℃细胞培养箱吸附1h。弃去病毒液，用PBS润洗一次，加入含药培养基，37℃细胞培养箱培养48h。收集细胞上清液测定病毒滴度。计算50％病毒抑制浓度为药物半数有效浓度(EC₅₀)选择指数SI＝CC₅₀/EC₅₀。

采用CPE观察法于显微镜下观察，结果如图3所示；将夏枯草水提物在不同给药模式下对寨卡病毒感染Vero细胞凋亡影响的数据进行统计分析，结果如图4所示；夏枯草水提物对Vero细胞中寨卡病毒抑制率影响的数据绘制成曲线，结果如图5所示。

2.4RT-qPCR法测定夏枯草水提物在Vero细胞中抗寨卡病毒作用

首先进行RNA的提取，而后进行逆转录，获得所需的RNA,最终进行实时荧光定量PCR,设计实时荧光定量PCR引物对，取上述“逆转录”所得产物cDNA，配制反应体系。每个样品同时用于寨卡病毒基因组和GAPDH组，每组设置3个复孔，加样结束后，玻璃纸封闭PCR板，2000r/min离心2min。用qPCR仪检测，处理数据。病毒抑制率计算公式如下：

病毒抑制率％＝(对照基因表达量－实验组基因表达量)/对照基因表达量×100％。

计算结果如下表1所示：

表1夏枯草水提物对Vero细胞中寨卡病毒核酸复制的影响(X±SEM，n＝3)

2.5体外对寨卡病毒蛋白的抑制作用的测定(蛋白质印迹法)

前面的步骤同药效试验方法2.3，加病毒刺激并给药不同浓度的夏枯草水提物，作用48h后收集Vero细胞样品，4000r/min离心5min，弃上清，加入含蛋白酶抑制剂的CocktaiL1：50的RIPA细胞裂解液80μl，反复吹打，于4℃冰箱辅助裂解60min，4℃12000r/min离心10min，取少量上清液进行蛋白质定量，取少量样品制作蛋白质标准曲线。配制聚丙烯酰胺凝胶，电泳(80V电泳30min，120V电泳约60min)，转膜(180mA，2h)，5％牛奶液封闭(0-10r/min，封闭60min)，抗体杂交(一抗4℃低速摇床孵育过夜，二抗室温低速孵育50min)，利用Bio-RadChemiDocXRS+超高灵敏度化学发光成像仪曝光，分析条带，结果图6所示。

二.动物实验

3.动物

INFAR1-/-C57BL/6小鼠，SPF级，3～4周龄，体重13～15g，雌雄各半，共24只，由广州医科大学赵金存教授提供。饲养于广州中医药大学实验动物中心ABSL-2实验室[粤广动实备GZL0004号]，温度为22～25℃，相对湿度为40～70％，实行光照/黑暗各12h昼夜循环，喂以无菌的颗粒鼠料，饮用水为超纯水，垫料为无菌玉米芯，动物实验开展经广州中医药大学实验动物伦理委员会批准。

4.方法

4.1动物分组及模型建立

随机将小鼠分为4组，每组6只，雌雄各半，分别为正常对照组、病毒对照组、夏枯草水提物高剂量组和夏枯草水提物低剂量组。病毒对照组、夏枯草水提物高剂量组及低剂量组每只小鼠均经腹腔途径接种10⁵PFU寨卡病毒。高、低剂量组小鼠通过灌胃方式进行给药，给药剂量分别为900mg/kg、450mg/kg，病毒对照组和正常对照组以等容积无菌PBS进行灌胃；各组每天灌胃1次，连续12天。

4.2临床观察

自小鼠接种寨卡病毒后，持续观察小鼠的临床症状，如：活动情况、精神状态、弓背、四肢麻痹、濒死或死亡情况等，持续观察12天，记录各组存活情况和体重变化。结果如图7、图8、图9所示。

5.结论

正常对照组小鼠体重呈持续增长趋势，无发病及死亡。病毒对照组小鼠在第4天体重明显逐渐下降，在第6天开始出现弓背等现象，第7天出现后肢瘫痪、麻痹等典型神经系统症状，在第9天全部死亡。夏枯草水提物高剂量、低剂量组在4天后体重开始逐渐下降，低剂量组在第7天开始出现弓背等现象，第8天出现后肢瘫痪、麻痹等典型神经系统症状，在第10天全部死亡，而高剂量组小鼠的体重在第8天后停止下降趋势，呈缓慢上升趋势，在第12天有1只小鼠死亡，其余5只状态良好，未出现弓背、后肢瘫痪等现象。

在第3天时，夏枯草水提物高剂量组小鼠的血清病毒RNA拷贝数较病毒对照组和低剂量组小鼠均十分显著降低(P＜0.001)，夏枯草水提物低剂量组小鼠的血清病毒RNA拷贝数较病毒对照组小鼠显著降低(P＜0.05)。在第5天时，夏枯草水提物高剂量组小鼠的血清病毒RNA拷贝数较病毒对照组和低剂量组小鼠十分显著降低(P＜0.001)。

上述实验均证明夏枯草水提物具有抗寨卡病毒的作用。

附图说明

图1为Vero细胞存活率与夏枯草水提物浓度关系曲线。

图2为HeLa细胞存活率与夏枯草水提物浓度关系曲线。

图3为夏枯草水提物对寨卡病毒诱导细胞病变影响的显微照片。

图4为夏枯草水提物在不同给药模式下对寨卡病毒感染Vero细胞凋亡影响的条形图。

图5为夏枯草水提物对Vero细胞中寨卡病毒抑制率影响的曲线图。

图6为夏枯草水提物对Vero细胞中寨卡病毒蛋白表达影响的电泳条带，图中自左向右依次是：泳道1为只有正常细胞的空白对照组，泳道2为含有寨卡病毒的对照组，泳道3-9为浓度分别是25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml和300μg/ml的夏枯草水提物。

图7为夏枯草水提物对寨卡病毒感染INFAR1-/-C57BL/6小鼠后，各组的体重随病毒感染时间变化图。

图8为夏枯草水提物对寨卡病毒感染INFAR1-/-C57BL/6小鼠后各组小鼠随着感染时间的变化，对存活个数进行计数图。

图9为夏枯草水提物对INFAR1-/-C57BL/6小鼠血清，分别于第3、5天检测病毒在RNA水平上拷贝数目的变化图；图中，*表示两组差异显著，P＜0.05；***表示两组差异很显著，P＜0.001。

具体的实施方案

例1：(制备夏枯草水提物)

取夏枯草10kg,加100L蒸馏水浸泡30分钟，煎煮30分，趁热过滤，浓缩至1g/ml比重的稠浸膏，干燥，得夏枯草水提物。

例2：(颗粒剂)

取实例1得水提物9g加入蔗糖、糊精等辅料，置于沸腾制粒机中混合、制粒，干燥，与淀粉、交联PVP、羧甲基淀粉钠混合均匀，用5％PVP的75％乙醇溶液作为粘合剂，制软材，以18目筛制粒，60℃干燥后1h，分装，制成规格为每袋30mg颗粒供口服使用。干燥，分装。本品为灰棕色，味苦、辛。供口服使用。每日2～3次，一次一袋。其它项目应符合中华人民共和国药典2015年版颗粒剂项下的有关规定。

例3：(胶囊剂)

取实例1下的水提物15g,加入淀粉等辅料，置于沸腾制粒机中混合、制粒，干燥。将所得颗粒装入1号硬明胶胶囊中，每粒300mg分装。供口服使用。本品为胶囊剂，内容物为灰棕色的颗粒或粉末，味苦、辛，供口服使用。每日2～3次，一次一粒。其它项目应符合中华人民共和国药典2015年版胶囊剂项下的有关规定。

例4：(片剂)

取实例1的水提物15g,加入淀粉等辅料，置于沸腾制粒机中混合、制粒，干燥后加入适量硬脂酸镁压片，每片300mg分装。供口服使用。本品为灰棕色片剂，味苦、辛，供口服使用。每日2～3次，一次一片。其他项目应该符合中华人民共和国2015年版片剂项下的有关规定。

例5：(口服液)

取实施例1的水提物15g,加水适量溶解，滤过，加入单糖浆及苯甲酸钠适量，加水至1000ml,搅匀，静置，滤过，灌封，灭菌。本品为棕色澄清液体，味苦、辛，供口服使用。每日2～3次，一次一支。其他项目应该符合中华人民共和国药典2015年口服液项目下的有关规定。