阅读说明：本技术 获取含油菜黑胫病菌突变erg11基因的重组质粒的引物组合及方法 (Primer combination and method for obtaining recombinant plasmid containing phytophthora parasitica mutant ERG11 gene ) 是由 杨永青 李子钦 宋培玲 郝丽芬 燕孟娇 皇甫海燕 张福金 张欣昕 皇甫九茹 赵丽丽 于 2020-07-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供了获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合及方法,属于基因工程技术领域,所述引物组合包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述第三引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。采用本发明提供的引物组合能够获得含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒。(The invention provides a primer combination and a method for obtaining recombinant plasmids containing phytophthora parasitica mutant ERG11 gene, belonging to the technical field of genetic engineering, wherein the primer combination comprises a first primer pair, a second primer pair and a third primer pair; the nucleotide sequence of the upstream primer of the first primer pair is shown as SEQ ID No.1, and the nucleotide sequence of the downstream primer is shown as SEQ ID No. 2; the nucleotide sequence of the upstream primer of the second primer pair is shown as SEQ ID No.3, and the nucleotide sequence of the downstream primer is shown as SEQ ID No. 4; the nucleotide sequence of the upstream primer of the third primer pair is shown as SEQ ID No.5, and the nucleotide sequence of the downstream primer is shown as SEQ ID No. 6. The primer combination provided by the invention can be used for obtaining the recombinant plasmid containing the phytophthora parasitica mutant ERG11 gene.)

获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合 及方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合及方法。

背景技术

靶标基因ERG11发生碱基突变是植物病原菌对DMI杀菌剂产生抗药性的一种重要途径，对于靶标基因突变的研究中，除了筛选田间天然存在的突变株之外，紫外诱导突变是较为常用的方法，通过紫外诱导产生随机碱基突变，并结合室内杀菌剂浓度梯度的驯化，最终获得室内诱导抗药性突变株，这类研究已在禾谷镰刀菌、水稻稻曲病菌、核盘菌、小麦纹枯病菌等植物病原菌中报道。虽然紫外可诱导病原菌产生新的基因突变，但其基因突变频率相对较低，筛选抗药性突变株的周期亦相对较长，且大多数突变株的环境适合度可能下降。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合及方法，采用本发明提供的引物组合能够定点获得含碱基突变点的油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合，所述引物组合包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；

所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述第三引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明还提供了一种含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的获取方法，包括以下步骤：

1)提取油菜黑胫病菌的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，用上述技术方案所述的引物组合中的第一引物对、第二引物对和第三引物对分别进行扩增，得到1183bp、242bp和263bp的基因片段；

2)将所述步骤1)得到的1183bp、242bp和263bp的基因片段经一次Gibson反应克隆至pLAU2载体中，得到重组质粒。

优选的，所述步骤1)扩增的体系为：95℃3min；95℃30s，58℃30s，72℃60s，35个循环；72℃5min；4℃保存。

优选的，所述扩增的程序每25μL包括：基因组DNA 1μL、

High-Fidelity 2×Master Mix 12.5μL、10μM上下游引物各1μL和ddH₂O9.5μL。

本发明提供了获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合，所述引物组合包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述第三引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。采用本发明提供的引物组合能够获得含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒。

附图说明

图1为突变ERG11基因构建示意图及引物位置(UMY-1、PM001、PM002、PM003、PM004、UMY-2为引物；

图2为利用三对引物分别扩增目的基因的三段片段，长度分别为1183bp(图中1、2)、242bp(图中3、4)和263bp(图中5、6)；

图3为重组质粒结构示意图；

图4为重组质粒用限制性内切酶Pst I酶切验证结果电泳图，1-10为随机选取的重组质粒，均得到预期的酶切片段，长度为8679bp、2941bp、429bp，ck为重组前的空载体pLAU2为对照；

图5为重组质粒测序结果(以PM5号为例)，图A所示重组质粒序列中ATC突变为GTC，图B中所示重组质粒序列中删除了TACGGA，且TGG突变为GGG；

具体实施方式

本发明提供了获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合，所述引物组合包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述第三引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

在本发明中，所述油菜黑胫病菌优选为Leptosphaeria maculans。

在本发明中，所述第一引物对的上游引物(以下简称UMY-1-F)的核苷酸序列如SEQID No.1所示，具体如下：

GAAACCTAATCAATCAACATGGCTGTTCTTGCTACC；

下游引物(以下简称PM002-R)的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，具体如下：

GCATGATCGAGTGGACCGGGGCGTGG。

在本发明中，所述第二引物对的上游引物(以下简称PM001-F)的核苷酸序列如SEQID No.3所示，具体如下：

CCACGCCCCGGTCCACTCGATCATGC；

下游引物(以下简称PM004-R)的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：

CAACGCCCCCATCAATCTTCTCGTCGTCC。

在本发明中，所述第三引物对的上游引物(以下简称PM003-F)的核苷酸序列如SEQID No.5所示，具体如下：

AGAAGATTGATGGGGGCGTTGTGTCCAAGG；

下游引物(以下简称UMY-2-R)的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，具体如下：

gctcatagtcacatccctcactcgaccttctccctcctc。

在本发明中，所述引物组合的引物的设计思路如下：根据ERG11基因中拟引入碱基突变点的位置，在其左右两端延伸10-20bp的范围内，设计用于引入点突变的引物，引物末端以G或C结尾，GC含量大于40％。引物PM001和PM002引入ATC至GTC碱基突变，导致异亮氨酸(I)变为缬氨酸(V)；引物PM003和PM004引入络氨酸(Y)、甘氨酸(G)缺失(TACGGA缺失)和色氨酸(W)突变为甘氨酸(G)(TGG突变为GGG)；其中引物PM001-F和PM002-R是碱基互补序列，长度均为26bp；PM003-F和PM004-R包含长度为21bp的碱基互补序列，碱基互补序列的作用是在扩增突变点碱基的同时，扩增同源片段，用于下一步目的片段重组；引物UMY-1-F和UMY-2-R分别位于目的基因的5’和3’端，并且包括可扩增与载体黏性末端两侧的同源片段，用于扩增片段与载体连接，加粗序列可根据实际使用的表达载体作相应修改。

本发明还提供了一种含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的获取方法，包括以下步骤：1)提取油菜黑胫病菌的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物组合中的第一引物对、第二引物对和第三引物对分别进行扩增，得到1183bp、242bp和263bp的基因片段；2)将所述步骤1)得到的1183bp、242bp和263bp的基因片段经一次Gibson反应克隆至pLAU2载体中，得到重组质粒。

本发明对提取油菜黑胫病菌的基因组DNA的方法没有特殊限定，采用常规提取方法即可，如CTAB法。

在本发明中，所述扩增的程序优选包括：95℃3min；95℃30s，58℃30s，72℃60s，35个循环；72℃5min；4℃保存。在本发明中，所述扩增体系优选为25μL：基因组DNA 1μL、High-Fidelity 2×Master Mix 12.5μL、10μM上下游引物各1μL和ddH₂O 9.5μL。

在本发明中，所述pLAU2载体属基因表达载体，用于后续试验中农杆菌介导的遗传转化，在农杆菌T-DNA的作用下，将含有突变位点的ERG11基因***油菜黑胫病菌株的基因组中，获得含有突变ERG11基因的黑胫病菌转化株。在本发明中，所述载体pLAU2的构建方法见参考文献：Idnurm A.,UrquhartA.S.,Vummadi D.R.,etc.Spontaneous and CRISPR/Cas9-induced mutation of the osmosensor histidine kinase of the canolapathogen Leptosphaeria maculans[J].Fungal Biol Biotechnol,2017,4:1-12.

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.供试菌株及试剂

野生型黑胫病菌基因组DNA、

High-Fidelity 2×MasterMix(NEB)、质粒pLAU2(含有L.maculans菌株的Actin启动子和trp C终止子，构建方法参照上述文献)，限制性内切酶Bg1Pst(NEB)、Gibson重组试剂盒(NEBuilder HiFi DNAAssembly Cloning Kit，E5520S)、胶纯化试剂盒(28704)、QIAGEN质粒提取试剂盒(

Spin Miniprep Kit)

2.步骤

1)以野生型黑胫病菌基因组DNA为模板，采用高保真DNA聚合酶Q5，引物根据引入突变点的位置进行设计；

2)PCR扩增目的基因片段

采用25μL PCR反应体系:基因组DNA 1.0μL，High-Fidelity 2X Master Mix12.5μL，10μM上/下游引物各1.0μL，ddH₂O 9.5μL；PCR扩增程序为：95℃，3min；(95℃，30s；58℃，30s；72℃，60s)×35个循环；72℃，5min；4℃forever；分别以UMY-1/PM002、PM001/PM004、PM003/UMY-2三对引物分别扩增基因的1183bp、242bp、263bp的三段基因片段，如图2所示；

3)目的基因与载体连接

将扩增片段进行胶纯化，步骤参照胶纯化试剂盒

28704的使用说明，产物用于与载体连接。将Bg1酶切后的载体pLAU2和纯化后的目的基因片段(含两两相互重叠的18-20bp的同源片段)，进行Gibson重组。具体步骤如下：

离心收集5)中的菌体，用QIAGEN质粒提取试剂盒提取质粒，具体操作步骤参照使用说明：

重组试剂置于冰上解冻后，将酶切后的pLAU21μL、三段扩增片段各1μL、6μL ddH₂O充分混匀，从上述10μL混合液中取5μL与5μL DNA AssemblyMasterMix混匀，置于50℃恒温加热器中反应45min、再置于冰上，连接产物即为重组质粒，重组质粒结构示意图如图3所示。

4)热激法转入大肠杆菌感受态细胞

50μL大肠杆菌感受态细胞于冰上解冻后，加入2μL重组质粒，用200μL移液器缓慢吹吸4-5次，冰浴30min，42℃热击30s，立即冰浴2min，再加入950μL SOC培养液，37℃、250r/min恢复培养1h，取500μL培养液涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板，倒置于37℃培养箱中过夜培养。

5)阳性转化子的筛选

挑取4)中在含卡那霉素LB选择性培养基上生长的10个单菌落，接种于在2mL含卡那霉素的TB液体培养液中，37℃，150r/min振荡过夜培养，富集培养大肠杆菌转化子。

6)重组质粒提取

7)酶切与测序双重验证

获得重组质粒后，通过分析重组质粒的基因序列，选择限制性内切酶Pst I对其进行酶切验证，选取的10个转化子的重组质粒均得到了预期的酶切片段8679bp、2941bp、429bp，如图4所示；为了进一步确认重组质粒序列的准确性，在上述重组子中选择#5(PM5)和#9(PM9)重组质粒进行测序，进一步验证重组质粒的完整性和准确性，测序结果如图5，以PM5号质粒测序结果为例，图5中的A所示重组质粒序列中ATC突变为GTC，图5中的B中所示重组质粒序列中删除了TACGGA，且TGG突变为GGG，获得了预期的基因突变体。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 内蒙古自治区农牧业科学院

<120> 获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合及方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaacctaat caatcaacat ggctgttctt gctacc 36

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcatgatcga gtggaccggg gcgtgg 26

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccacgccccg gtccactcga tcatgc 26

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caacgccccc atcaatcttc tcgtcgtcc 29

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agaagattga tgggggcgtt gtgtccaagg 30

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctcatagtc acatccctca ctcgaccttc tccctcctc 39