一种具有抗hsv活性的夏枯草提取物及其制备方法和医药用途
阅读说明：本技术 一种具有抗hsv活性的夏枯草提取物及其制备方法和医药用途 (Prunella vulgaris extract with HSV (herpes Simplex Virus) resisting activity as well as preparation method and medical application thereof ) 是由 徐宏喜 张群铄 李洋 付文卫 钟煊蕾 冯极灵 罗小妹 袁满 于 2021-05-12 设计创作，主要内容包括：一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物,取夏枯草果穗或其粉末,加水10-22体积倍量,加热回流提取2-4次,过滤,合并滤液,减压浓缩,然后再加入0.2-1倍体积的乙醇使得乙醇浓度为10-50％v/v,4℃静置6-24小时后离心,得到的沉淀用浓度为10-50％v/v乙醇洗涤至少两次,收集沉淀,干燥即得。本发明还提供了上述本发明夏枯草提取物的制备方法和用途。本发明提供的夏枯草提取物具有显著的体内外抗HSV作用,其体外抗HSV的活性较水提物增强了一倍,且对ACV耐药的HSV临床株及耐药株也有稳定的抑制作用。同时,对治疗HSV-1及HSV-2感染引起的皮肤及生殖器疱疹均有良好的疗效。(A Prunellae Spica extract with anti-HSV activity is prepared by collecting Prunellae Spica or its powder, adding 10-22 volume times of water, heating and reflux-extracting for 2-4 times, filtering, mixing filtrates, concentrating under reduced pressure, adding 0.2-1 volume times of ethanol to make ethanol concentration be 10-50% v/v, standing at 4 deg.C for 6-24 hr, centrifuging, washing obtained precipitate with 10-50% v/v ethanol for at least two times, collecting precipitate, and drying. The invention also provides a preparation method and application of the selfheal extract. The selfheal extract provided by the invention has obvious in-vivo and in-vitro anti-HSV effects, the in-vitro anti-HSV activity of the selfheal extract is doubled compared with that of an aqueous extract, and the selfheal extract also has stable inhibition effect on ACV drug-resistant HSV clinical strains and drug-resistant strains. Meanwhile, the medicine has good curative effect on treating herpes on skin and genitals caused by HSV-1 and HSV-2 infection.)
技术领域
本发明属于医药
技术领域
，涉及一种夏枯草，具体来说是一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物及其制备方法和医药用途。背景技术
单纯疱疹病毒(HSV)分为I型(HSV-1)和II型(HSV-2)，病毒经口腔及生殖器等侵入体内，长期潜伏和反复发作，其发病率呈上升趋势，会引发多种疾病及严重的并发症。临床治疗药物主要为阿昔洛韦(ACV)等核苷类似物，对于严重及频繁复发的病例，需大剂量长期给药，易产生耐药。因此，迫切需要研发与阿昔洛韦结构及作用机制不同的抗HSV药物。
申请人团队前期建立了中药抗病毒筛选平台，并对具有清热解毒功效及文献报道有抗病毒活性的中药进行系统的筛选，发现夏枯草水提醇沉部位及部分多糖类成分具有显著抗HSV作用。
夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，功能清火、明目、散结、消肿。用于目赤肿痛、目珠夜痛、头痛眩晕、瘰疬、瘿瘤、乳痈肿痛等，具有悠久的临床用药史。清·《验方新编》记载对口疮，用新鲜夏枯草入盐，津唾少许，捣烂敷患处，已成留头，未成满敷，三次即愈。
中国发明专利申请(201410561972.8)公开了一种夏枯草提取物，所述夏枯草提取物用如下方法制得：将夏枯草果穗加水10-22倍量，加热回流提取2-4次，每次0.5-2h，过滤，滤液过0.45μm水膜微滤，收集过0.45μm水膜微滤后的滤液，将所收集的过0.45μm水膜微滤后的滤液再过截留分子量为3-500kDa的超滤膜，收集未透过超滤膜的药液，浓缩，干燥。该夏枯草水提物抗疱疹病毒活性IC50为93.11±23.46μg/mL；经超滤纯化后的多糖提取物IC50为77.56±4.19μg/mL。
中国发明发明申请(201610066061.7)公开了一种夏枯草均一多糖，所述均一多糖的总糖含量为53％-65％；所述均一多糖的分子量为23.4kDa-41.7kDa；且所述均一多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，该均一多糖IC50为84.84μg/mL。
《夏枯草水溶性多糖乙醇分级纯化及其理化性质研究》(2016年4月1日33,No.20,2012.张霞,聂少平*,李昌,谢明勇)一文中公开了一种夏枯草水溶性多糖的提取方法：采用水提醇沉法从夏枯草果穗中得到夏枯草多糖，将所得多糖复溶于水，依次在乙醇体积分数为20％、30％、40％、50％、60％和70％的条件下分级醇沉多糖，得到PVLP-1、PVLP-2、PVLP-3、PVLP-4、PVLP-5和PVLP-6等六个多糖组分。测定各组分的糖含量、糖醛酸含量及蛋白质含量等基本理化指标，并用气相色谱法测定它们的单糖组成，同时对其进行紫外和红外光谱扫描考察其光谱性质。
鉴于现有技术的状况，需要寻找具有更强抗疱疹病毒活性、活性部位更集中、制备工艺更安全、高效，更适宜于工业化生产的夏枯草抗HSV提取物组分。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有效部位集中、提取工艺简便、抗HSV活性强的夏枯草提取物及其制备方法和医药用途。
本发明提供了一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物，由如下的方法制备而成：取夏枯草果穗或其粉末，加水10-22体积倍量，加热至80-100℃回流提取2-4次，每次0.5-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩，然后再加入上述浓缩液0.2-1倍体积的乙醇使得乙醇浓度为10-50％v/v，4℃静置6-24小时后离心，得到的沉淀用浓度为10-50％v/v的乙醇洗涤至少两次，收集沉淀，干燥即得一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物。
进一步的，加入浓缩液0.2-1倍体积的乙醇至乙醇浓度为30％v/v进行沉淀，4℃静置6-24小时后离心，得到的沉淀用30％v/v的乙醇洗涤至少两次。
进一步的，所述的具有抗HSV活性的夏枯草提取物的分子量应大于2.0kDa。
进一步的，所述的具有抗HSV活性的夏枯草提取物中含总糖质量百分比为20～40％，蛋白质质量百分比为5～25％，多酚质量百分比为15～30％。
本发明还提供了一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物的制备方法，取夏枯草果穗或其粉末，加水10-22体积倍量，加热至80-100℃回流提取2-4次，每次0.5-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩，然后再加入上述浓缩液0.2-1倍的体积的乙醇使得乙醇浓度为10-50％v/v，4℃静置6-24小时后离心，得到的沉淀用浓度为10-50％v/v的乙醇洗涤至少两次，收集沉淀，干燥即得一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物。
本发明还提供上述的夏枯草提取物在制备预防或治疗单纯疱疹病毒感染的药物或保健品中的应用。
本发明还提供了一种药物组合物，其特征在于，含有上述的一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物，及药学上可接受的辅料。
本发明还提供了上述的一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物在制备预防或治疗单纯疱疹病毒感染的药物中的应用。
本发明的具有抗HSV活性的夏枯草提取物，其抗HSV体外活性较夏枯草其它提取部位有显著提高，对HSV-1及HSV-2的EC50分别为45.62±3.37μg/mL和57.14±2.37μg/mL，选择性指数SI分别大于10.96和8.75，其抗HSV活性较夏枯草水提物增强约一倍。其对阿昔洛韦(ACV)耐药的HSV病毒株也有与标准株同样的抑制作用，抗HSV作用稳定，可以用于治疗ACV耐药的HSV病毒株引起的疱疹病毒感染。该提取物具有显著的抑制I型疱疹导致的豚鼠皮肤病变和后肢瘫痪作用，并且其高、中剂量组的抑制活性优于ACV。相对于病毒对照组，该提取物可显著减轻HSV-2引起的小鼠阴道感染症状，缓解病灶部位病变情况，延长小鼠寿命。该提取物糖类、蛋白质类、多酚类成分的鉴别反应呈阳性，游离氨基酸、醌类、皂苷类、黄酮类成分的鉴别反应呈阴性。
通过体外CCK-8比色法实验及体内抗HSV表明：本发明提供的夏枯草提取物具有显著的体内外抗HSV作用，其体外抗HSV的活性较水提物增强了一倍，且对ACV耐药的HSV临床株及耐药株也有稳定的抑制作用。同时，对治疗HSV-1及HSV-2感染引起的皮肤及生殖器疱疹均有良好的疗效。
本发明与现有的技术相比，其技术进步是显著的。本发明公开的夏枯草提取物，抗HSV活性成分更集中，针对性更强，成药性更高，其他成分组成更明确；另外，在工艺上，该方法醇用量更少，且工艺不涉及有毒试剂，更经济高效，适于工业化生产。
与《夏枯草水溶性多糖乙醇分级纯化及其理化性质研究》中公开的制备方法相比，本发明涉及的分级醇沉操作更简单，不需经过乙醇浸泡和透析处理，夏枯草果穗直接采取热水提取后加入相应浓度的乙醇即得；本发明涉及的分级醇沉分段更准确，加入相应浓度乙醇沉淀后再用同等浓度的乙醇对沉淀进行洗涤，可减少因为醇沉不完全引入其他醇沉浓度的沉淀，凝胶色谱显示采取该方法处理得到的各分级沉淀部分分子量分布更集中；且二者单糖组成及大类成分含量不同。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
下面将结合
具体实施方式
进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
附图说明
图1显示了夏枯草提取物的制备流程。
图2显示了夏枯草水提物分级醇沉工艺流程。
图3显示了水提物分及级醇沉各部分HPGPC色谱图。
图4显示了夏枯草水提物与夏枯草醇提物的UPLC-QTOF-MS/MS色谱图。
图5显示了采用夏枯草提取物后的豚鼠皮肤病变情况。
图6显示了夏枯草提取物对豚鼠皮肤病变的评。
图7显示了夏枯草提取物对豚鼠后肢瘫痪的评分。
图8显示了采用夏枯草提取物后的豚鼠体重变化。
图9显示了采用夏枯草提取物后的小鼠病变情况。
图10显示了一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物的直观形貌。
图11显示了一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物的HPGPC色谱图。
图12显示了一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物的单糖组成的HPLC色谱图。
图13显示了一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物中氨基酸的色谱图。
图14按照《《夏枯草水溶性多糖乙醇分级纯化及其理化性质研究》(2016年4月1日33,No.20,2012.张霞,聂少平*,李昌,谢明勇)处理得到的30％醇沉部分与夏枯草水提物的HPGPC色谱对比。
图15本发明实施例1制得夏枯草水提物与PVE30的HPGPC色谱对比。
图16PVE30单糖组成HPLC色谱图。
具体实施方式
实施例1
本发明的技术方案按照下列步骤进行：
夏枯草不同提取部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)夏枯草不同溶剂提取物的制备(见图1)
夏枯草90％乙醇提物：取夏枯草50g，加20倍体积质量百分比浓度为90％的乙醇提取2次，2小时，过滤，弃药渣，提取液浓缩，50℃旋转蒸发减压浓缩、干燥，即得夏枯草90％乙醇提取物，命名为PV90E。
夏枯草70％乙醇提物：取夏枯草50g，加20倍体积质量百分比浓度为70％的乙醇提取2次，2小时，过滤，弃药渣，提取液浓缩，50℃旋转蒸发减压浓缩、干燥，即得夏枯草70％乙醇提取物，命名为PV70E。
(2)夏枯草水提物的分级醇沉
取夏枯草果穗或其粉末，加水10-22倍量体积，加热至80-100℃回流提取2-4次，每次0.5-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩至适量后，加入不同浓度的乙醇，分别收集沉淀即夏枯草水提醇沉30％(PVE 30)样品，夏枯草水提醇沉50％样品(PVE 50)，夏枯草水提醇沉70％样品(PVE 70)，夏枯草水提醇沉85％样品(PVE 85)，及夏枯草水提醇沉上清液(PVES)，如图2。
具体制备方法如下：
醇沉母液的制备：取夏枯草50g，加20倍体积纯化水提取1次，2小时，过滤，弃药渣，提取液50℃旋转蒸发减压浓缩至料液比1:1.04。
30％醇沉部分的制备：取醇沉母液100mL，放至室温，边用磁力搅拌器搅拌，边缓缓加入46mL乙醇使溶液乙醇浓度达30％后，密封放置在恒温4℃环境中12小时后，取出，过滤，用质量百分比浓度为30％的乙醇对沉淀进行洗涤，直至滤液无色，收集沉淀，干燥即30％醇沉部分(PVE30)；滤液合并，50℃旋转蒸发减压浓缩至无醇味，即30％上清液。
50％醇沉部分的制备：准确计量50％上清液体积，根据50％上清液体积换算乙醇加入量，边用磁力搅拌器搅拌，边加入相应体积乙醇，直至溶液乙醇浓度达50％后，密封放置于4℃冰箱12小时，取出，放至室温后过滤，用质量百分比浓度为50％的乙醇对沉淀进行洗涤直至滤液呈无色状，收集沉淀，冷冻干燥即50％醇沉部分(PVE50)；滤液合并，50℃旋转蒸发减压浓缩至无醇味，即50％上清液。
70％醇沉部分的制备：准确计量70％上清液体积，根据70％上清液体积换算乙醇加入量，磁力搅拌器一边搅拌一边加入相应体积乙醇使溶液乙醇浓度达70％后，密封放置于4℃环境，12小时后取出，放至室温后过滤，用质量百分比浓度为70％的乙醇对沉淀进行洗涤，直至滤液无色，收集沉淀，干燥即70％醇沉部分(PVE70)；滤液合并，50℃旋转蒸发减压浓缩至无醇味，即70％上清液。
85％醇沉部分的制备：准确计量85％上清液体积，根据85％上清液体积换算乙醇加入量，磁力搅拌器一边搅拌一边加入相应体积乙醇使溶液乙醇浓度达85％后，密封放置于4℃环境，12小时后取出，放至室温后过滤，用质量百分比浓度为85％的乙醇对沉淀进行洗涤，直至滤液无色，收集沉淀干燥即85％醇沉部分(PVE85)；滤液合并，50℃旋转蒸发减压浓缩至无醇味，即85％上清液(亦是总上清液，Supernatant编号：PVES)。
实施例2
本实施例采用鉴别反应、HPGPC以及分级醇沉各部分(PVE30、PVE50、PVE70、PVE85)进行化学表征，并对夏枯草醇提物(PV90E、PV70E)及水提醇沉上清液(PVES)进行了UPLC-DAD-QTOF-MS/MS分析。
(1)夏枯草水提物、醇提物及分级醇沉各部分的鉴别反应
方法：对以上各部分进行Molish反应(糖类)、碘液反应(淀粉)、考马斯亮蓝反应(蛋白质)、茚三酮反应(游离氨基酸)、FeCl3反应(鞣质)、醋酐浓硫酸反应(皂苷)、Feigl反应(醌类)、盐酸镁粉反应(黄酮)、碘化钾沉淀反应(生物碱)等。
结果：夏枯草水提物及水提醇沉上清液(PVES)的Molish反应、三氯化铁反应、醋酐浓硫酸反应、考马斯亮蓝反应均呈阳性，表明夏枯草水提物、醇提物及水提醇沉上清液中均含有糖类、多酚及鞣质、皂苷类、蛋白质类成分；茚三酮反应、Feigl反应、碘化钾沉淀反应均呈阴性，表明夏枯草水提物、醇提物及水提醇沉上清液中不含游离氨基酸、醌类及生物碱类成分。
夏枯草各分级醇沉的沉淀部分(PVE30、PVE50、PVE70、PVE85)Molish反应、三氯化铁反应、考马斯亮蓝染色均呈阳性，表明夏枯草水提物、醇提物及水提醇沉上清液中均含有糖类、多酚及鞣质类、蛋白质类成分；醋酐浓硫酸反应、茚三酮反应、Feigl反应、碘化钾沉淀反应、盐酸镁粉反应均呈阴性，表明夏枯草各分级醇沉部分中不含皂苷类、游离氨基酸类、醌类生物碱及黄酮类成分，见表1。
表1夏枯草各部分鉴别反应
(2)分级醇沉各部分HPGPC分析
方法：①标准溶液的配置：
精密称取普鲁兰(Pullulan)对照品D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8(分子量依次为6100、9600、21100、47100、107000、194000、337000、642000)各1mg，加入0.22μm水相滤膜过滤后的0.02mol/L氯化钠水溶液1mL，配成1mg/mL的标准品溶液，充分溶解后10000rpm离心10min，吸取各离心后的标准溶液上清液，排序进样。
②供试品溶液配置：
精密称取供试品2mg，精密量取1mL超纯水溶解，加入0.22μm水相滤膜过滤后的0.02mol/L氯化钠水溶液1mL，配成1mg/mL的标准品溶液，充分溶解后10000rpm离心10min，吸取离心后的供试品上清液转入液相样品瓶，排序进样。
③色谱条件：
Sugar KS-802、Sugar KS-804色谱柱串联；0.02mol/L氯化钠水溶液为流动相(0.22μm水相滤膜过滤)；流速0.8mL/min；进样体积20μL；分析时间25min；检测器为示差检测器(RID)；检测池温度40±0.1℃。
④标准曲线的绘制：
取Pullulan D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8标准溶液，经0.45μm孔滤器过滤后,采用以上所选色谱条件，使用Agilent公司GPC软件采集数据并绘制标准曲线，以标准分子量为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间为横坐标进行线性方程拟合。
⑤待测样品分子量的测定：
按照上述色谱条件，使用Agilent公司GPC软件测定出样品的分子量分布范围。
结果：对于水提物及分级醇沉各部分(PVE30、PVE50、PVE70、PVE85、PVES)，利用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)和视差折光显色器(RID)，测定样品分子量分布范围，得到结果如下：
如图3，从HPGPC色谱图上看，夏枯草水提物主要由4个主峰组成，其中PVE30的HPGPC色谱峰(A峰)主要集中分布于水提物中的2峰，对夏枯草水提物分级醇沉各部分的重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)及分布系数(D＝Mw/Mn)做统计分析，具体数据见表2，统计显示PVE30的Mw为42.54kDa，Mn为23.71kDa，说明PVE30中不含分子量在2.0kDa以下的小分子类成分。
表2夏枯草水提物各分级醇沉部分的分子量分布
(4)醇提物、及水提醇沉上清液的UPLC-DAD-QTOF-MS/MS分析
将夏枯草醇提物及水提醇沉上清液用Waters ACQUITY UPLC-QTOF-MS仪器分析，采用UPLC BEH Shield RP18色谱柱，ESI离子源，来对水提物和醇提物的部分进行物质鉴定，成分定量和定性的区分，其色谱条件见表3。
表3UPLC色谱条件
结果：通过提取物极性及分子量范围测定我们可以判断，夏枯草70％醇提物(PV70E)、90％醇提物(PV90E)及水提醇沉的上清液(PVES)等部分主要为分子量在2.0kDa以下的小分子类成分组成，对其进行UPLC-DAD-QTOF-MS/MS分析，如图4，各部分UPLC色谱峰相似度很高；根据其离子碎片信息比对文献可知，这些成分包括酚酸类成分，如咖啡酸、迷迭香酸及其衍生物等；黄酮类成分，如原儿茶酸、芦丁、丹参素、异槲皮苷或其类似物等；三萜皂苷类成分，如齐墩果酸或熊果酸、夏枯草皂苷B、白桦脂酸、科罗索酸等；以及小分子单糖或寡糖类成分，如葡萄糖酸等(见表4)。
表4夏枯草提取物离子碎片信息及成分推测
实施例3
对实施例1中制备得到的夏枯草各提取部位进行抗HSV-1/KOS、HSV-2/G标准株的活性测试，筛选出抗HSV活性最优的部分。
方法：CCK-8比色法检测夏枯草提取物对标准病毒株HSV-1/KOS及HSV-2/G的体外抑制作用。
将Vero细胞计数后，以每孔两万个细胞的密度接种于96孔细胞培养板，放置于恒温37℃、CO2体积百分比浓度为5％的培养箱中，待细胞长满单层后，弃去上层培养液，加入含100×TCID50的病毒原液，吸附一小时后，加入不同浓度的夏枯草提取物样品(100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL)，每个浓度3复孔，200μL/孔，于37℃、体积百分比5％CO2培养3天，3天后加入CCK-8，10μL/孔，使用酶标仪在450nm处测定吸光度，按公式1计算出夏枯草提取物对病毒抑制，细胞存活率。
结果：采用CCK-8法对分级醇沉得到的各部分进行细胞毒性及抗HSV的药效进行测定，计算EC50和SI值。实验结果见表5，各部分在Vero细胞上的CC50值均大于500μg/mL，表明各部分无明显细胞毒性；其中水提物30％醇沉部分(PVE30)的EC50值最小，即活性最优，而其余分级醇沉部分(PVE85、PVE70、PVE50)抗HSV的活性较弱，90％醇提物(PV90E)、70％醇提物(PV70E)和水提醇沉上清液(PVES)则无活性(见表5)。
表5夏枯草各部分的提取收率及体外抗HSV活性
通过实施例1-3，得出醇提物及水提醇沉上清液部分，抗HSV活性不显著，这些部分主要由Mw在2.0kDa以下的小分子化合物组成，其中包括单糖寡糖类、黄酮类、酚酸类、皂苷类成分等。以上结果说明夏枯草中包括《中国药典》中夏枯草的指标性成分迷迭香酸在内的分子量小于2.0kDa的小分子化合物不是其抗HSV的主要物质基础，发挥抗HSV作用的主要集中分布在分子量较大的水提醇沉部位，而其中Mw为42.54kDa、Mn为23.71kDa的夏枯草水提物30％醇沉部分(PVE30)的抗HSV活性最优。因此本专利所保护的夏枯草提取物(PVE30)分子量应大于2.0kDa。
实施例4
夏枯草提取物(PVE30)抗HSV-1/KOS、HSV-2/G标准株的活性与夏枯草水溶性多糖的对比
采用本发明申请的方法制备PVE30。
根据《《夏枯草水溶性多糖乙醇分级纯化及其理化性质研究》(2016年4月1日33,No.20,2012张霞,聂少平*,李昌,谢明勇)》一文中的方法制备夏枯草水溶性多糖，具体如下：采用水提醇沉法从夏枯草果穗中得到夏枯草多糖，将所得多糖复溶于水，依次在乙醇体积分数为20％、30％、40％、50％、60％和70％的条件下分级醇沉多糖，得到PVLP-1、PVLP-2、PVLP-3、PVLP-4、PVLP-5和PVLP-6等六个多糖组分。选取其中30％醇沉部分PVLP-2进行对比分析。
CCK-8法同实施例3。
结果：PVE30对HSV-1及HSV-2的EC50分别为45.62±3.37μg/mL和57.14±2.37μg/mL，选择性指数SI分别大于10.96和8.75，其抗HSV活性较夏枯草水溶性多糖(《夏枯草水溶性多糖乙醇分级纯化及其理化性质研究》)提高了一倍。二者之间的EC50值具有统计学差异(见表6)。
表6夏枯草水溶性多糖与PVE30的抗HSV活性对比
用统计学软件graphpad prism进行t-test分析，P<0.05表示差异有统计学意义。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)
据此我们提出一种具有更强抗HSV活性的夏枯草提取物的制备方法：取夏枯草果穗或其粉末，加水10-22倍量，加热至80-100℃回流提取2-4次，每次0.5-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩至适量，加入0.2-1倍乙醇至乙醇浓度为10-50％v/v，4℃静置6-24小时后离心，得到的沉淀用浓度为10-50％v/v乙醇洗涤至少两次，收集沉淀后干燥。得到夏枯草提取物PVE30。
实施例5
夏枯草提取物(PVE30)体外抗HSV耐药株的活性研究
方法：CCK-8比色法检测夏枯草提取物在体外对耐药株HSV-1/Blue以及临床耐药株HSV-1/106与HSV-1/153的抑制作用。
计数Vero细胞，以2万/孔接种于96孔板，静置于恒温37℃、CO2浓度为5％的培养箱中，使Vero细胞长满单层后，除去上层培养液，分别接种上述各病毒原液1000倍的稀释液0.085mL(约含100×TCID50)，吸附一小时后，和不同浓度的夏枯草样品(100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL)混合加入Vero细胞中，200μL/孔，各浓度3个复孔，同时设正常Vero细胞对照组、HSV病毒对照组、ACV阳性药物对照组。静置于恒温37℃、CO2浓度为5％的培养箱，3天后加入CCK-8，10μL/孔，使用酶标仪在450nm处测定吸光度，按公式1计算出夏枯草提取物对病毒抑制，细胞存活率。
结果：如表7所示，在两株临床株HSV-1/106、HSV-1/153和一株耐药株HSV-1/Blue上，ACV的给药浓度需要提高约300倍后，才能发挥与抗HSV-1/KOS标准株类似的抑制作用；故与ACV相比，夏枯草提取物抗ACV耐药的HSV-1感染作用比较稳定，抗耐药株的活性与标准株类似。
表7夏枯草提取物抗HSV-1/Blue，HSV-1/106及HSV-1/153的活性
实施例6
夏枯草提取物(PVE30)体内抗HSV-1的活性研究
方法：(1)豚鼠以异氟烷麻醉，背部脱毛，选取4块皮肤(1.5cm×1.5cm)作为感染面。75％酒精消毒后,用梅花针刺入皮肤深层，并滴加30μL HSV-1原液，以玻棒涂抹均匀，并摩擦感染3min，正常对照组滴加30μL无菌生理盐水。感染后随机分组，每实验组2只豚鼠，即正常对照组；病毒对照组；夏枯草提取物低剂量组(20mg/mL)；夏枯草提取物中剂量组(40mg/mL)；夏枯草提取物高剂量组(80mg/mL)；阳性药物ACV组(15mg/mL)。
(2)于感染后24小时开始给药，50μL/鼠/次，每天给药2次，连续7天，共观察2周，记录体重和死亡，观察情况，并按表8的评分标准对每只豚鼠的感染面皮肤病变病程度及后肢瘫痪情况进行记录。
表8豚鼠感染面皮肤病变程度及后肢瘫痪情况评分标准
结果：夏枯草提取物具有良好的体内抗HSV-1活性
(1)对感染面皮肤病变的抑制
依照上述方法建立豚鼠背部皮肤感染HSV-1病毒模型，观察感染后的各组豚鼠病灶状态：各组豚鼠皮肤感染后第3天，正常对照组由于针刺导致的皮肤损伤已基本恢复，而可见各感染组豚鼠的感染部位皮肤发红；第4天症状明显，开始出现小疱疹、红肿，第5-6天HSV-1感染症状迅速发展，部分感染面皮肤上的小疱疹增加到5个或5个以上，严重者可联合成片；第7-8天感染病毒的病变部位开始结痂，第9-10天即趋痊愈。对各组感染面皮肤的病变评分如图6所示，具体病变情况如图5所示。第4天时，各治疗组的皮肤病变明显比病毒对照组减轻，ACV及高、中剂量组的评分已显著低于病毒对照组，其中高剂量组降低了83％，显著优于ACV的37％。第5-6天时，高、中剂量组持续保持显著的抑制作用，高剂量组病变评分分别降低了67％和75％，中剂量部分别降低了44％和46％，但小剂量组未体现抑制活性；而ACV组，在第5天时病变评分仅降低了15％，此后的时间点，与病毒对照组无差异。总体而言，夏枯草提取物具有显著的抑制I型疱疹导致的豚鼠皮肤病变的作用，且呈剂量相关性，其中高、中剂量组的抑制活性优于ACV组。
(2)对后肢瘫痪的抑制作用
依照上述方法建立豚鼠背部皮肤感染HSV-1病毒模型，各组豚鼠在HSV-1病毒感染后24小时开始给药，观察各组豚鼠行动情况及是否存在后肢瘫痪症状，结果如下：各感染组豚鼠，第6天时，陆续出现后肢行动不便和瘫痪的症状，在8-9天时达到顶峰。对各组后肢瘫痪评分如图7所示，第6天时，各治疗组瘫痪病变显著低于病毒对照组。第7天时，夏枯草提取物的高、中、低各剂量组的评分仍均显著低于病毒对照组，分别降低了81％，75％和75％，而ACV组的评分仅降低了25％。之后的时间点里，高、中剂量组的评分持续保持在60-75％的显著抑制，小剂量组保持在50％的明显抑制，但ACV组已完全失去抑制作用，并在第10天时出现豚鼠死亡，夏枯草提取物小剂量组在第13天时，也出现1只豚鼠死亡(导致其评分曲线在13-14天的突然下降)。因此，从对后肢瘫痪的抑制作用看，测试药物的各剂量组对I型疱疹导致的豚鼠后肢瘫痪具有显著的抑制作用，活性显著优于ACV组，但高、中剂量组的剂量相关性不明显。其中，高剂量组有1只豚鼠出现后肢轻度瘫痪后又得到恢复，中、低剂量组各有1只豚鼠后肢保持正常，未出现瘫痪症状，小剂量组有1只豚鼠死亡。
(3)豚鼠体重变化
依照[0061]述方法建立豚鼠背部皮肤感染HSV-1病毒模型，各组豚鼠在HSV-1病毒感染后24小时开始给药，记录各组豚鼠给药14天内的体重变化，结果如图8所示：0至3天内6组豚鼠体重均呈上升趋势；第四天开始，HSV-1病毒对照组及夏枯草提取物组的体重缓慢下降，第7天时，降至最低，之后缓慢回升。可见，体重的下降与病毒的发病进程基本一致。ACV组的体重下降，有2天的延迟，但之后的体重下降更加迅速，应与其严重的后肢瘫痪密切相关。夏枯草提取物各剂量组体重，在4至8天均略高于病毒对照组，这与药物对病毒引起的皮肤和后肢病变的抑制作用有关，但没有明显的剂量相关性。第9至11天，夏枯草提取物各剂量组体重与病毒对照组基本一致。第12天开始，各实验组的体重均有一定程度升高，表明豚鼠开始逐渐适应后肢瘫痪的状态，另外与夏枯草提取物组豚鼠的后肢瘫痪评分有所降低也有关。因此，豚鼠体重的变化与病程呈正相关，夏枯草提取物各剂量组对体重均有一定改善作用，但离散度较大，无明显剂量相关性。
实施例7
夏枯草提取物(PVE30)体内抗HSV-2活性研究
方法：(1)将40只小鼠随机分为5组，每组8只，即正常对照组、病毒对照组、夏枯草提取物低剂量组(50mg/mL)、夏枯草提取物高剂量组(75mg/mL)、ACV阳性药对照组(100mg/mL)。
(2)先用医用酒精消毒各组小鼠外阴部，再用粗糙细玻棒反复摩擦小鼠阴道粘膜；用医用七星针在小鼠外阴表面叩击数次，使皮肤渗出小血珠，再用灌胃针头伸入小鼠阴道3cm内，注射HSV-2病毒液100μL(1×107PFU/mL)，使HSV-2渗入外阴粘膜组织。样品干预组每天给予夏枯草提取物水溶液30μL，阳性药对照组给予等体积ACV水溶液，连续干预7天。记录建立小鼠阴道感染HSV-2造模给药期间小鼠体重变化，小鼠存活率、平均生存天数及病毒感染率，按照表9的评分标准，对感染小鼠的皮肤损伤及病变进行评分汇总。
表9感染小鼠皮肤损伤及病变评分标准
(3)连续药物干预7天，再观察7天后，处死实验动物。每日记录小鼠的体重变化，对小鼠的存活率、感染率和病变评分进行数据分析。
结果：夏枯草提取物(PVE30)具有良好的体内抗HSV-2活性
(1)小鼠体重变化
依照上述方法，建立小鼠阴道感染HSV-2病毒模型，药物连续干预7天，停药后观察7天，记录各组小鼠体重变化，结果如表10与表11所示：夏枯草提取物高剂量组小鼠的体重接近于ACV阳性药对照组，停药后继续观察7天，夏枯草提取物高剂量组小鼠体重接近于正常对照组，较重于其它组小鼠。
表10连续干预7天(给药前-第7天)小鼠每天体重变化(g/只)
表11停药后7天(第8-14天)小鼠每天体重变化(g/只)
(2)小鼠存活率及感染率
依照上述方法，建立小鼠阴道感染HSV-2模型，对每组小鼠连续7天外涂给药干预，停药后再观察7天，分析记录小鼠的存活率、感染率，结果如下：与病毒对照组相比，夏枯草提取物高剂量组的发病时间和死亡时间推迟了1-2天，夏枯草提取物干预组小鼠的存活率高于病毒对照组，高剂量组小鼠平均寿命延长约1天(见表12)。动物平均生存天数及病毒感染率降低了25％(见表13)。
表12小鼠存活率(％)
表13小鼠平均生存天数(天)及病毒感染率(％)
(3)小鼠病变评分
依照上述方法，建立小鼠阴道感染HSV-2病毒模型，各组小鼠夏枯草提取物外涂给药连续干预7天，从接种HSV-2/G病毒的第4天起，对小鼠的病变情况进行评分，结果见表14及表图9：病毒对照组的小鼠出现阴道口红肿、阴道周边红肿、红肿扩散至鼠尾及两侧、病灶大面积溃烂和下肢瘫痪等现象，夏枯草提取物干预组小鼠病变总评分显著低于病毒对照组。
表14小鼠病变评分汇总
实施例8
一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)的化学表征
1.一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)理化性质测定：
方法：一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)的色泽观察及溶解性测定：
结果：经观察和检测分析，一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)呈棕色粉末状(见图10)，易溶于水，不溶于有机溶剂，如高浓度的甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇等。
2.一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)的鉴别反应
方法：对以上各部分进行Molish反应(糖类)、碘液反应(淀粉)、考马斯亮蓝反应(蛋白质)、茚三酮反应(游离氨基酸)、FeCl3反应(鞣质)、醋酐浓硫酸反应(皂苷)、Feigl反应(醌类)、盐酸镁粉反应(黄酮)、碘化钾沉淀反应(生物碱)等。
结果：一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)中的各大类成分鉴别反应结果见表15，Molish反应、三氯化铁反应、考马斯亮蓝染色均呈阳性，表明PVE30中含有糖类、多酚及鞣质类、蛋白质类成分；醋酐浓硫酸反应、茚三酮反应、Feigl反应、碘化钾沉淀反应、盐酸美分反应均呈阴性，表明夏枯草各分级醇沉部分中不含皂苷类、游离氨基酸类、醌类、生物碱及黄酮类成分。
表15一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)的化学成分鉴别
3.一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)的分子量范围
方法：①标准溶液的配置：精密称取普鲁兰(Pullulan)对照品D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8(分子量依次为6100、9600、21100、47100、107000、194000、337000、642000)各1mg，加入0.22μm水相滤膜过滤后的0.02mol/L氯化钠水溶液1mL，配成1mg/mL的标准品溶液，充分溶解后10000rpm离心10min，吸取各离心后的标准溶液上清液，排序进样。
②供试品溶液配置：精密称取供试品2mg，精密量取1mL超纯水溶解，加入0.22μm水相滤膜过滤后的0.02mol/L氯化钠水溶液1mL，配成1mg/mL的标准品溶液，充分溶解后10000rpm离心10min，吸取离心后的供试品上清液转入液相样品瓶，排序进样。
③色谱条件：Sugar KS-802、Sugar KS-804色谱柱串联；0.02mol/L氯化钠水溶液为流动相(0.22μm水相滤膜过滤)；流速0.8mL/min；进样体积20μL；分析时间25min；检测器为示差检测器(RID)；检测池温度40±0.1℃。
④标准曲线的绘制：取Pullulan D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8标准溶液，经0.45μm孔滤器过滤后,采用以上所选色谱条件，使用Agilent公司GPC软件采集数据并绘制标准曲线，以标准分子量为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间为横坐标进行线性方程拟合。
⑤待测样品分子量的测定：按照上述色谱条件，使用Agilent公司GPC软件测定出样品的分子量分布范围。
结果：HPGPC分子量范围测定得出，PVE30的Mw为42.54kDa，Mn为23.71kDa，HPGPC色谱见图11。
4.一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)的总糖，蛋白质，多酚含量测定
方法：
①总糖含量测定
对照品溶液的配制：葡萄糖标准品12.50mg，精密称定，置25mL量瓶中，加水适量溶解，稀释至刻度，摇匀；
供试品溶液配制：精密称取一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)冻干粉末12.5mg至25mL容量瓶中(即浓度为0.5mg/mL)，加纯水定容至刻度线，超声至完全溶解，摇匀。
标准曲线的绘制：精密量取对照品标准溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL、2.0mL分别置具塞试管中，分别加水补至2.0mL，各精密加入5％苯酚溶液1mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5mL，摇匀，放置30分钟，冷却至室温，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在490nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
总糖含量测定：精密量取供试品溶液1mL，置10mL具塞试管中，加水补至2.0mL，照标准曲线的制备项下的方法，自“精密加入5％苯酚溶液1mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含总糖的重量，按照公式2计算，即得。
②蛋白质含量测定
对照品溶液的配制：精密称取牛血清蛋白对照品10.12mg,置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成浓度为0.101mg/mL的对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密称取一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)冻干粉末12.5mg至25mL容量瓶中(即浓度为0.5mg/mL)，加纯水定容至刻度线，超声至完全溶解，摇匀。
标准曲线的绘制：取浓度为0.101mg/mL的牛血清蛋白照品溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、1.0mL于具塞试管中，加水补足至1.0mL，精密加入考马斯亮蓝试液5mL，摇匀，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(2020版《中国药典》四部通则0401)，在595nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
蛋白质含量测定：精密量取供试品溶液1mL，置10mL具塞试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“精密加入考马斯亮蓝试液5mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含蛋白质的重量，按照公式3计算，即得。
③多酚含量测定
对照品溶液的配制：精密称取没食子酸对照品52.00mg,置500mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成浓度为0.104mg/mL的对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密称取一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)冻干粉末12.5mg至25mL容量瓶中(即浓度为0.5mg/mL，加纯水定容至刻度线，超声至完全溶解，摇匀。
标准曲线的绘制：精密量取浓度为0.052mg/mL的没食子酸对照品溶液0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL分别置25mL棕色容量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1mL，加水10mL，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，依照紫外-可见分光光度法(2020版《中国药典》四部通则0401)，在760nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
多酚含量测定：精密量取一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)供试液2mL，置25mL棕色容量瓶中，自“加入磷钼钨酸试液1mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含多酚的重量，按照公式4计算，即得。
结果：见表16。
表16一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)的含量测定
5.一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)的单糖组成
方法：①前处理方法：
完全酸水解：取适量一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)冻干粉于水解管中，加入4mol/L三氟乙酸水溶液1mL，将其静置于120℃恒温烘箱中，水解2小时后，取出，氮气吹干；
衍生化反应：经完全酸水解、氮气吹干处理后的一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)样品中加入0.5mol/L PMP-甲醇溶液1mL以及0.3mol/LNaOH水溶液0.5mL，静置于70℃恒温水浴60分钟，取出冷却，加入0.3mol/LHCl水溶液0.5mL后，再加入0.5mL氯仿，振摇均匀后，放置20分钟，使溶液分层，弃去下层氯仿，再次加入氯仿如前法反复萃取三次后，取上层水溶液，定容至2mL后，依照样品浓度适当稀释，过0.22μm滤膜，转移至进样瓶，上机检测。
②仪器方法：
色谱柱：SHISEIDO C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A(0.1mol/L磷酸水溶液，pH 6.8)：B(乙腈)＝82：18
流速：1.0mL/min；柱温：25℃；
进样量：10μL；
波长：245nm。
结果：一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)经酸水解及衍生化后，经HPLC测定单糖组成及摩尔百分比，其中单糖的HPLC色谱见图12，根据各单糖标准品计算PVE30中的各单糖含量由大到小分别为半乳糖醛酸(GalUA)208.10mg/g、半乳糖(Gal)32.79mg/g、葡萄糖(Glc)23.56mg/g、阿拉伯糖(Ara)15.80mg/g、鼠李糖(Rha)15.46mg/g、木糖(Xyl)15.32mg/g、甘露糖(Man)14.32mg/g、核糖(Rib)8.46mg/g、葡萄糖醛酸(GlcUA)3.70mg/g、岩藻糖(Fuc)2.87mg/g；计算各单糖摩尔百分比(见表17)。
表17一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)的单糖组成的摩尔百分比(％)
一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)的氨基酸组成
方法：对一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)进行酸水解等前处理，采用氨基酸自动测试仪分析其中组成蛋白质的氨基酸类型及含量。
①前处理方法：
称取适量一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)冻干粉，在水解管中加入6mol/L盐酸水溶液10-15mL，将水解管放入干冰冷冻剂中静置3-5min，充氮气保护，拧紧瓶盖，将水解管置于110±1℃的恒温电热鼓风箱中，水解22小时后取出，静置冷却至室温。将水解管打开，其中的水解液过滤，转移至50mL容量瓶中，继而用纯化水少量多次的冲洗水解管，水洗液同样转移至上述50mL容量瓶内，加纯化水定容至刻度线，振摇使混合均匀。准确吸取50mL容量瓶内的滤液1.0mL，转移至15mL试管内，于40℃减压使其干燥后，加入pH 2.2的柠檬酸钠缓冲溶液1.0mL使其复溶，充分振摇混合均匀后，过0.22μm滤膜，上机测定。
②仪器方法：
色谱柱：磺酸型阳离子树脂；
波长：570nm和440nm；
进样量：500μL；
反应温度：135±5℃
结果：一种具有抗HSV活性的夏枯草提取物(PVE30)的氨基酸组成检测，表明夏枯草醇沉样品PVE30含有蛋白质，且组成蛋白质的主要氨基酸为谷氨酸，天冬氨酸，精氨酸，甘氨酸，丝氨酸(见表18，图13)。
表18 PVE30的氨基酸组成(mg/g)
实施例9
《夏枯草水溶性多糖乙醇分级纯化及其理化性质研究》(2016年4月1日33,No.20,2012.张霞,聂少平*,李昌,谢明勇)中制备的水溶性多糖与PVE30的单糖组成的对比：
按照《夏枯草水溶性多糖乙醇分级纯化及其理化性质研究》中所述：六个组分都含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中木糖和阿拉伯糖含量最高，甘露糖最低，不含核糖和岩藻糖，但各组分中单糖具体摩尔组成比例不同。其中30％醇沉部分PVLP-2的单糖组成量比为：鼠李糖：阿拉伯糖：木糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝1.20：2.57：3.63：1.00：0.94：1.83。
而本发明中提出的PVE30含有半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、核糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖，其中半乳糖醛酸、半乳糖含量最高，岩藻糖最低。PVE30经酸水解及衍生化后，经HPLC测定单糖组成及摩尔百分比，其中单糖的HPLC色谱见图16，根据各单糖标准品计算PVE30中的各单糖含量由大到小分别为半乳糖醛酸(GalUA)208.10mg/g、半乳糖(Gal)32.79mg/g、葡萄糖(Glc)23.56mg/g、阿拉伯糖(Ara)15.80mg/g、鼠李糖(Rha)15.46mg/g、木糖(Xyl)15.32mg/g、甘露糖(Man)14.32mg/g、核糖(Rib)8.46mg/g、葡萄糖醛酸(GlcUA)3.70mg/g、岩藻糖(Fuc)2.87mg/g；各单糖摩尔百分比，见表17。
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