稳定化的甜菊醇糖苷组合物及其用途
阅读说明：本技术 稳定化的甜菊醇糖苷组合物及其用途 (Stabilized steviol glycoside compositions and uses thereof ) 是由 丹·S·加斯帕德 亚当·T·察尔特 于 2018-10-05 设计创作，主要内容包括：已经令人惊讶地发现,甜菊醇糖苷稳定化合物,如本文所述的增溶剂的存在显著增加甜菊醇糖苷在大多数条件下的稳定性,包括在高酸性条件下(例如,在低于2的pH下,如在使用中,在投用糖浆中SG可能暴露于的条件下)和/或在升高的温度下(例如,在超过25℃的温度下,如在40℃下)。(It has been surprisingly found that the presence of a steviol glycoside stabilizing compound, such as a solubilizing agent described herein, significantly increases the stability of steviol glycosides under most conditions, including under highly acidic conditions (e.g., at a pH below 2, such as in use, under conditions to which SG may be exposed in a serving syrup) and/or at elevated temperatures (e.g., at temperatures in excess of 25 ℃, such as at 40 ℃).)
相关申请的交叉参考
本申请要求2017年10月6日提交并且标题为“Steviol Glycoside SolubilityEnhancers”的美国临时申请序列号62/569,279和2018年5月25日提交并且标题为“Methodsfor Making Yerba Mate Extract Composition”的美国临时申请序列号62/676,722的权益，这两个申请以引用方式特此并入，如同在本文中完整阐述一样。
背景技术
甜菊醇糖苷(SG)目前正在被研究作为甜味剂用于食品、饮料、药品和口腔卫生/化妆品，包括饮料如碳酸软饮料。最近发现绿原酸和洋蓟酸异构体作为SG的增溶剂(SE)正在开启先前无法实现的产品线，如浓缩投用(throw)糖浆和汽水用饮料。虽然甜菊醇糖苷可以提供一种无热量的选择来使此类产品变甜，但用甜菊醇糖苷制备此类产品可能存在挑战。尽管甜菊醇糖苷组合物在中性pH下可以稳定，但在一些情况下，它们在低pH和/或升高的温度下较长的储存时间下具有有限的化学稳定性，尤其是在较高浓度下。例如，饮料浓缩物如汽水用糖浆或投用糖浆本身具有低的pH，并且可能需要长时间储存，有时需要在升高的温度下储存。
发明内容
本公开除其他之外提供了使用甜菊醇糖苷稳定化合物来增强SG的化学稳定性，使得SG可以用于制备具有增强的化学稳定性的组合物，尤其是在较高的SG浓度和较长的储存时间下。甜菊醇糖苷稳定化合物还可以增强SG在酸性条件和/或升高的温度下的化学稳定性。本公开还描述了甜菊醇糖苷稳定化合物本身增强的化学稳定性，其在SG的存在下较少经受酸性水解和/或氧化。这种效应似乎与浓度有关，其中更高的浓度产生更大的稳定性。这一发现开启了在水分增强剂、咖啡糖浆和液体甜叶菊产品中使用SG的可能性，其中SG的浓度越高，希望的保质期越长，和/或pH可以是酸性的。
虽然不希望受任何理论的约束，但假设甜菊醇糖苷稳定化合物增加溶液中SG的化学稳定性的机制，部分是通过减少或改变水分子与SG分子之间的相互作用来实现的。还假设与强酸的相互作用也减少了，从而有效地保护SG免受酸性水解。
附图说明
附图通过示例而非限制的方式总体上示出了本文讨论的各种实施方案。
图1是制备包含甜菊醇糖苷稳定化合物如咖啡酸、单咖啡酰奎尼酸和二咖啡酰奎尼酸及其盐的组合物的方法的实例的流程图。
图2是制备包含甜菊醇糖苷稳定化合物如咖啡酸、单咖啡酰奎尼酸和二咖啡酰奎尼酸及其盐的组合物的方法的另一个实例的流程图。
图3是制备包含甜菊醇糖苷稳定化合物如咖啡酸、单咖啡酰奎尼酸和二咖啡酰奎尼酸及其盐的组合物的方法的另一个实例的流程图。
图4是制备包含甜菊醇糖苷稳定化合物如咖啡酸、单咖啡酰奎尼酸和二咖啡酰奎尼酸及其盐的组合物的方法的另一个实例的流程图。
参考字符在本说明书和附图中的重复使用旨在表示本公开内容的相同或类似的特征或元素，即使数字从一个图到另一个图增加了100(例如，图1中的干燥操作120分别与图2-4中的干燥操作220、320和420类似或相同)。应了解，本领域的技术人员可以设计出许多其他修改和实施例，它们都落在本公开内容的原理的范围和精神内。
具体实施方式
现在将详细地参考所公开主题的某些实施方案，其实例在附图中部分地示出。虽然将结合枚举的权利要求书对所公开主题进行描述，但应理解，这些例示的主题并不旨在将权利要求书限制于所公开主题。
本公开内容总体上涉及包含甜菊醇糖苷(SG)和其量有效减少SG降解的甜菊醇糖苷稳定化合物的组合物。包含SG和甜菊醇糖苷稳定化合物的组合物可以任何合适的方式配制，包括作为含水组合物。
已经令人惊讶地发现，甜菊醇糖苷稳定化合物的存在显著增加了SG在大多数条件下，包括在更高浓度的SG和更长的储存时间下的稳定性。此外，甜菊醇糖苷稳定化合物的存在显著增加了SG在酸性条件和/或升高的温度下的稳定性。例如，在存在本文所述的甜菊醇糖苷稳定化合物的情况下，不仅可以获得高达35wt.％(例如，约1wt.％至约35wt.％，其中5wt.％是液体甜叶菊应用的合适浓度)的SG浓度，而且在大于72天的时间内，或者甚至在一年或更长的时间内，SG将在酸性pH下是化学稳定的。总之，SG/甜菊醇糖苷稳定化合物组合物在数周、数月或甚至数年内，甚至在酸性pH和/或升高的温度下是化学稳定的。
术语“化学稳定性”是指SG的化学降解(包括甜菊醇核心上双键的水解和异构化)减少。例如，化学稳定的莱鲍迪苷M(Reb M)抵抗降解为水解产物，如莱鲍迪苷A(Reb A)、莱鲍迪苷B(Reb B)、异莱鲍迪苷M(异-Reb M)、异莱鲍迪苷A(异-Reb A)和异莱鲍迪苷B(异-Reb B)。化学稳定性可以通过已知的方法(如通过UHPLC分析)测量。例如，如本文的实施例中所述，可以直接注射包含Reb M的组合物，以通过UHPLC-UV进行分析。可以利用在水中的三氟乙酸和乙腈，在基于C18的反相色谱柱上在升高的温度下在梯度条件下进行色谱分析。可以利用设置为210nm的UV检测器检测SG。使用Reb A标准作为参考溶液，可以应用线性校准曲线。
在一些方面，有效减少SG降解的甜菊醇糖苷稳定化合物的量是在更高SG浓度和/或更长储存时间内使SG化学稳定的量。例如，SG和/或甜菊醇糖苷稳定化合物的量可以是至少1wt.％、至少3wt.％、至少5wt.％、至少10wt.％、至少15wt.％、至少20wt.％、至少30wt.％；约1wt.％至约35wt.％、约5wt.％至约15wt.％、约1wt.％约5wt.％或约5wt.％至约20wt.％、约。并且在这些规定的范围内，SG和甜菊醇糖苷稳定化合物可以在数天、数周、数月或数年内是化学稳定的。
在一些方面，可以通过加速化学稳定性测定来确定有效减少SG降解的甜菊醇糖苷稳定化合物的量。例如，“有效减少甜菊醇糖苷降解的甜菊醇糖苷稳定化合物的量”是使得当稳定化的甜菊醇糖苷组合物经受在40℃下于5％磷酸溶液中储存7天时，相对于初始甜菊醇糖苷浓度保留至少约10％(例如，至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％；或约10％至约100％、约20％至约80％、约30％至约95％、约40％至约80％、约60％至约90％或约70％至约99％或更多)的量。在一些情况下，与没有甜菊醇糖苷稳定化合物时相比，统计上甜菊醇糖苷降解较少。
包含SG和甜菊醇糖苷稳定化合物的组合物可以具有小于约5(例如，小于约4、小于约3、小于约2.5、小于约2、小于约1.7、小于约1.5、小于约1、远小于约1；约0.1至约4、约1至约4、约0.5至约2或约1至约3)的pH。
包含SG和甜菊醇糖苷稳定化合物的组合物可在室温、低于室温(例如4℃)或高于室温(例如40℃)下储存，而甜菊醇糖苷没有任何实质性降解。
包含SG和甜菊醇糖苷稳定化合物的组合物可以包含任何合适的甜菊醇糖苷，如甜菊苷、Reb A、Reb C、杜尔可苷A、Reb M、Reb B、Reb D和Reb E及其盐(在化合物可以形成盐的情况下，如在Reb B、甜菊醇双糖苷和甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)的情况下)。甜菊醇糖苷可以是Reb M、Reb A或者一种或多种前述甜菊醇糖苷的混合物。在一个方面，甜菊醇糖苷包含一种或多种选自由以下组成的列表的甜菊醇糖苷：Reb A、Reb B、Reb C、Reb D、Reb E、Reb F、Reb M、Reb N、Reb O、甜茶素、杜尔可苷A、Reb I、Reb Q、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、13-SMG、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)，以及添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多糖的甜菊醇糖苷，如葡萄糖、鼠李糖或木糖作为三个实例。
包含SG和甜菊醇糖苷稳定化合物的组合物可以包含为任何合适浓度的任何合适的甜菊醇糖苷。例如，包含SG和甜菊醇糖苷稳定化合物的组合物可以包含任何合适量的甜菊醇糖苷，如至少约0.03wt.％(例如，至少约0.1wt.％、至少约0.5wt.％、至少约0.6wt.％、至少约1wt.％、至少约1.5wt.％、至少约2.5wt.％、至少3wt.％、至少约5wt.％、至少约6wt.％、至少约10wt.％、至少约15wt.％、至少约20wt.％、至少约25wt.％、至少约30wt.％、至少约35wt.％、或高达约40wt.％；约0.03wt.％至约5wt.％、约0.1wt.％至约10wt.％、约1wt.％至约4wt.％、约0.1wt.％至约5wt.％、约或约1wt.％至约5wt.％)的甜菊醇糖苷。
包含SG和甜菊醇糖苷稳定化合物的组合物可以包含为任何合适浓度的任何合适的甜菊醇糖苷。包含SG和甜菊醇糖苷稳定化合物的组合物可以包含由消费者稀释供消费者使用的浓缩产品。例如，饮料浓缩物如投用糖浆被稀释六至七倍以供使用，并且调味水增强剂液体被稀释高达100倍。
例如，对于包含含有SG和甜菊醇糖苷稳定化合物的组合物的饮料浓缩物产品，可以包含约1,800ppm至约10,000ppm之间(例如，约2,000ppm至约5,000ppm、约2,000ppm至约8,000ppm、约3,000ppm至约5,000ppm或约2,500ppm至约7,500ppm)的甜菊醇糖苷。
在另一个实例中，这次是对于液态水增强剂产品，这些包含SG和甜菊醇糖苷稳定化合物的组合物可以包含约1.5wt.％至约3.5wt.％之间(例如，约2wt.％至约3wt.％、约1.5wt.％至约2wt.％或约2.5wt.％至约3.5wt.％)的甜菊醇糖苷。
在又另一个实例中，这次是对于液体甜味剂，这些包含SG和甜菊醇糖苷稳定化合物的组合物可以包含约1.0wt.％至约10wt.％之间(例如，约4wt.％至约10wt.％、约5wt.％至约10wt.％、约7wt.％至约9wt.％或约8wt.％至约10wt.％)的甜菊醇糖苷。
在一些方面，包含SG和甜菊醇糖苷稳定化合物的组合物可以包含任何合适的添加剂，包括缓冲剂、酸化剂(如柠檬酸)、抗菌剂(如苯甲酸和山梨酸(及其盐))、天然色素、天然香料、人工香料、人工色素和人工甜味剂。
甜菊醇糖苷稳定化合物的实例包括：
咖啡酸、咖啡酸的酯、咖啡酸和奎尼酸的酯、包含单一咖啡酸部分的咖啡酸和奎尼酸的酯(例如，绿原酸、隐绿原酸和新绿原酸；本文提供了各自的结构)、包含多于一个咖啡酸部分的咖啡酸和奎尼酸的酯(例如，1，3-二咖啡酰奎尼酸、1，4-二咖啡酰奎尼酸、1，5-二咖啡酰奎尼酸、3，4-二咖啡酰奎尼酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸和4，5-二咖啡酰奎尼酸；本文提供了各自的结构)；
阿魏酸、阿魏酸的酯、阿魏酸和奎尼酸的酯、包含单一阿魏酸部分的阿魏酸和奎尼酸的酯、包含多于一个阿魏酸部分的阿魏酸和奎尼酸的酯；
3-(3，4-二羟基苯基)乳酸、3-(3，4-二羟基苯基)乳酸衍生物、3-(3，4-二羟基苯基)乳酸的酯、3-(3，4-二羟基苯基)乳酸衍生物的酯，
奎尼酸、奎尼酸衍生物、奎尼酸的酯、奎尼酸衍生物的酯；
对香豆酸、对香豆酸的酯、对香豆酸和奎尼酸的酯、包含单一对香豆酸部分的对香豆酸和奎尼酸的酯、包含多于一个对香豆酸部分的对香豆酸和奎尼酸的酯；
芥子酸、芥子酸的酯、芥子酸和奎尼酸的酯、包含单一芥子酸部分的芥子酸和奎尼酸的酯、包含多于一个芥子酸部分的芥子酸和奎尼酸的酯；
酒石酸、酒石酸衍生物、酒石酸的酯、酒石酸衍生物的酯，以及
3-O-阿魏酰奎尼酸、4-O-阿魏酰奎尼酸、5-O-阿魏酰奎尼酸、3，4-二阿魏酰奎尼酸、3，5-二阿魏酰奎尼酸、4，5-二阿魏酰奎尼酸。
咖啡酸具有以下结构：
阿魏酸具有以下结构：
对香豆酸具有以下结构：
芥子酸具有以下结构：
奎尼酸具有以下结构：
3-(3，4-二羟基苯基)乳酸具有以下结构：
酒石酸具有以下结构：
并且可以是D和L形式。
本文所考虑的各种酸的酯的实例包括咖啡酸和奎尼酸的酯，包括单咖啡酰奎尼酸(例如，绿原酸、新绿原酸和隐环绿原酸)和二咖啡酰奎尼酸(例如，1，3-二咖啡酰奎尼酸、1，4-二咖啡酰奎尼酸、1，5-二咖啡酰奎尼酸、3，4-二咖啡酰奎尼酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸和4，5-二咖啡酰奎尼酸)及其盐：
其中4，5-二咖啡酰奎尼酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸和3，4-二咖啡酰奎尼酸在本文所考虑的组合物中是最普遍的，并且在甜叶菊、马黛茶、朝鲜蓟和绿咖啡中是最普遍的。
本文所考虑的各种酸的酯的实例包括咖啡酸和酒石酸的酯，其包括具有以下结构的菊苣酸：
其具有两个与酒石酸核心相连的咖啡酸分子和具有以下结构的咖啡酰酒石酸：
其中一个咖啡酸分子与酒石酸核心相连。
本文所考虑的各种酸的酯的实例包括咖啡酸和3-(3，4-二羟基苯基)乳酸的酯，其包括例如具有以下结构的迷迭香酸：
这些甜菊醇糖苷稳定化合物中的一些或全部可以从植物来源中分离，包括但不限于植物来源，如杜仲、金银花、本氏烟草、朝鲜蓟、刺菜蓟、甜叶菊、罗汉果、咖啡、咖啡豆、生咖啡豆、茶、白茶、黄茶、绿茶、乌龙茶、红茶(black tea)、博士茶(red tea)、后发酵茶、竹子、石南属、向日葵、蓝莓、蔓越莓、山桑子、醋栗、欧洲越橘、红豆越橘、越橘、美洲越橘、葡萄、菊苣、东方紫锥菊、紫锥菊、东方墙草(Eastem pellitory-of-the-wall)、直立墙草(Upright pellitory)、墙草、大白屈菜、血根树、欧洲稻槎菜(Nipplewort)、白屈菜、血根草、异株荨麻、刺荨麻、马铃薯、马铃薯叶、茄子、紫茄子、番茄、樱桃番茄、苦苹果、曼陀罗、甘薯、苹果、桃、油桃、樱桃、酸樱桃、野樱桃、杏、杏仁、李子、梅干、冬青、马黛茶、巴拉圭茶树、瓜尤萨茶(Guayusa)、代茶冬青、苦丁茶、瓜拉纳、可可、可可豆(Cocoa bean)、可可树、可可豆(Cacao bean)、可乐果(Kola nut)、可乐果树、柯拉果(Cola nut)、柯拉果树、鸵鸟蕨、东方鸵鸟蕨、羊齿蕨(Fiddlehead fern)、荚果蕨(Shuttlecock fern)、东方鸵鸟蕨、亚洲皇家蕨、紫萁、欧洲蕨、凤尾蕨、普通蕨、鹰蕨、东方蕨、丁香、桂皮、印度月桂叶、肉豆蔻、月桂叶、香叶、罗勒、九层塔、圣约瑟夫草、百里香、鼠尾草、庭院鼠尾草、普通鼠尾草、烹饪用鼠尾草、迷迭香、牛至、野生马郁兰、马郁兰、甜马郁兰、多节马郁兰、盆栽马郁兰、莳萝、茴香、八角茴香、小茴香、甘茴香、狭叶青蒿、龙蒿、艾蒿、甘草、欧亚甘草、黄豆、大豆、黄豆、Soya vean、小麦、普通小麦、稻、油菜籽、西兰花、花椰菜、卷心菜、白菜、羽衣甘蓝、芥蓝菜、抱子甘蓝、球茎甘蓝、林仙树皮(Winter′s bark)、接骨木花、巴西酒神菊(Assa-Peixe)、牛蒡、缬草和甘菊。
包含SG和甜菊醇糖苷稳定化合物的组合物可以包含任何合适量的甜菊醇糖苷稳定化合物，如至少约0.03wt.％(例如，至少约0.1wt.％、至少约0.5wt.％、至少约0.6wt.％、至少约1wt.％、至少约1.5wt.％、至少约2.5wt.％、至少3wt.％、至少约5wt.％、至少约6wt.％、至少约10wt.％、至少约15wt.％、至少约20wt.％、至少约25wt.％、至少约30wt.％、至少约35wt.％、或高达约40wt.％；约0.03wt.％至约5wt.％、约0.1wt.％至约10wt.％、约1wt.％至约4wt.％、约0.1wt.％至约5wt.％、约或约1wt.％至约5wt.％)的甜菊醇糖苷稳定化合物。
包含SG和甜菊醇糖苷稳定化合物的组合物可以包含1∶0.3至1∶3(例如，1∶1至1∶1.5；或1∶1至1∶2)重量比的甜菊醇糖苷与甜菊醇糖苷稳定化合物。
本文还考虑了任何前述酸的非对映异构体和结构异构体。并且由于前述酸可以被认为是弱酸，因此它们可以各自以它们的共轭酸形式、共轭碱形式(例如，以它们的盐形式)和混合共轭酸-共轭碱形式中的至少一种存在，其中一部分(例如，摩尔分数)的化合物以共轭酸形式存在，并且另一部分以共轭碱形式存在。每种酸的共轭酸形式与共轭碱形式的比例将取决于各种因素，包括每种化合物的pKa和组合物的pH。任何前述酸的盐的实例包括但不限于所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物的季铵盐、钠盐、钾盐、锂盐、镁盐和钙盐等。
一种制备包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物的方法的一个实例，其包括：
(a)使马黛茶生物质与含水组合物接触以获得初始提取物；
(b)从初始提取物中除去固体以获得第二初始提取物；
(c)用含水组合物调节第二初始提取物的体积，以获得经调节的第二初始提取物；
(d)在离子交换色谱固定相上色谱分离经调节的第二初始提取物；
(e)洗脱离子交换色谱固定相以获得包含溶剂的第一洗脱液；
(f)除去溶剂以形成浓缩物；以及
(g)进行将浓缩物脱色和脱盐中的至少一种，以获得滤液和渗余物中的至少一种。
一种制备包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物的方法的另一个实例，其包括：
(a)使马黛茶生物质与含水组合物接触以获得初始提取物；
(b)从初始提取物中除去固体以获得第二初始提取物；
(c)用含水组合物调节第二初始提取物的体积，以获得经调节的第二初始提取物；
(d)在离子交换色谱固定相上色谱分离经调节的初始提取物；
(e)洗脱离子交换固定相以获得包含溶剂的第一洗脱液；
(f)除去溶剂以形成浓缩物；
(g)进行将浓缩物脱色和脱盐中的至少一种，以获得滤液和渗余物中的至少一种；以及
(h)干燥滤液和渗余物中的至少一种，以获得包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物。
本文所述方法的步骤(a)包括使马黛茶生物质与含水组合物接触，以获得包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐(例如，季铵盐、钠盐、钾盐、锂盐、镁盐和钙盐)的初始提取物。
含水组合物可以包含水，并且不含有任何共溶剂，如有机溶剂。但除了水之外，含水组合物还可以包含共溶剂。合适的共溶剂包括有机溶剂，如(C1-C4)烷醇和(C1-C4)烷醇的混合物。“(C1-C4)烷醇”意指式(C1-C4)烷基-OH的醇，其中“烷基”是指具有1至4个碳原子的直链和支链烷基，如甲基、乙基、正丙基、正丁基、异丙基、异丁基、仲丁基和叔丁基，使得所得(C1-C4)烷醇是甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、异丙醇、异丁醇、仲丁醇和叔丁醇。有机溶剂(如(C1-C4)烷醇或(C1-C4)烷醇的混合物)的比例可以是任何合适的比例，使得含水组合物可以包含按体积计高达约30％、高达约40％、高达约50％或高达约60％、高达约70％、高达约80％、高达约90％或高达100％的有机溶剂，余量为水，除非含水组合物包含按体积计100％的有机溶剂；或按体积计约30％至约100％、约50％至约100％、约60％至约90％、约30％至约60％、约40％至约60％、约30％至约50％、约40％至约50％或约50％的有机溶剂，余量为水。
在一些情况下，含水组合物可以用任何合适的缓冲系统缓冲，包括但不限于磷酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、乳酸盐、乙酸盐等。缓冲剂可以是1-1000mM范围内的阴离子。可替代地，在有或没有共溶剂的情况下，用盐酸、硫酸、硝酸等酸化至pH 5-6的水可以用于含水组合物。可替代地，在有或没有共溶剂的情况下，用氢氧化物(如用氢氧化钠或氢氧化钾)碱化至pH 7-11的纯水可以用于含水组合物。在仍其他情况下，加入合适的非离子溶质可能是合适的，所述溶质可以有助于平衡含水组合物的渗透势。
如本文所用，术语“马黛茶生物质”通常是指马黛茶植物(如巴拉圭冬青)的任何和所有部分，包括马黛茶植物的叶、杆、茎、顶部、根等。马黛茶生物质可以是任何合适的形式，包括粉碎形式，所述粉碎形式由例如在与含水组合物接触之前和/或期间切碎马黛茶生物质产生。例如，可以在合适的容器中粉碎马黛茶生物质，并且可以将含水组合物加入到粉碎的马黛茶生物质中，从而“接触”马黛茶生物质。然后可以任选地在合适的容器中进一步粉碎所述粉碎的马黛茶生物质。或者可以将马黛茶生物质放入合适的容器中，向其中加入含水组合物，从而“接触”马黛茶生物质，并且可以粉碎所得组合物。
在接触之前和/或期间，可以搅拌、超声波处理或以其他方式搅动马黛茶生物质以除其他之外(除本文所述的酸之外)，使所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的提取最大化。
初始提取可以按原样进行到步骤(c)，或者可以在本文所述方法的步骤(b)中除去存在的松散固体和/或植物固体，如粉碎的马黛茶植物叶、杆、顶部、根等。当进行步骤(b)时，获得第二初始提取物。
松散固体可以通过任何合适的方法除去，包括离心、撇渣或过滤。例如，可以使用任何合适的过滤方法过滤初始提取物，包括通过任何合适的过滤器的重力过滤或真空过滤，只要过滤器基本上不保留所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐，包括纸过滤器(例如，低灰分滤纸，如Whatman 44或54低灰分滤纸)、尼龙过滤器、聚醚砜过滤器、玻璃纤维过滤器、硅藻土垫等。
本文所述方法的步骤(c)包括分别用第一含水组合物或第二含水组合物调节初始提取物或第二初始提取物的体积，以获得经调节的初始提取物或经调节的第二初始提取物。第一和第二含水组合物可以是不同或相同的。经调节的初始提取物或经调节的第二初始提取物可以在此时被过滤，或者可以按原样进行到步骤(d)。可以使用任何合适的过滤方法过滤初始提取物或第二初始提取物，包括通过任何合适的过滤器的重力过滤或真空过滤，只要过滤器基本上不保留所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐，包括纸过滤器(例如，低灰分滤纸，如Whatman 44或54低灰分滤纸)、尼龙过滤器、聚醚砜过滤器、玻璃纤维过滤器、硅藻土垫等。
可以用足够量的含水组合物(例如，水)调节初始提取物或第二初始提取物的体积，以获得经调节的初始提取物或经调节的第二初始提取物以除其他之外，相对于未调节的初始提取物或未调节的第二初始提取物，增加所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐与本文所述方法的步骤(d)中使用的离子交换色谱柱的结合。
可以调节初始提取物或第二初始提取物的体积以除其他之外，调节初始提取物或第二初始提取物中有机溶剂(当存在时)的量。可以调节初始提取物或第二初始提取物的体积，使得经调节的初始提取物或经调节的第二初始提取物包含按体积计小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％、小于约1％或甚至约0％的有机溶剂，余量为水；或按体积计约0％至约40％、约0％至约30％、约10％至约40％、约10％至约30％、约20％至约40％、约30％至约40％或约35％的有机溶剂，余量为水。
本文所述方法的步骤(d)包括在离子交换固定相(例如弱阴离子交换固定相)上色谱分离经调节的初始提取物或第二初始提取物。色谱分离可以以任何合适的方式进行，包括分批模式或使用柱。色谱分离可以用含水组合物(例如，包含(C1-C4)烷醇的含水组合物)作为洗脱剂(例如，包含按体积计约0％至约40％、约0％至约30％、约10％至约40％、约10％至约30％、约20％至约40％、约30％至约40％或约35％的(C1-C4)烷醇，余量为水的含水组合物)进行，使一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐吸附在弱离子交换色谱柱上，同时洗脱其他化合物，包括咖啡因、芦丁(也称为芸香苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷和槐苷)
及其异构体。本文所述方法的步骤(d)可以将咖啡因、芦丁和芦丁异构体中至少一种的浓度降低至按质量计小于1％、小于0.5％、小于0.1％、小于0.05％、小于0.01％或小于0.001％的浓度。因此，本公开内容考虑了包含按质量计少于0.1％的咖啡因、芦丁和芦丁异构体中至少一种的马黛茶提取物。本公开内容还考虑了包含按质量计少于0.5％的咖啡因、芦丁和芦丁异构体中的每一种以及按质量计少于约1％的咖啡因、芦丁和芦丁异构体组合的马黛茶提取物。本公开内容还考虑了有效地不含咖啡因、芦丁和芦丁异构体中至少一种(例如，不含咖啡因、不含芦丁、不含芦丁异构体和/或不含咖啡因、芦丁和芦丁异构体)的马黛茶提取物。
离子交换固定相是非限制性的，并且可以是任何合适的离子交换色谱固定相。合适的离子交换色谱固定相的实例包括快速流动树脂、DEAEDEAE
在色谱分离经调节的初始提取物或经调节的第二初始提取物之前，离子交换色谱固定相可以任选地用含水组合物(例如，包含(C1-C4)烷醇的含水组合物)预处理，如包含按体积计约0％至约40％、约0％至约30％、约10％至约40％、约10％至约30％、约20％至约40％、约30％至约40％或约35％的(C1-C4)烷醇，余量为水的含水组合物。例如，弱离子交换色谱柱可以用约2倍或更多的床体积(BV)以约2BV/h的流速预处理。
弱离子交换色谱柱的pH可以任选地在色谱分离经调节的初始提取物或经调节的第二初始提取物之前进行调节。例如，可以在用任何合适的酸(例如盐酸)进行色谱分离之前调节弱离子交换色谱柱的pH，使得弱离子交换色谱柱的pH(例如树脂/固定相的pH)是小于约10、约9或更小、约8或更小、约7或更小、约6或更小、约5或更小、约4或更小、约3或更小的pH；或约2至约10、约3至约8、约5至约9、约2至约6；约3至约4；或约3至约6的pH。在色谱分离经调节的初始提取物或经调节的第二初始提取物之前，可以在任选地用包含(C1-C4)的含水组合物预处理柱之前或之后调节弱离子交换色谱柱的pH。
在预调节和/或调节弱离子交换色谱柱的pH后，经调节的初始提取物或经调节的第二初始提取物可以以任何合适的速率(如以高于2BV/h(每小时的床体积)的速率)装载到柱上。在装载经调节的初始提取物或经调节的第二初始提取物后，可以用任何合适体积的包含(C1-C4)烷醇的含水组合物(例如，至少约2BV、至少约3BV或至少约4BV的包含按体积计约10％至约40％、约10％至约30％、约20％至约40％、约30％至约40％或约35％的(C1-C4)烷醇，余量为水的含水组合物)以任何合适的速率(如以约2BV/h的速率)洗涤柱。包含(C1-C4)烷醇的含水组合物的体积可以被丢弃，因为除其他之外，它将含有咖啡因、芦丁和芦丁异构体。
本文所述方法的步骤(e)包括从弱离子交换色谱柱洗脱吸附的一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐，以获得包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的第一洗脱液。洗脱在适于从柱中洗脱所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的任何条件下进行。
从柱中洗脱所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的合适条件的实例包括用任何合适体积的包含盐(例如氯化钠、氯化钾、氯化铵、硫酸钠、硫酸钾、磷酸钠、磷酸钾等)的溶液洗脱柱。包含盐的溶液的实例包括包含至少一种盐(例如，约5wt.％至约25wt.％、约15wt.％至约20wt.％或约5wt.％至约10wt.％的盐)的溶液，所述至少一种盐溶解在包含(C1-C4)烷醇的含水组合物(例如，至少约2BV、至少约3BV或至少约4BV的包含按体积计约10％至约60％、约20％至约50％、约30％至约55％、约40％至约60％或约50％的(C1-C4)烷醇的含水组合物)中。
从柱中洗脱所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的合适条件的另一个实例包括用任何合适体积的包含酸(例如盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、甲酸等)的溶液洗脱柱。包含酸的溶液的实例包括包含盐酸等的溶液和任选地包含含水组合物的酸溶液，所述含水组合物包含按体积计约10％至约60％、约20％至约50％、约30％至约55％、约40％至约60％或约50％的(C1-C4)烷醇。
收集从洗脱步骤中收集的包含所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的第一洗脱液，并且随后可以通过任何合适的方法除去溶剂(例如除去水和(C1-C4)烷醇)来进行浓缩，以提供包含所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的浓缩物。溶剂去除可以在惰性气氛下(例如，在氮气气氛下)完成。虽然不希望受任何特定理论的约束，但据信在惰性气氛下进行溶剂去除可以减少高度着色的聚合物质的形成，所述物质或者天然存在于马黛茶生物质中，或者在本文所述的一个或多个步骤中形成。
包含所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的第一洗脱液包含溶剂。溶剂可以在步骤(f)中被除去至干，或者可以被除去至保留一定体积的包含(C1-C4)烷醇的含水组合物作为溶剂的程度(例如，洗脱液原始总体积的约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％)，以形成浓缩物，尽管组成包含(C1-C4)烷醇的含水组合物的组分的比率可以或不可以不同于组成用于洗脱吸附的一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的包含(C1-C4)烷醇的含水组合物的组分的比率。可替代地，洗脱液中包含所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的溶剂可以被除去至保留一定体积的包含(C1-C4)烷醇的含水组合物的程度，其中包含(C1-C4)烷醇的含水组合物包含按体积计少于约10％、少于约5％、少于约2％或少于约1％的(C1-C4)烷醇。
从包含(除本文所述的酸之外)所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的洗脱液中除去溶剂以形成包含(除本文所述的酸之外)所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的浓缩物的合适条件包括将惰性气体(例如氮气)吹到洗脱液的表面上。洗脱液可以在吹入氮气的同时加热，或者其可以在室温(例如25℃)下加热。除去洗脱液中溶剂的其他条件包括对装有洗脱液的容器施加真空。真空可以在室温下或在加热容器的同时施加给洗脱液。除去洗脱液中溶剂的又其他条件包括使洗脱液通过刮膜蒸发器或搅动的薄膜蒸发器。
此时可以调节浓缩物的pH，以获得经pH调节的浓缩物，尽管此时调节pH是任选的。例如，可以将浓缩物的pH调节至除本文所述的酸之外，所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐被保护免于降解的pH。合适的pH包括小于约6、小于约5、小于约4、小于约3或小于约2的pH；如约2至约6、约2至约5、约2至约4、约3至约5的pH或约3.5的pH。浓缩物的pH可以通过使用任何合适的酸或碱来调节。当使用酸时，所述酸可以是盐酸等。
浓缩物或经pH调节的浓缩物可以在本文所述的方法或除去步骤(f)中按原样使用，或者它们可以被过滤。可以使用任何合适的过滤器(例如，低灰分滤纸，如Whatman 44或54低灰分滤纸)、尼龙过滤器、聚醚砜过滤器、玻璃纤维过滤器、硅藻土垫等过滤浓缩物或经pH调节的浓缩物。在一些情况下，取决于浓缩物或经pH调节的浓缩物的体积，经pH调节的浓缩物可以通过聚合物膜(如具有例如0.2μm孔径的聚醚砜(PES)过滤器、或褶状(平坦膜，真空过滤)或褶状PES膜)过滤。
包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的浓缩物，无论其是经pH调节的、过滤的还是经pH调节和过滤的，都可以直接进入可能被高度着色的浓缩物的干燥步骤(h)，或者可以提交给步骤(g)中进行脱盐/脱色(以任何顺序，包括脱盐，随后脱色；脱色，随后脱盐；脱色，但不脱盐；或者脱盐，但不脱色)。脱盐/脱色可以在惰性气氛下(例如，在氮气气氛下)完成。虽然不希望受任何特定理论的约束，但据信在惰性气氛下进行一个或多个步骤可以减少高度着色的聚合物质的形成，所述物质或者天然存在于马黛茶生物质中，或者在本文所述的一个或多个步骤中形成。
浓缩物，无论其是经pH调节的、过滤的还是经pH调节和过滤的，都可以通过任何合适的方法脱色，包括超滤(例如，通过分子量截止膜、尺寸排阻色谱或凝胶渗透过滤)。人们通过脱色获得滤液。除其他之外，超滤完成了可能被高度着色的浓缩物的脱色。虽然不希望受任何特定理论的约束，但据信超滤除去了高度着色的聚合物质，所述物质或者天然存在于马黛茶生物质中，或者在本文所述的一个或多个步骤中形成。
脱色后的滤液可以进入干燥步骤(h)或者其可以在步骤(g)中脱盐。可替代地，浓缩物，无论其是经pH调节的、过滤的还是经pH调节和过滤的，都可以在不首先脱色的情况下脱盐。无论如何，脱盐可以使用纳米过滤膜和疏水性树脂来完成。本领域技术人员将认识到，当使用纳米过滤膜和疏水性树脂时，人们丢弃渗透物并保留渗余物。在一个实例中，脱盐可以使用疏水性树脂(例如，多孔聚二乙烯基苯/乙基乙烯基苯基质，如SEPABEADSTMSP70)来完成，其中人们将装载包含按体积计少于约20％的(C1-C4)烷醇的经pH调节的浓缩物(例如，酸化的浓缩物，其pH小于约2)。然后用稀醇(例如，按体积计少于约10％的(C1-C4)烷醇，其余为pH小于约2的水)洗涤树脂，并且然后用包含按体积计约70％的(C1-C4)烷醇的含水组合物在水中洗脱，以获得脱盐的第二洗脱液，所述第二洗脱液包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐。
如果在步骤(g)中脱盐先于脱色，则来自脱盐步骤的渗透物中的溶剂可以被除去至保留一定体积的包含(C1-C4)烷醇的含水组合物作为溶剂的程度(例如，洗脱液原始总体积的约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％)，以形成第一脱盐浓缩物。可替代地，来自脱盐的渗透物中的溶剂可以被除去(以得到第二脱盐浓缩物)至保留一定体积的包含(C1-C4)烷醇的含水组合物的程度，其中包含(C1-C4)烷醇的含水组合物包含按体积计少于约10％、少于约5％、少于约2％或少于约1％的(C1-C4)烷醇。第一脱盐浓缩物还可以具有第二脱盐浓缩物的属性，使得第一脱盐浓缩物也具有按体积计少于约10％、少于约5％、少于约2％或少于约1％的(C1-C4)烷醇。
从包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的渗透物中除去溶剂以形成包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的第一/第二脱盐浓缩物的合适条件包括将惰性气体(例如氮气)吹到洗脱液的表面上。渗透物可以在吹入氮气的同时加热，或者其可以在室温(例如25℃)下加热。除去洗脱液中溶剂的其他条件包括对装有渗透物的容器施加真空。真空可以在室温下或在加热容器的同时施加给渗透物。除去渗透物中溶剂的又其他条件包括使渗透物通过刮膜蒸发器或搅动的薄膜蒸发器。
在另一个实例中，包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的浓缩物可以通过滤纸过滤，以获得第一滤液，所述第一滤液被超滤以获得第二滤液，并且所述第二滤液使用纳米过滤膜进行纳米过滤以获得第一渗余物，或者第二滤液通过疏水性树脂洗脱以获得脱盐的第二洗脱液。在另一个实例中，包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的浓缩物可以通过滤纸过滤，以获得第一滤液，所述第一滤液使用纳米过滤膜进行纳米过滤以获得第三渗余物，或者第一滤液通过疏水性树脂洗脱以获得脱盐的第二洗脱液，并且所述第三渗余物或脱盐的第二洗脱液被超滤以获得第三滤液。
如本文所述，可以将包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的洗脱液浓缩至干，或者可以将其浓缩至保留一定体积的包含(C1-C4)烷醇的含水组合物的程度。如果洗脱液被浓缩至干，则可以使用例如包含(C1-C4)烷醇的含水组合物来重构干物质。然后，可以如本文所述过滤重构的物质以除其他之外，进行脱盐和脱色中的至少一种。
本文所述的方法可以包括步骤(h)，其包括干燥第一渗余物、脱盐的第二洗脱液或第三滤液，以获得包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物。第一渗余物、脱盐的第二洗脱液或第三滤液可以任何合适的方式干燥，包括通过冻干或喷雾干燥。
图1是制备包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物的方法100的流程图。在操作102中，在合适的容器(例如玻璃罐)中，将马黛茶生物质与含有50％乙醇/水的含水组合物接触1h(将300g马黛茶生物质加入1.5L溶剂中)，以获得初始提取物。在操作104中，使用例如带有Whatman 54低灰分滤纸的陶瓷布氏漏斗将初始提取物过滤到玻璃4L侧臂烧瓶中。在操作106中，用含水组合物(在这种情况下为水)调节经过滤的初始提取物的体积，以获得含有较低比例乙醇(在这种情况下为按体积计35％乙醇)的经调节的经过滤的初始提取物。在操作108中，可以使用例如带有Whatman 44低灰分滤纸的陶瓷布氏漏斗将经调节的经过滤的初始提取物重新过滤到玻璃4L侧臂烧瓶中。在操作110中，在离子交换色谱固定相上色谱分离经调节的经过滤的初始提取物。例如，将FPA 53树脂填充在玻璃柱中。将树脂用35％乙醇(2BV，以2BV/h)预处理。将经调节的经过滤的初始提取物装载(2BV/h)到树脂上，丢弃装载的渗透物。用35％乙醇(4BV，以2BV/h)洗涤树脂，丢弃洗涤的渗透物。将所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐用50％乙醇/水、10％FCC氯化钠(4BV，0.5BV/h)洗脱，并保留渗透物。可以任选地用水(4BV，2BV/h)再生柱/树脂。在操作112中，将洗脱液/渗透物浓缩以形成浓缩物。在这种情况下，将氮气吹到洗脱液/渗透物的顶部上2天，直到体积为洗脱液/渗透物初始体积的大约三分之一和/或洗脱液/渗透物中的乙醇少于1％，从而获得浓缩物。在操作114中，将浓缩物酸化至大约3.5的pH，并且然后通过布氏漏斗上的Whatman 44滤纸过滤，随后通过0.2μm聚醚砜(PES)过滤器过滤。在操作116中，使用分子量截止膜(MWCO；例如，除去分子量大于10kDA的物质的MWCO膜，如3kDaNP010或Synder VT-2B或1kDa Synder XT-2B)使经过滤的浓缩物脱色以除其他之外，使经过滤的浓缩物脱色并获得渗透物。在操作118中，通过纳米过滤膜(例如，XN45膜)过滤渗透物，并且随后在操作120中干燥渗余物，以获得包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物。
图2是制备包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物的方法200的流程图。在操作202中，在合适的容器(例如玻璃罐)中，将马黛茶生物质与含有50％乙醇/水的含水组合物接触1h(将300g马黛茶生物质加入1.5L溶剂中)，以获得初始提取物。在操作204中，使用例如带有Whatman 54低灰分滤纸的陶瓷布氏漏斗将初始提取物过滤到玻璃4L侧臂烧瓶中。在操作206中，用含水组合物(在这种情况下为水)调节经过滤的初始提取物的体积，以获得含有较低比例乙醇(在这种情况下为按体积计35％乙醇)的经调节的经过滤的初始提取物。在操作208中，可以使用例如带有Whatman 44低灰分滤纸的陶瓷布氏漏斗将经调节的经过滤的初始提取物重新过滤到玻璃4L侧臂烧瓶中。在操作210中，在离子交换色谱固定相上色谱分离经调节的经过滤的初始提取物。例如，将
一种制备包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物的方法的另一个实例，所述方法包括
(i)使马黛茶生物质与含水组合物接触以获得初始提取物；
(ii)从初始提取物中除去固体以获得第二初始提取物；
(iii)使第二初始提取物与酸化的乙酸乙酯接触，以获得酸性乙酸乙酯提取物；
(iv)中和酸性乙酸乙酯提取物以获得中和的乙酸乙酯和含水提取物；
(v)使含水提取物脱色以获得脱色的含水提取物；以及
(vi)干燥脱色的含水提取物，以获得包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物。
步骤(i)、(ii)和(vi)如本文对于步骤(a)、(b)和(h)所述地进行。如本文所讨论，步骤(v)类似于过滤步骤(g)，不同之处在于步骤(v)仅涉及脱色过程，如超滤，其包括通过分子量截止膜、尺寸排阻色谱和凝胶渗透过滤。因此，关于步骤(a)、(b)、(g)和(h)的公开内容适用于步骤(i)、(ii)、(v)和(vi)。
本文所述方法的步骤(i)包括使马黛茶生物质与含水组合物接触，以获得包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的初始提取物。
含水组合物可以包含水，并且不含有任何共溶剂，如有机溶剂。但除了水之外，含水组合物还可以包含共溶剂。合适的共溶剂包括有机溶剂，如(C1-C4)烷醇和(C1-C4)烷醇的混合物。有机溶剂(如(C1-C4)烷醇或(C1-C4)烷醇的混合物)的比例可以是任何合适的比例，使得含水组合物可以包含按体积计高达约30％、高达约40％、高达约50％或高达约60％的有机溶剂，余量为水；或按体积计约30％至约60％、约40％至约60％、约30％至约50％、约40％至约50％或约50％的有机溶剂，余量为水。
在一些情况下，含水组合物可以用任何合适的缓冲系统缓冲，包括但不限于磷酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、乳酸盐、乙酸盐等。缓冲剂可以是1-1000mM范围内的阴离子。可替代地，在有或没有共溶剂的情况下，用盐酸、硫酸、硝酸等酸化至pH 5-6的水可以用于含水组合物。可替代地，在有或没有共溶剂的情况下，用氢氧化物(如氢氧化钠或氢氧化钾)碱化至pH 7-11的纯水可以用于含水组合物。在仍其他情况下，加入合适的非离子溶质可能是合适的，所述溶质可以有助于平衡含水组合物的渗透势。
在步骤(i)的接触之前和/或期间，可以搅拌、超声波处理或以其他方式搅动马黛茶生物质以除其他之外，使一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的提取最大化。
初始提取可以按原样进行到步骤(iii)，或者可以在本文所述方法的步骤(ii)中除去存在的松散固体和/或植物固体，如粉碎的马黛茶植物叶、杆、顶部、根等。当进行步骤(ii)时，获得第二初始提取物。
松散固体可以通过任何合适的方法除去，包括离心、撇渣或过滤。例如，可以使用任何合适的过滤方法过滤初始提取物，包括通过任何合适的过滤器的重力过滤或真空过滤，只要过滤器基本上不保留所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐，包括纸过滤器(例如，低灰分滤纸，如Whatman 44或54低灰分滤纸)、尼龙过滤器、聚醚砜过滤器、玻璃纤维过滤器、硅藻土垫等。
在进行步骤(iii)之前，可以任选地用合适的酸(例如，盐酸等)或合适的碱(例如，氢氧化钠)将初始或第二初始提取物的pH调节至约4至约7之间的pH。然后用未如本文所述进行预酸化的乙酸乙酯提取经pH调节的初始或第二初始提取物。虽然不希望受任何特定理论的约束，但据信当初始或第二初始提取物的pH被调节至约4至约7之间时，有可能将某些杂质提取到乙酸乙酯中，同时将所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物保留在含水层中。
本文所述方法的步骤(iii)包括使第一或第二初始提取物与酸化的乙酸乙酯接触，以获得酸性乙酸乙酯提取物。酸化的乙酸乙酯可以任何合适的方式制备，包括通过加入任何合适的酸，包括盐酸、硫酸和冰醋酸(例如，0.01-1％vol/vol)。用水洗涤酸性乙酸乙酯提取物(例如，用1∶1 vol/vol的水洗涤三次)。在这些条件下，所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐将基本上是它们的共轭酸形式，并且将基本上存在于用水洗涤酸性乙酸乙酯提取物时形成的酸性乙酸乙酯层中。将水层丢弃，并且酸性乙酸乙酯提取物进行至步骤(iv)。
本文所述方法的步骤(iii)可以其他合适的方式进行，包括通过使用未如本文所述进行预酸化的乙酸乙酯(例如，通过用冰醋酸预洗涤)，而是通过用合适的酸(例如，盐酸等)调节初始或第二初始提取物的pH，然后用未预酸化的乙酸乙酯提取经pH调节的初始或第二初始提取物。不管用于调节初始提取物或第二初始提取物的pH的酸是什么，初始提取物或第二初始提取物的pH被调节至约4或更低、3或更低、约2或更低、或约1或更低。将水层丢弃，并且所得的酸性乙酸乙酯提取物进行至步骤(iv)。
本文所述方法的步骤(iv)包括中和酸性乙酸乙酯提取物以获得中和的乙酸乙酯和含水提取物。这以任何合适的方式完成，包括用水洗涤酸性乙酸乙酯提取物(例如，用1∶1vol/vol的水洗涤三次)，所述水包含合适的碱，如氢氧化钠、氢氧化钾等，及其组合。在这些条件下，所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐将基本上是它们的共轭碱形式，并且将基本上存在于用包含合适的碱的水洗涤酸性乙酸乙酯提取物时形成的水层中。
在步骤(iv)、步骤(iv-a)的可替代的、任选的步骤中，可以任选地除去由步骤(iii)产生的酸性乙酸乙酯提取物，甚至将其除去至干。可以用pH中性水(例如去离子水)重构剩余的任何固体，并且然后可以将水的pH调节至约3至约7；或者可以用pH为约3至约7的水重构剩余的固体。
然后可以将包含所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的含水提取物，无论它们来自步骤(iv)还是步骤(iv-a)，提交给步骤(v)以除其他之外，完成可能被高度着色的含水提取物的脱色。可以通过任何合适的方法脱色，包括超滤(例如，通过分子量截止膜、尺寸排阻色谱或凝胶渗透过滤)。人们通过脱色获得滤液。除其他之外，超滤完成了可能被高度着色的浓缩物的脱色。虽然不希望受任何特定理论的约束，但据信超滤除去了高度着色的聚合物质，所述物质或者天然存在于马黛茶生物质中，或者在本文所述的一个或多个步骤中形成。
包括步骤(i)-(vi)(包括可替代的、任选步骤(iv-a))的本文所述方法的另一个改进实例包括一种制备包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物的方法，所述方法包括
使马黛茶生物质与含水组合物接触以获得初始提取物；
从所述初始提取物中除去固体以获得第二初始提取物；
将所述第二初始提取物的pH调节至约4至约7的pH，以获得第一经pH调节的第二初始提取物；
使所述第一经pH调节的第二初始提取物与乙酸乙酯接触，以获得第一乙酸乙酯提取物和第二含水提取物；
将所述第二含水提取物的pH调节至小于2的pH，以获得经pH调节的第二含水提取物；
使所述经pH调节的第二含水提取物与乙酸乙酯接触，以获得第二乙酸乙酯提取物；
从第二乙酸乙酯提取物中除去乙酸乙酯以获得纯化的组合物；
用水重构所述粗组合物以获得第三含水提取物；以及
使所述第三含水提取物脱色以获得脱色的含水提取物。“纯化的组合物”将包含感兴趣的化合物(例如，所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐)，并且至少相对于初始提取物和第二初始提取物是纯化的，因为“纯化的组合物”将在初始提取物和第二初始提取物中不含有某些杂质，但含有高度着色的聚合物质，所述物质或者天然存在于马黛茶生物质中，或者在本文所述的一个或多个步骤中形成，并且在脱色步骤中被除去。
包括步骤(i)-(vi)(包括可替代的、任选步骤(iv-a))的本文所述方法的又另一个改进实例包括一种制备包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物的方法，所述方法包括
使马黛茶生物质与含水组合物接触以获得初始提取物；
从所述初始提取物中除去固体以获得第二初始提取物；
将所述第二初始提取物的pH调节至小于约2的pH，以获得第二经pH调节的第二初始提取物；
使所述第二经pH调节的第二初始提取物与乙酸乙酯接触，以获得第三乙酸乙酯提取物；
中和所述第三乙酸乙酯提取物以获得第一中和的乙酸乙酯提取物和第三含水提取物；以及
使所述第三含水提取物脱色以获得脱色的含水提取物。
本文所述的方法可以包括步骤(vi)，其包括干燥脱色的含水提取物，以获得包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物。第一或第二渗余物或第三滤液可以任何合适的方式干燥，包括通过冻干或喷雾干燥。
图3是制备包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物的方法300的流程图。在操作302中，在合适的容器(例如玻璃罐)中，将马黛茶生物质与含有50％乙醇/水的含水组合物接触1h(将300g马黛茶生物质加入1.5L溶剂中)，以获得初始提取物。在操作304中，使用例如带有Whatman 54低灰分滤纸的陶瓷布氏漏斗将初始提取物过滤到玻璃4L侧臂烧瓶中以除其他之外，从例如马黛茶生物质中除去固体。在操作306中用酸化的乙酸乙酯提取物提取来自操作304的滤液。在将所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物提取到酸化的乙酸乙酯中后，在操作308中，用水洗涤酸化的乙酸乙酯，所述水包含合适的碱，如氢氧化钠、氢氧化钾等，以获得中和的乙酸乙酯和含水提取物。在这些条件下，所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物将基本上是它们的共轭碱形式，并且将基本上存在于用包含合适的碱的水洗涤酸性乙酸乙酯提取物时形成的水层中。在操作310中，过滤水层以获得滤液。在操作316中，使用3kDa分子量截止膜(NP010；六次渗滤)使滤液脱色以除其他之外，使含水提取物脱色，从而获得脱色的含水提取物。在操作320中，干燥脱色的含水提取物，以获得包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物。
图4是制备包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物的方法400的流程图。在操作402中，在合适的容器(例如玻璃罐)中，将马黛茶生物质与含有50％乙醇/水的含水组合物接触1h(将300g马黛茶生物质加入1.5L溶剂中)，以获得初始提取物。在操作404中，使用例如带有Whatman 54低灰分滤纸的陶瓷布氏漏斗将初始提取物过滤到玻璃4L侧臂烧瓶中以除其他之外，从例如马黛茶生物质中除去固体。将来自操作404的滤液pH调节至约4至约7，并在操作408中用乙酸乙酯提取滤液，同时感兴趣的化合物保留在含水层中。在操作406中，将含水层的pH调节至小于2，并且用乙酸乙酯提取含水层。在将所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物提取到乙酸乙酯中后，在操作407中，将乙酸乙酯除去至干，以获得固体。用水重构固体，并将水的pH调节至约3至约7。在这些条件下，所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物将基本上是它们的共轭碱形式，并将溶解在水中。在操作410中，过滤水层以获得滤液。在操作416中，使用3kDa分子量截止膜(NP010；六次渗滤)使滤液脱色以除其他之外，使含水提取物脱色，从而获得脱色的含水提取物。在操作420中，干燥脱色的含水提取物，以获得包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物。
根据本文所述方法制备的包含所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物可以掺入任何可摄取组合物中，包括饮料和食品中。
例如，可摄取组合物可以是可食用组合物或非可食用组合物。“可食用组合物”意指可以作为食物被人类或动物食用的任何组合物，包括固体、凝胶、糊状物、泡沫材料、半固体、液体或其混合物。“非可食用组合物”意指旨在并非作为食物被人类或动物消费或使用的任何组合物，包括固体、凝胶、糊状物、泡沫材料、半固体、液体或其混合物。非可食用组合物包括但不限于药物组合物，其是指旨在出于治疗目的被人类或动物使用的非可食用组合物。“动物”包括任何非人类动物，例如像农场动物和宠物。
根据本文所述方法制备的包含所述一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物可以被加入到非可食用组合物或不可食用的产品中，如补充剂、营养制品、功能性食品(例如，声称具有超过提供营养的基本营养功能的促进健康和/或预防疾病特性的任何新鲜或加工食品)、药物和非处方药、口腔护理产品(如洁齿剂和漱口水)、化妆品(如唇膏)以及其他个人护理产品。
一般来说，非处方药(OTC)产品和口腔卫生产品通常是指家用和/或个人用产品，这些产品可以在没有处方和/或没有看医生的情况下出售。OTC产品的实例包括但不限于维生素和膳食补充剂；局部止痛剂和/或麻醉剂；咳嗽、感冒和过敏治疗；抗组胺药和/或抗过敏药；及其组合。维生素和膳食补充剂包括但不限于维生素、膳食补充剂、滋补剂/瓶装营养饮料、儿童专用维生素、膳食补充剂、有关营养或提供营养的任何其他产品及其组合。局部止痛剂和/或麻醉剂包括用于减轻表面或深层疼痛(例如肌肉疼痛)的任何局部乳膏/软膏/凝胶；出牙凝胶；含有止痛成分的贴剂；及其组合。咳嗽、感冒和过敏治疗包括但不限于减充血剂、咳嗽治疗、咽部制剂、药物糖果、抗组胺药和儿童专用咳嗽、感冒和过敏治疗；以及组合产品。抗组胺药和/或过敏治疗包括但不限于对花粉热、鼻过敏、昆虫叮咬和螫伤的任何系统性治疗。口腔卫生产品的实例包括但不限于口腔清洁条、牙膏、牙刷、漱口水/漱口液、假牙护理、口腔清新剂、家用牙齿增白剂和牙线。
根据本文所述方法制备的包含一种或多种甜菊醇糖苷稳定化合物及其盐的组合物可以加入到食品或饮料产品或制剂中。食品和饮料产品或制剂的实例包括但不限于可食用产品或任何实体的涂层、糖霜或釉料，所述实体包括在汤类、干加工食品类、饮料类、即食餐类、罐装或腌制食品类、冷冻加工食品类、速冻加工食品类、小吃食品类、烘焙食品类、糖果类、乳制品类、冰淇淋类、膳食替代品类、食用面糊和面条类，以及调味汁、调味品、调味料类、婴儿食品类和/或涂抹品类中。
一般来说，汤类是指罐装/腌制、脱水、速溶、冷藏、UHT和冷冻汤。出于本定义的目的，汤意指由肉、家禽、鱼、蔬菜、谷物、水果和其他成分制备的食物，在液体中烹制，其中可能包括这些成分中一些或全部的可见碎片。它可以是清的(如肉汤)或稠的(如杂烩)、光滑的、泥状的或块状的、即可食用的、半浓缩的或浓缩的，并且也可以是热的或冷的，作为第一道菜或作为进餐的主菜或作为餐间小吃(像饮料一样啜饮)。汤可以用作制备其他膳食组分的配料，并且范围可以从肉汤(清汤)到调味汁(基于奶油或奶酪的汤)。
“脱水和烹饪食品类”通常意指：(i)饪辅助产品，如：粉末、颗粒、糊状物、浓缩液体产品，包括浓缩肉汤、肉汤和类似肉汤的产品，以压制的方块、片剂或粉末或颗粒形式，其作为成品或产品、调味汁和配方混合物(无论技术如何)中的成分单独出售；(ii)膳食解决方案产品，如：脱水和冻干汤，包括脱水汤混合物、脱水速溶汤、脱水即食汤、脱水或常温现成菜肴、膳食和单一主菜，包括食用面糊、土豆和米饭；和(iii)膳食装饰产品，如：调味料、腌泡汁、沙拉调料、沙拉配料、蘸料、面包屑、面糊混合物、耐储存的涂抹品、烧烤调味汁、液体配方混合物、浓缩物、调味汁或调味汁混合物，包括用于沙拉的配方混合物，作为成品或产品中的成分出售，无论是脱水的、液体的还是冷冻的。
饮料类意指饮料、饮料混合物和浓缩物，包括但不限于碳酸和非碳酸饮料、酒精和非酒精饮料、即饮饮料、用于制备饮料的液体浓缩物制剂(如苏打水)和干粉饮料前体混合物。饮料类还包括酒精饮料、软饮料、运动饮料、等渗饮料和热饮。酒精饮料包括但不限于啤酒、苹果酒/梨酒、FAB、葡萄酒和烈酒。软饮料包括但不限于碳酸盐，如可乐和非可乐碳酸盐；水果汁，如果汁、蜜汁、果汁饮料和水果调味饮料；瓶装水，其包括气泡水、泉水和纯净水/自来水；功能性饮料，其可以是碳酸化或蒸馏的，并且包括运动饮料、能量饮料或万能饮料；浓缩物，如液体和粉末浓缩物，可以随时饮用。热饮包括但不限于咖啡，如新鲜的(例如煮的)、速溶的、混合咖啡、液体的、即饮的、可溶的和干的咖啡饮料、咖啡饮料混合物和浓缩物(糖浆、纯的、配制的或粉末形式的；“粉末形式”的实例是包含全部为粉末形式的咖啡、甜味剂和增白剂的产品)；茶，如红茶、绿茶、白茶、乌龙茶和调味茶；以及其他热饮，包括与牛奶或水混合的基于香料、麦芽或植物的粉末、颗粒、块或片剂。
小吃食品类通常是指可以是简单的非正式餐的任何食品，包括但不限于甜味和咸鲜味小吃和小吃棒。小吃食品的实例包括但不限于水果小吃、薄脆点心/松脆点心、挤压小吃、玉米粉圆饼/玉米薄脆饼、爆米花、椒盐卷饼、坚果小吃以及其他甜味和咸鲜味小吃。小吃棒的实例包括但不限于格兰诺拉麦片/牛奶什锦早餐棒、早餐棒、能量棒、水果棒和其他小吃棒。
烘焙食品类通常是指任何可食用产品，其制备过程包括暴露于热或过多的阳光。烘焙食品的实例包括但不限于面包、小圆面包、小甜饼、松饼、谷类食品、烤面包机糕点、糕点、华夫饼、玉米粉圆饼、饼干、馅饼、百吉饼、挞、乳蛋饼、蛋糕、任何烘焙食品及其任何组合。
冰淇淋类通常是指含有奶油和糖和调味料的冷冻甜点。冰淇淋的实例包括但不限于：即食冰淇淋(impulse ice cream)；外带冰淇淋；冷冻酸奶和手工冰淇淋；基于大豆、燕麦、豆类(例如红豆和绿豆)和大米的冰淇淋。
糖果类通常是指味道甜美的可食用产品。糖果的实例包括但不限于糖果、明胶、巧克力糖果、糖糖果、口香糖等以及任何组合产品。膳食替代品类通常是指旨在替代正常膳食的任何食物，特别是对具有健康或体质问题的人而言。膳食替代品的实例包括但不限于减肥产品和康复产品。
即食餐类通常是指无需大量准备或加工即可作为膳食的任何食品。即食餐包括由制造商添加了配方“技能”的产品，从而导致高度的准备就绪、完成和便利。即食餐的实例包括但不限于罐装/腌制的、冷冻的、干燥的、速冻的即食餐；客饭调制食品(dinner mixes)；冷冻比萨饼；速冻比萨饼；和制好的沙拉。
食用面糊和面条类包括任何食用面糊和/或面条，包括但不限于罐装、干燥和冷藏/新鲜食用面糊；以及素面、速食面、冷面、冷冻面和快餐面。
罐装/腌制食品类包括但不限于罐装/腌制肉类和肉制品、鱼/海鲜、蔬菜、西红柿、豆类、水果、即食餐、汤、食用面糊和其他罐装/腌制食品。
冷冻加工食品类包括但不限于冷冻加工红肉、加工家禽、加工鱼/海鲜、加工蔬菜、肉类替代品、加工土豆、焙烤产品、甜点、即食餐、比萨饼、汤、面条和其他冷冻食品。
干加工食品类包括但不限于大米、什锦点心(dessert mixes)、干即食餐、脱水汤、速食汤、干食用面糊、素面和方便面。
速冻加工食品类包括但不限于速冻加工肉、加工鱼/海鲜产品、午餐包、鲜切水果、即食餐、比萨饼、制好的沙拉、汤、新鲜食用面糊和面条。
调味汁、调味品和调味料类包括但不限于番茄糊和番茄泥、肉汤/浓缩固体汤料、香草料和香味料、味精(MSG)、表调味汁、基于大豆的调味汁、食用面糊调味汁、湿/烹饪调味汁、干调味汁/粉末混合物、调味番茄酱、蛋黄酱、芥末、沙拉调味品、油醋汁、蘸料、盐腌食品以及其他调味汁、调料品和调味料。
婴儿食品类包括但不限于基于牛奶或大豆的配方；和准备好的、干燥的以及其他婴儿食品。
涂抹品类包括但不限于果酱和蜜饯、蜂蜜、巧克力涂抹品、基于坚果的涂抹品和基于酵母的涂抹品。
乳制品类通常是指由哺乳动物的奶生产的可食用产品。乳制品的实例包括但不限于饮用乳制品、奶酪、酸奶和酸奶饮料以及其他乳制品。
可食用组合物，特别是食品和饮料产品或制剂的其他实例提供如下。示例性可食用组合物包括一种或多种糖食、巧克力糖果、巧克力片、countlines、袋装selflines/softlines、盒装什锦巧克力、标准盒装什锦巧克力、扭结包装小型巧克力、季节性巧克力、带玩具的巧克力、alfajores、其他巧克力糖果、薄荷糖、标准薄荷糖、强力薄荷糖、硬糖(boiled sweets)、糖锭、口香糖类、软糖和橡皮糖、太妃糖、卡拉梅尔糖和牛轧糖、含药糖果、棒棒糖、甘草糖、其他糖类糖果、香口胶、口香糖(chewing gum)、含糖口香糖、无糖口香糖、功能口香糖、泡泡糖、面包、包装/供应商面包、散装/手工(artisanal)面包、面粉糕饼、蛋糕、包装/供应商蛋糕、散装/手工蛋糕、小甜饼、巧克力涂层饼干、夹心饼干、填充饼干、成鲜味饼干和脆饼、面包替代物、早餐谷类食物、即食谷类食物、家庭早餐谷类食物、薄片、牛奶什锦早餐、其他即食谷类食物、儿童早餐谷类食物、热谷类食物、冰淇淋、即食冰淇淋、单份奶油冰淇淋、单份水冰淇淋、合装奶油冰淇淋、合装水冰淇淋、外带冰淇淋、外带奶油冰淇淋、饭后冰淇淋甜点心、散装冰淇淋、外带水冰淇淋、冷冻酸奶、手工冰淇淋、乳制品、牛奶、新鲜/巴氏消毒牛奶、全脂新鲜/巴氏消毒牛奶、半脱脂新鲜/巴氏消毒牛奶、常温保质/超高温消毒牛奶、全脂常温保质/超高温消毒牛奶、半脱脂常温保质/超高温消毒牛奶、无脂常温保质/超高温消毒牛奶、山羊奶、浓缩乳/炼乳、普通浓缩乳/炼乳、调味、功能性的以及其他浓缩乳、调味乳饮料、纯牛奶味的乳饮料、果汁调味的乳饮料、豆奶、酸奶饮料、发酵奶饮料、调咖啡白油(例如，用于咖啡饮料的基于乳制品和非乳制品的奶精或增白剂)、奶粉、调味奶粉饮料、奶油、奶酪、加工奶酪、可涂抹的加工奶酪、不可涂抹的加工奶酪、未加工奶酪、可涂抹的未加工奶酪、硬质奶酪、包装的硬质奶酪、散装的硬质奶酪、酸奶、普通/天然酸奶、调味酸奶、水果酸奶、益生菌(probiotic)酸奶、饮料酸奶、普通饮用酸奶、益生菌饮用酸奶、速冻且耐贮存甜点、基于乳制品的甜点、基于大豆的甜点、速冻小吃、清爽干酪(fromage fraisand quark)、普通清爽干酪、调味清爽干酪、成鲜味清爽干酪、甜食和成鲜味小吃、水果小吃、薄脆点心/松脆点心、挤出小吃、玉米粉圆饼/玉米薄脆饼、爆米花、椒盐卷饼、坚果小吃、其他甜味和咸鲜味小吃、小吃棒、格兰诺拉麦片棒、早餐棒、能量棒、水果棒、其他小吃棒、膳食替代品、减肥产品、康复饮料、即食餐、罐装即食餐、冷冻即食餐、干即食餐、速冻即食餐、客饭调制食品、冷冻比萨饼、速冻比萨饼、汤、罐装汤、干汤、速溶汤、速冻汤、热汤、冷冻汤、食用面糊、罐装食用面糊、干食用面糊、速冻/新鲜食用面糊、面条、普通面、方便面、杯/碗方便面、袋装方便面、速冻面、快餐面、罐装食品、罐装肉和肉产品、罐装鱼/海鲜、罐装蔬菜、罐装番茄、罐装豆、罐装水果、罐装即食餐、罐装汤、罐装食用面糊、其他罐装食品、冷冻食品、冷冻加工的红肉、冷冻加工的禽类、冷冻加工的鱼/海鲜、冷冻加工的蔬菜、冻肉替代品、冷冻马铃薯、烘烤马铃薯片、其他烘烤马铃薯产品、非烘烤冷冻马铃薯、冷冻焙烤产品、冷冻甜点、冷冻即食餐、冷冻比萨饼、冷冻汤、冷冻面条、其他冷冻食品、干食品、什锦点心、干即食餐、干汤、速溶汤、干食用面糊、普通面条、方便面、杯/碗方便面、袋装方便面、速冻食品、速冻加工的肉、速冻的鱼/海鲜产品、速冻加工的鱼、速冻包装的鱼(chilled coated fish)、速冻熏鱼、速冻午餐套餐、速冻即食餐、速冻比萨饼、速冻汤、速冻/新鲜的食用面糊、速冻面条、油脂、橄榄油、植物和种子油、烹调用脂肪、黄油、人造黄油、可涂抹油脂、功能性可涂抹油脂、调味汁、调味品和调味料、番茄糊和番茄泥、肉汤/浓缩固体汤料、浓缩固体汤料、肉汁粒、液体原汁和fonds、香草料和香味料、发酵调味汁、基于大豆的调味汁、食用面糊调味汁、湿调味汁、干调味汁/粉末混合物、调味番茄酱、蛋黄酱、普通蛋黄酱、芥末、沙拉调味品、普通沙拉调味品、低脂肪沙拉调味品、油醋汁、蘸料、盐腌食品、其他调味汁、调味品和调味料、婴儿食品、配方奶、标准配方奶、延续配方奶、幼童配方奶、低变应原性的配方奶、制好的婴儿食品、干婴儿食品、其他婴儿食品、涂抹品、果酱和蜜饯、蜂蜜、巧克力涂抹品、基于坚果的涂抹品和基于酵母的涂抹品。可食用组合物的实例还包括糖果、焙烤产品、冰淇淋、乳制品、甜味和咸鲜味小吃、小吃棒、膳食替代品、即食餐、汤、食用面糊、面条、罐装食品、冷冻食品、干食品、速冻食品、油脂、婴儿食品或涂抹品或其混合物。可食用组合物的实例还包括早餐谷类食物、甜饮料或用于制备饮料的固体或液体浓缩组合物。可食用组合物的实例还包括咖啡调味的食物(例如，咖啡调味的冰淇淋)。
以范围格式表达的值应以灵活的方式解释，不仅包括作为范围的限制明确列举的数值，还包括涵盖在所述范围内的所有单个数值或子范围，就像每个数值和子范围都被明确列举一样。例如，“约0.1％至约5％”或“约0.1％至5％”的范围应被解释为不仅包括约0.1％至约5％，还包括指示范围内的单个值(例如，1％、2％、3％和4％)和子范围(例如，0.1％至0.5％、1.1％至2.2％、3.3％至4.4％)。除非另有说明，否则表述“约X至Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。同样地，除非另有说明，否则表述“约X、Y或约Z”具有与“约X、约Y或约Z”相同的含义。
在本文件中，术语“一个”、“一种”或“所述”用于包括一个或多于一个，除非上下文另有明确说明。除非另有说明，否则术语“或”用于指非排他性的“或”。此外，应了解本文中采用并且未另外定义的措辞或术语仅出于描述而不是限制的目的。任何章节标题的使用旨在帮助阅读文件，而不应解释为限制性的；与章节标题相关的信息可能出现在所述特定章节的内部或外部。此外，本文件中所参考的全部出版物、专利以及专利文件的全部内容都以引用方式并入本文，如同被单独地以引用方式并入一样。在本文件与以引用方式并入的那些文件之间出现不一致用法时，所并入的参考文献的用法应被认为是本文件用法的补充；对于不可调和的不一致处，以本文件中的用法为准。
在本文所述的方法中，除了明确叙述了时间或操作顺序之外，在不脱离本发明的原理的情况下，可以任何顺序执行这些步骤。此外，指定的步骤可以同时执行，除非明确的权利要求语言陈述它们是分开执行的。例如，要求保护的进行X的步骤和要求保护的进行Y的步骤可以在单个操作中同时进行，并且所得过程将落入要求保护的过程的字面范围内。
如本文所用的术语“约”可以允许值或范围的变化程度，例如，在规定值或范围的规定极限的10％以内、5％以内或1％以内。
如本文所用的术语“基本上”是指大部分或主要是，如至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％，或至少约99.999％或更多。
实施例
本发明可以通过参考以下实施例更好地理解，这些实施例通过示例来提供。本发明不限于本文给出的实施例。
实施例1
以重量与体积百分比，经由表1所示的设计制备样品。将适当量的甜菊醇糖苷(SG)称量到10mL玻璃瓶中，并用适当体积的pH 4柠檬酸盐缓冲液稀释，例如，对于0.6％的水平，将27mg稀释到4.5mL缓冲液中。对表1中的所有条件重复这一步骤。然后经由磷酸和pH计将设计为pH 2.5的样品逐滴调节至pH 2.5。对于这些样品，使用相同批次的甜菊醇糖苷稳定化合物(SC)，其从甜叶菊叶中纯化。使用了两种不同的SG来源，RM80(＞80％Reb M，基于干重)和RA95(＞95％Reb A，基于干重)。
在每个时间点，将溶液以10,000rpm离心2分钟，以从分析中除去任何不可溶物质(即使都是不可视的)。将一等份上清液稀释到55％甲醇中，用于通过UHPLC-UV进行分析。利用在水中的三氟乙酸和乙腈，在基于C18的反相色谱柱上在升高的温度下在梯度条件下进行色谱分析。利用设置为210nm的UV检测器检测SG。使用高纯度(＞99％)Reb A标准作为参考溶液，应用线性校准曲线。
简而言之，在48+周储存之后，储存在4℃下；室温(约22℃)下；在pH 4下；以及在pH2.5下的长期储存化学稳定性数据，SG的回收率＞94％。表2给出了长期储存化学稳定性数据。NM值表示当时没有进行测量。
此实施例表明，随着时间的推移，甜菊醇糖苷稳定性化合物对稳定甜菊醇糖苷是有效的。甜菊醇糖苷稳定性化合物在48周内有效稳定甜菊醇糖苷，其中在4℃下、在室温下、在pH 4下和/或pH 2.5下甜菊醇糖苷的回收率大于94％。
实施例2
以500ppm(可以用于饮料的使用水平)制备样品用于在室温(RT，约22℃)下储存。从Fisher购买了一种pH 1.7的缓冲液(Oakton，零件号00654-01)，并用于稀释所有样品。此研究中使用的大量SC材料源自马黛茶。为所述研究总共制备了3种溶液：一种不含添加剂(500ppm Reb M，在pH 1.7缓冲液中)，一种含有500ppm Reb M和500ppm SC，以及一种阴性对照，含有500ppm Reb M和500ppm抗坏血酸(一种常见的抗氧化剂)。
以适当的水平将高度纯化的Reb M(＞99％)直接称量到40mL玻璃瓶中，因此最终浓度为500ppm，即20mg加入到40mL中。接下来，在同一小瓶中直接称量添加剂(如果存在的话)。最后，加入pH 1.7缓冲液的总体积，并将溶液混合溶解。
在每个时间点，将溶液以10,000rpm离心2分钟，以从分析中除去任何不可溶物质，即使都是不可视的。将一等份上清液直接稀释，用于通过UHPLC-UV进行分析。利用在水中的三氟乙酸和乙腈，在基于C18的反相色谱柱上在升高的温度下在梯度条件下进行色谱分析。利用设置为210nm的UV检测器检测SG。使用高纯度(＞99％)Reb A标准作为参考溶液，应用线性校准曲线。
表3中呈现的结果表明，即使在相对较低的水平下，如在使用水平下，SC通常也能提高SG的化学稳定性。
表3
实施例3
为此研究总共制备了12种溶液：0.1％RA95、RM80或Reb M，不含添加剂；0.1％RA95、RM80或Reb M，含有0.1％SC；1％RA95、RM80或Reb M，含有1％SC；以及5％RA95、RM80或Reb M，含有5％SC。为了制备每种溶液，以适当量将RA95、RM80或高度纯化的Reb M(＞99％)称量到玻璃瓶中，随后加入SC材料(源自马黛茶)。将样品在水中稀释，并在80℃下加热以溶解糖苷。在使溶液冷却至室温后，加入磷酸以得到为5％的磷酸最终浓度。在研究期间将样品储存在40℃下。
在每个时间点，将溶液以10,000rpm离心2分钟，以从分析中除去任何不可溶物质(即使都是不可视的)。将一等份上清液稀释到水中，用于通过UHPLC-UV进行分析。利用在水中的三氟乙酸和乙腈，在基于C18的反相色谱柱上在升高的温度下在梯度条件下进行色谱分析。利用设置为210nm的UV检测器检测SG。使用高纯度(＞99％)Reb A标准作为参考溶液，应用线性校准曲线。表4示出了来自在40℃下储存的5％磷酸基质(pH＜＜1)中的RA95(＞99％)研究的回收率数据。表5示出了来自在40℃下储存的5％磷酸基质(pH＜＜1)中的纯Reb M(＞99％)研究的回收率数据。最后，表6示出了来自在40℃下储存的5％磷酸基质(pH＜＜1)中的RM80产品中Reb M的回收率数据。
表4
表4-6中的结果表明甜菊醇糖苷稳定性是浓度依赖性的。也就是说，甜菊醇糖苷(SG)和甜菊醇糖苷稳定化合物的浓度越高，甜菊醇糖苷越稳定。因此，例如，在5wt.％甜菊醇糖苷和5wt.％甜菊醇糖苷稳定化合物的情况下，与更低浓度溶液相比，观察到SG的稳定性显著增加。
实施例4
为此研究制备了3种溶液：0.1％RM80，不含添加剂；0.1％RM80，含有0.1％SC；以及0.1％RM80，含有0.3％SC。为了制备每种溶液，以适当量将RM80称量到玻璃瓶中，随后加入SC材料(源自马黛茶)。将样品在水中稀释，并进行涡旋以溶解糖苷。加入磷酸以得到为0.1％的磷酸最终浓度。在研究期间将样品储存在室温(20℃-24℃)下。
在每个时间点，将溶液以10,000rpm离心2分钟，以从分析中除去任何不可溶物质(即使都是不可视的)。将一等份上清液稀释到水中，用于通过UHPLC-UV进行分析。利用在水中的三氟乙酸和乙腈，在基于C18的反相色谱柱上在升高的温度下在梯度条件下进行色谱分析。利用设置为210nm的UV检测器检测SG。使用高纯度(＞99％)Reb A标准作为参考溶液，应用线性校准曲线。表7示出了来自在室温(约22℃)下的0.1％磷酸基质中的使用水平(例如，0.1％RM80)研究的数据。表8是与不含稳定性增强化合物的溶液相比，每个时间点处稳定性增强的统计学评估。
这些结果表明，即使在使用水平下，SC也能保护SG免受酸水解。结果还表明，超过复合所有SG所需浓度的额外SC可能不具有额外益处。例如，0.3％SC具有与0.1％SC相同的保护效果。
实施例5
使用迷迭香酸为此研究制备了4种溶液：0.1％Reb M，不含添加剂；0.1％Reb M，含有0.1％SC；1％Reb M，含有1％SC；以及5％Reb M，含有5％SC。使用菊苣酸为此研究制备了4种溶液：0.1％Reb M，不含添加剂；0.1％Reb M，含有0.1％SC；1％Reb M，含有1％SC；以及5％Reb M，含有5％SC。为了制备每种溶液，以适当量将高度纯化的Reb M(＞99％)称量到玻璃瓶中，随后加入SC材料(迷迭香酸或菊苣酸)。将样品在水中稀释，并在80℃下加热以溶解糖苷。在使溶液冷却至室温后，加入磷酸以得到为5％的磷酸最终浓度。在研究期间将样品储存在40℃下。
在每个时间点，将溶液以10,000rpm离心2分钟，以从分析中除去任何不可溶物质(即使都是不可视的)。将一等份上清液稀释到水中，用于通过UHPLC-UV进行分析。利用在水中的三氟乙酸和乙腈，在基于C18的反相色谱柱上在升高的温度下在梯度条件下进行色谱分析。利用设置为210nm的UV检测器检测SG。使用高纯度(＞99％)Reb M标准作为参考溶液，应用线性校准曲线。
表9和表10示出了分别在迷迭香酸和菊苣酸存在下，来自在40℃下储存的5％磷酸基质(pH＜＜1)中的Reb M(＞99％)研究的回收率数据。
实施例6
甜菊醇糖苷稳定化合物本身随着时间的推移经受降解。SC可以在酸性条件下水解形成咖啡酸。当暴露于氧气时，SC也可以随着时间的推移而氧化。为了研究酸性降解，还在如表11中列出的相同实验中对SC进行了定量。SC比SG更耐酸性水解，但稳定性的提高遵循相同的趋势。在更高的浓度下，SG和SC两者都更有效地稳定。
实施例7
为了研究SE的氧化稳定性，在pH 7缓冲液中制备了500ppm的SC溶液。在pH 7缓冲液中制备了含有500ppm RM80的500ppm SC的第二溶液。将这两种溶液剧烈搅拌，并暴露于大气中的氧气持续72天。结果总结在下表12中，并证明SG的存在将减缓SC的氧化降解。
表12
实验
时间(天)
0
72
0.05％SC
SC回收率％
100％
17％
0.05％SC 0.05％RM80
SC回收率％
100％
48％
实施例8
据推测，甜菊醇糖苷(SG)和甜菊醇糖苷稳定化合物(SC)将在溶液中形成紧密结合的复合物。如果这是真的，则复合物的磁性环境将与溶解在水中的单个化合物大不相同。这将导致它们各自的1H NMR谱的显著偏移(Δδ＞0.02ppm)。
为此研究总共准备了四种样品，并且如下所列出。将每种样品完全溶解在水中，如下所述加热或不加热，在-80℃下快速冷冻，并且然后放在冻干机上直到干燥。随后在室温下将干燥粉末溶解在D2O中，并通过1H和13C NMR进行分析。样品1的浓度明显低于样品2-4，因为当SC不存在时，Reb M在D2O中的溶解度低得多，并且这导致光谱质量相对较差。
样品1：在1mL水中的10mg Reb M-在H2O中加热
样品2：在1mL水中的10mg SE-在H2O中加热
样品3：在1mL水中的10mg Reb M+10mg SE-在H2O中加热
样品4：在3mL水中的10mg Reb M+10mg SE-未在H2O中加热
对SC分子使用以下编号规则：
在这种情况下，单咖啡酰奎尼酸和二咖啡酰奎尼酸。观察到的信号是异构体混合物的总和。1H NMR数据在表13(示出了在SC的咖啡酸部分中具有显著偏移的1H NMR数据)和表14(示出了在SG的甜菊醇核心中具有显著偏移的1H NMR数据)中示出。
表13
表14
当分子混合物存在时，SC信号和SG信号两者中都存在相当大量的偏移。当化合物在水中一起加热时，与它们在室温下混合时，这种偏移是相似的，但当加热时稍微大一些。显示最强偏移的部分是SC的咖啡酸部分和SG的甜菊醇主链，这表明每个分子的最疏水区域之间存在强相互作用，使得葡萄糖和奎尼酸部分自由地与水相互作用，从而可能增加SG和SC的稳定性。
本发明提供了以下实施方案，其编号不应被解释为指定重要性级别：
实施方案1涉及一种组合物，包含：
甜菊醇糖苷；和
其量有效减少所述甜菊醇糖苷降解的甜菊醇糖苷稳定化合物；
其中所述甜菊醇糖苷稳定化合物是至少一种化合物及其异构体，选自由以下组成的组：
咖啡酸、咖啡酸的酯、咖啡酸和奎尼酸的酯、包含单一咖啡酸部分的咖啡酸和奎尼酸的酯(例如，绿原酸、隐绿原酸和新绿原酸；本文提供了各自的结构)、包含多于一个咖啡酸部分的咖啡酸和奎尼酸的酯(例如，1，3-二咖啡酰奎尼酸、1，4-二咖啡酰奎尼酸、1，5-二咖啡酰奎尼酸、3，4-二咖啡酰奎尼酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸和4，5-二咖啡酰奎尼酸；本文提供了各自的结构)；
阿魏酸、阿魏酸的酯、阿魏酸和奎尼酸的酯、包含单一阿魏酸部分的阿魏酸和奎尼酸的酯、包含多于一个阿魏酸部分的阿魏酸和奎尼酸的酯；
3-(3，4-二羟基苯基)乳酸、3-(3，4-二羟基苯基)乳酸衍生物、3-(3，4-二羟基苯基)乳酸的酯、3-(3，4-二羟基苯基)乳酸衍生物的酯，
奎尼酸、奎尼酸衍生物、奎尼酸的酯、奎尼酸衍生物的酯；
对香豆酸、对香豆酸的酯、对香豆酸和奎尼酸的酯、包含单一对香豆酸部分的对香豆酸和奎尼酸的酯、包含多于一个对香豆酸部分的对香豆酸和奎尼酸的酯；
芥子酸、芥子酸的酯、芥子酸和奎尼酸的酯、包含单一芥子酸部分的芥子酸和奎尼酸的酯、包含多于一个芥子酸部分的芥子酸和奎尼酸的酯；
酒石酸、酒石酸衍生物、酒石酸的酯、酒石酸衍生物的酯，以及
3-O-阿魏酰奎尼酸、4-O-阿魏酰奎尼酸、5-O-阿魏酰奎尼酸、3，4-二阿魏酰奎尼酸、3，5-二阿魏酰奎尼酸、4，5-二阿魏酰奎尼酸。
实施方案2涉及如实施方案1所述的组合物，其中所述组合物是含水组合物。
实施方案3涉及如实施方案1-2所述的组合物，其中所述有效减少所述甜菊醇糖苷降解的甜菊醇糖苷稳定化合物的量是使得当稳定化的甜菊醇糖苷组合物经受在40℃下于5％磷酸中储存7天时，保留至少约10wt.％初始甜菊醇糖苷的量。
实施方案4涉及如实施方案1-3所述的组合物，其中所述甜菊醇糖苷包含至少约0.03wt.％的甜菊醇糖苷。
实施方案5涉及如实施方案1-3所述的组合物，其中所述甜菊醇糖苷包含至少约0.6wt.％的甜菊醇糖苷。
实施方案6涉及如实施方案1-5所述的组合物，其中所述组合物包含1∶0.3至1∶3重量比的甜菊醇糖苷与甜菊醇糖苷稳定化合物。
实施方案7涉及如实施方案1-6所述的组合物，其中所述组合物具有小于约4的pH。
实施方案8涉及如实施方案1-6所述的组合物，其中所述组合物具有小于约1的pH。
实施方案9涉及如实施方案1-8所述的组合物，其中所述组合物在室温下储存。
实施方案10涉及如实施方案1-8所述的组合物，其中所述组合物在约4℃下储存。
实施方案11涉及如实施方案1-10所述的组合物，其中所述甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷A或莱鲍迪苷M。
实施方案12涉及一种包含如实施方案1-11所述的组合物的饮料浓缩物产品，其中所述甜菊醇糖苷包含约1,800ppm至约10,000ppm之间的甜菊醇糖苷。
实施方案13涉及一种包含如实施方案1-11所述的组合物的液态水增强剂产品，其中所述甜菊醇糖苷包含约1.5wt.％至约3.5wt.％之间的甜菊醇糖苷。
实施方案14涉及一种包含如实施方案1-11所述的组合物的液体甜味剂，其中所述甜菊醇糖苷包含约1.0wt.％至约10wt.％之间的甜菊醇糖苷。
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