阅读说明：本技术 用于抑制肝脂肪合成的食品组合物 (Food composition for inhibiting liver fat synthesis ) 是由 井上启 木村久美 橘伸彦 于 2020-02-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供作为具有抑制肝脂肪合成作用成分的选自11种二肽(Ala-Gly、His-Asn、His-Ser、His-Thr、His-Trp、Val-Met、Trp-Glu、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-Ser及Tyr-Tyr)及25种三肽(Val-Ile-Leu、Gly-Ser-Leu、Val-Leu-Gln、His-Ala-Gln、Arg-Ala-Val、Lys-Leu-Gly、Ile-Val-Ile、Lys-Pro-Ile、Leu-Val-Ile、Leu-Arg-Asp、Gln-Glu-Glu、Ser-Gly-Glu、Arg-Trp-Phe、Asp-Phe-Phe、Asp-Val-Phe、Pro-Phe-Tyr、Phe-Ile-Arg、Asn-Gly-Arg、Ile-Ile-Pro、Ile-Asp-Arg、Ile-His-Arg、Ile-Asp-Arg、Asn-Arg-Val、Ser-Ser-Val及Val-Phe-Val)中的一种或两种以上的肽。所述肽可以在用于抑制肝脂肪合成的食品组合物及肝脂肪合成抑制剂中使用。(The present invention provides a composition having an inhibitory activity against hepatic fat synthesis, which is selected from 11 dipeptides (Ala-Gly, His-Asn, His-Ser, His-Thr, His-Trp, Val-Met, Trp-Glu, Trp-Lys, Tyr-Ser and Tyr-Tyr) and 25 tripeptides (Val-Ile-Leu, Gly-Ser-Leu, Val-Leu-Gln, His-Ala-Gln, Arg-Ala-Val, Lys-Leu-Gly, Ile-Val-Ile, Lys-Pro-Ile, Leu-Val-Ile, Leu-Arg-Asp, Gln-Glu-Glu, Ser-Gly-Glu, Arg-Trp-Phe, Asp-Phe-Phe, Asp-Val-Phe-Phe, Pro-Phe-Tyr, Leu-Phe-Tyr, Phe-Ile-Arg, Asn-Gly-Arg, Ile-Ile-Pro, Ile-Asp-Arg, Ile-His-Arg, Ile-Asp-Arg, Asn-Arg-Val, Ser-Ser-Val and Val-Phe-Val). The peptide can be used in food compositions for inhibiting liver fat synthesis and liver fat synthesis inhibitors.)

用于抑制肝脂肪合成的食品组合物

相关申请

本申请要求2019年2月25日向日本专利局申请的申请号2019-31375号及申请号2019-31376号的优先权的利益。作为优先权基础的申请以其全部通过说明引用来源而作为本说明书的一部分。

技术领域

本发明涉及具有肝脂肪合成抑制作用的肽，含有该肽的用于抑制肝脂肪合成的食品组合物，及肝脂肪合成抑制剂，及抑制肝脂肪合成的方法。

背景技术

已知脂肪肝引起与糖尿病·心血管疾病的恶性循环。作为脂肪肝的诱因，肝脂肪合成的增加起了重要作用，已知脂肪合成酶作为其控制机制。

对于脂肪肝的预防及改善而言，抑制肝中脂质的合成和使脂质代谢亢进而抑制蓄积是有效的。

近年来，对各种源自天然的功能性成分的探索正在推进，存在对于可作用于脂质代谢而使肝中脂质量降低的成分的报告。在专利文献1及2中，公开了大豆蛋白质或植物的发芽物的干燥破碎物具有使血中的中性脂肪降低的作用。然而，在这些文献中，尚未确认到对于肝中脂肪蓄积的抑制作用。

另外发现，植物性蛋白的摄取通过抑制脂肪合成酶的表达而改善脂肪肝，进一步发现，其肽分解产物在肝细胞中引起脂肪合成酶表达的抑制(非专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO2002/026243号

专利文献2：日本特开2006-69943号公报

非专利文献

非专利文献1：Watanabe H，Inaba Y，Kimura K，Asahara SI，Kido Y，MatsumotoM，Motoyama T，Tachibana N，Kaneko S，Kohno M，Inoue H.Dietary Mung Bean ProteinReduces Hepatic Steatosis，Fibrosis，and Inflammation in Male Mice with Diet-Induced，Nonalcoholic Fatty Liver Disease.J Nutr.2017 Jan；147(1)：52-60.doi：10.3945/jn.116.231662.

发明内容

发明要解决的问题

在现有技术中，没有任何关于显示肝脂肪合成抑制效果成分的公开。

在一种实施方式中，本发明的目的在于提供具有肝脂肪合成抑制作用的成分。在一些实施方式中，本发明的目的在于提供包含具有肝脂肪合成抑制作用的成分的食品组合物。在其它实施方式中，本发明的目的在于提供包含具有肝脂肪合成抑制作用的成分的肝脂肪合成抑制剂。在另一些实施方式中，本发明的目的在于提供抑制肝脂肪合成的方法。

解决问题的手段

本发明人对于解决上述课题进行了深入研究，结果发现特定的二肽及三肽具有肝脂肪合成抑制作用，从而完成了本发明。

即，本发明涉及

(1)用于抑制肝脂肪合成的食品组合物，其含有作为有效成分的选自Ala-Gly、His-Asn、His-Ser、His-Thr、His-Trp、Val-Met、Trp-Glu、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-Ser，Tyr-Tyr，Val-Ile-Leu、Gly-Ser-Leu、Val-Leu-Gln、His-Ala-Gln、Arg-Ala-Val、Lys-Leu-Gly、Ile-Val-Ile、Lys-Pro-Ile、Leu-Val-Ile、Leu-Arg-Asp、Gln-Glu-Glu、Ser-Gly-Glu、Arg-Trp-Phe、Asp-Phe-Phe、Asp-Val-Phe、Pro-Phe-Tyr、Phe-Ile-Arg、Asn-Gly-Arg、Ile-Ile-Pro、Ile-Asp-Arg、Ile-His-Arg、Ile-Asp-Arg、Asn-Arg-Val、Ser-Ser-Val及Val-Phe-Val中的一种或两种以上的肽，

(2)用于抑制肝脂肪合成的食品组合物，其含有作为有效成分的选自Ala-Gly、His-Asn、His-Ser、His-Thr、His-Trp、Val-Met、Trp-Glu、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-Ser，及Tyr-Tyr中的一种或两种以上的二肽，

(3)用于抑制肝脂肪合成的食品组合物，其含有作为有效成分的选自Val-Ile-Leu、Gly-Ser-Leu、Val-Leu-Gln、His-Ala-Gln、Arg-Ala-Val、Lys-Leu-Gly、Ile-Val-Ile、Lys-Pro-Ile、Leu-Val-Ile、Leu-Arg-Asp、Gln-Glu-Glu、Ser-Gly-Glu、Arg-Trp-Phe、Asp-Phe-Phe、Asp-Val-Phe、Pro-Phe-Tyr、Phe-Ile-Arg、Asn-Gly-Arg、Ile-Ile-Pro、Ile-Asp-Arg、Ile-His-Arg、Ile-Asp-Arg、Asn-Arg-Val、Ser-Ser-Val及Val-Phe-Val中的一种或两种以上的三肽，

(4)肝脂肪合成抑制剂，其含有作为有效成分的选自Ala-Gly、His-Asn、His-Ser、His-Thr、His-Trp、Val-Met、Trp-Glu、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-Ser，Tyr-Tyr，Val-Ile-Leu、Gly-Ser-Leu、Val-Leu-Gln、His-Ala-Gln、Arg-Ala-Val、Lys-Leu-Gly、Ile-Val-Ile、Lys-Pro-Ile、Leu-Val-Ile、Leu-Arg-Asp、Gln-Glu-Glu、Ser-Gly-Glu、Arg-Trp-Phe、Asp-Phe-Phe、Asp-Val-Phe、Pro-Phe-Tyr、Phe-Ile-Arg、Asn-Gly-Arg、Ile-Ile-Pro、Ile-Asp-Arg、Ile-His-Arg、Ile-Asp-Arg、Asn-Arg-Val、Ser-Ser-Val及Val-Phe-Val中的一种或两种以上的肽，

(5)肝脂肪合成抑制剂，其含有作为有效成分的选自Ala-Gly、His-Asn、His-Ser、His-Thr、His-Trp、Val-Met、Trp-Glu、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-Ser，及Tyr-Tyr中的一种或两种以上的二肽，

(6)肝脂肪合成抑制剂，其含有作为有效成分的选自Val-Ile-Leu、Gly-Ser-Leu、Val-Leu-Gln、His-Ala-Gln、Arg-Ala-Val、Lys-Leu-Gly、Ile-Val-Ile、Lys-Pro-Ile、Leu-Val-Ile、Leu-Arg-Asp、Gln-Glu-Glu、Ser-Gly-Glu、Arg-Trp-Phe、Asp-Phe-Phe、Asp-Val-Phe、Pro-Phe-Tyr、Phe-Ile-Arg、Asn-Gly-Arg、Ile-Ile-Pro、Ile-Asp-Arg、Ile-His-Arg、Ile-Asp-Arg、Asn-Arg-Val、Ser-Ser-Val及Val-Phe-Val中的一种或两种以上的三肽。

发明的效果

在一种实施方式中，根据本发明可以提供具有肝脂肪合成抑制作用的肽。在一些实施方式中，根据本发明可以提供将具有肝脂肪合成抑制作用的特定的肽作为有效成分的食品组合物。在其它实施方式中，可以提供含有特定的肽作为有效成分的肝脂肪合成抑制剂。另外，在其它实施方式中，可以提供抑制肝脂肪合成的方法。

附图说明

[图1]在1次筛选中，制作Fasn报告小鼠的方法的参考图。

[图2]示出对于二肽文库(#1～#50)的二肽的1次筛选的高斯荧光素酶(Gaussialuciferase)的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图3]示出对于二肽文库(#51～#100)的二肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图4]示出对于二肽文库(#101～#150)的二肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图5]示出对于二肽文库(#151～#200)的二肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图6]示出对于二肽文库(#201～#250)的二肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图7]示出对于二肽文库(#251～#300)的二肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图8]示出对于二肽文库(#301～#336)的二肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图9]示出测定了22个二肽的2次筛选的Fasn基因表达量的结果的图。黑色柱状图显示了与空白(记载为Veh)相比为显著的Fasn基因表达量降低的样品。

[图10]示出测定了11个二肽的3次筛选的Fasn基因表达量的结果的图。黑色柱状图显示了与空白(记载为Veh)相比为显著的Fasn基因表达量降低的样品。

[图11]示出测定了11个二肽的3次筛选的Fasn基因表达量的结果的图。黑色柱状图显示了与空白(记载为Veh)相比为显著的Fasn基因表达量降低的样品。

[图12]示出对于从α-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽文库(#1～#50)的三肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图13]示出对于从α-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽文库(#51～#100)的三肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图14]示出对于从α-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽文库(#101～#150)的三肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图15]示出对于从α-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽文库(#151～#200)的三肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图16]示出对于从α-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽文库(#201～#250)的三肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图17]示出对于从α-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽文库(#251～#300)的三肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图18]示出对于从α-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽文库(#301～#350)的三肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图19]示出对于从α-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽文库(#351～#404)的三肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图20]示出在从α-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽的研究中，测定了35种三肽的2次筛选的Fasn基因表达量的结果的图。黑色柱状图显示了与空白(记载为Veh)相比为显著的Fasn基因表达量降低的样品。

[图21]示出在从α-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽的研究中，测定了32种三肽的2次筛选的Fasn基因表达量的结果的图。黑色柱状图显示了与空白(记载为Veh)相比为显著的Fasn基因表达量降低的样品。

[图22]示出在从α-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽的研究中，测定了9种三肽的3次筛选的Fasn基因表达量的结果的图。黑色柱状图显示了与空白(记载为Veh)相比为显著的Fasn基因表达量降低的样品。

[图23]示出在从α-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽的研究中，测定了8种三肽的3次筛选的Fasn基因表达量的结果的图。黑色柱状图显示了与空白(记载为Veh)相比为显著的Fasn基因表达量降低的样品。

[图24]示出在从α-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽的研究中，测定了8种三肽的3次筛选的Fasn基因表达量的结果的图。黑色柱状图显示了与空白(记载为Veh)相比为显著的Fasn基因表达量降低的样品。

[图25]示出对于从α′/β-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽文库(#1～#50)的三肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图26]示出对于从α′/β-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽文库(#51～#95)的三肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图27]示出对于从α′/β-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽文库(#96～#140)的三肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图28]示出对于从α′/β-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽文库(#141～#183)的三肽的1次筛选的高斯荧光素酶的活性，测定了其相对于空白的相对活性值的结果的图。各样品的相对活性值以圆圈符号表示，实心圆示出了与空白相比显示了显著低值的样品。

[图29]示出在从α′/β-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽的研究中，测定了30种三肽的2次筛选的Fasn基因表达量的结果的图。黑色柱状图显示了与空白(记载为Veh)相比为显著的Fasn基因表达量降低的样品。

[图30]示出在从α＇/β-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽的研究中，测定了32种三肽的2次筛选的Fasn基因表达量的结果的图。黑色柱状图显示了与空白(记载为Veh)相比为显著的Fasn基因表达量降低的样品。

[图31]示出在从α＇/β-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽的研究中，测定了8种三肽的3次筛选的Fasn基因表达量的结果的图。黑色柱状图显示了与空白(记载为Veh)相比为显著的Fasn基因表达量降低的样品。

[图32]示出在从α＇/β-8S球蛋白的氨基酸序列构想的三肽的研究中，测定了7种三肽的3次筛选的Fasn基因表达量的结果的图。黑色柱状图显示了与空白(记载为Veh)相比为显著的Fasn基因表达量降低的样品。

具体实施方式

在本说明书中，术语“约”是指±10％、优选为±5％的范围。另外，作为其范围的边界值的数值，视为记载在本说明书中。

(具有肝脂肪合成抑制作用的肽)

在一些实施方式中，本发明提供具有肝脂肪合成抑制作用的肽。更具体而言，本实施方式的肽为选自11种二肽(Ala-Gly、His-Asn、His-Ser、His-Thr、His-Trp、Val-Met、Trp-Glu、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-Ser及Tyr-Tyr)及25种三肽(Val-Ile-Leu、Gly-Ser-Leu、Val-Leu-Gln、His-Ala-Gln、Arg-Ala-Val、Lys-Leu-Gly、Ile-Val-Ile、Lys-Pro-Ile、Leu-Val-Ile、Leu-Arg-Asp、Gln-Glu-Glu、Ser-Gly-Glu、Arg-Trp-Phe、Asp-Phe-Phe、Asp-Val-Phe、Pro-Phe-Tyr、Phe-Ile-Arg、Asn-Gly-Arg、Ile-Ile-Pro、Ile-Asp-Arg、Ile-His-Arg、Ile-Asp-Arg、Asn-Arg-Val、Ser-Ser-Val及Val-Phe-Val)中的一种或两种以上的肽。在一些实施方式中，本实施方式的肽包含一种以上的二肽。在其它实施方式中，本实施方式的肽包含一种以上的三肽。在另一些实施方式中，本实施方式的肽为一种以上的二肽及一种以上的三肽的混合物。

需要说明的是，在本说明书中，上述二肽及三肽有时用如下的氨基酸的1字母缩略词的符号表示。

Ala-Gly：AG，His-Asn：HN，His-Ser：HS，His-Thr：HT，His-Trp：HW，Val-Met：VM，Trp-Glu：WE，Trp-Lys：WK，Tyr-Lys：YK，Tyr-Ser：YS，Tyr-Tyr：YY，Val-Ile-Leu：VIL，Gly-Ser-Leu：GSL，Val-Leu-Gln：VLQ，His-Ala-Gln：HAQ，Arg-Ala-Val：RAV，Lys-Leu-Gly：KLG，Ile-Val-Ile：IVI，Lys-Pro-Ile：KPI，Leu-Val-Ile：LVI，Leu-Arg-Asp：LRD，Gln-Glu-Glu：QEE，Ser-Gly-Glu：SGE，Arg-Trp-Phe：RWF，Asp-Phe-Phe：DFF，Asp-Val-Phe：DVF，Pro-Phe-Tyr：PFY，Phe-Ile-Arg：FIR，Asn-Gly-Arg：NGR，Ile-Ile-Pro：IIP，Ile-Asp-Arg：IDR，Ile-His-Arg：IHR，Ile-Asp-Arg：IDR，Asn-Arg-Val：NRV，Ser-Ser-Val：SSV，Val-Phe-Val：VFV。

作为本实施方式的肽发挥肝脂肪合成抑制作用的机理，推定为本实施方式的肽通过抑制作为在肝内从头(de novo)合成的脂肪酸的合成酶的脂肪合成酶(Fatty acidsynthase，FAS)的mRNA(Fasn)的表达，由此抑制脂肪合成。

肝脂肪合成抑制作用可通过如下而确认：例如在后述的“(2次筛选方法)”中记载的方法中，与无添加肽组相比，mRNA(Fasn)的量显示显著低值。

本实施方式的肽可以从氨基酸合成，也可以将蛋白质水解而获得。作为将蛋白质水解的方法，可以举出：基于蛋白酶的水解、基于酸的水解、基于碱的水解等，优选为基于蛋白酶的水解。在一些实施方式中，本实施方式的肽为合成肽。在其它实施方式中，本实施方式的肽为将蛋白质水解而得到的肽。进一步在具体实施方式中，本实施方式的肽为利用蛋白酶将蛋白质水解而得到的肽。

作为肽的原料，可以使用植物性蛋白质、动物性蛋白质，例如：作为植物性蛋白质的原料，可以举出大豆、豌豆、绿豆、鹰嘴豆等豆类，米、玉米、小麦等谷类，杏仁、腰果、核桃、开心果、榛子、夏威夷果等坚果类等，作为动物性蛋白质的原料，可列举：牛肉、猪肉、鸡肉、蛋、奶等。作为具体的肽的原料的例子，可列举源自大豆、豌豆、绿豆、鹰嘴豆等豆类的蛋白质，进一步作为具体例子，可列举源自绿豆的蛋白质。

(蛋白酶)

在为基于蛋白酶的蛋白质水解的情况，以上述蛋白质的浆料或水溶液为底物进行蛋白酶处理。在此使用的蛋白酶不限于动物来源、植物来源或者微生物来源，可以从蛋白酶的分类中被分类为“金属蛋白酶”、“酸性蛋白酶”、“硫醇蛋白酶”、“丝氨酸蛋白酶”的蛋白酶、优选为被分类为“金属蛋白酶”、“硫醇蛋白酶”、“丝氨酸蛋白酶”的蛋白酶中适当选择。

该蛋白酶的分类为在酶科学的领域中通常进行的基于活性中心的氨基酸的种类的分类方法。作为各代表，在“金属蛋白酶”中可列举：芽孢杆菌(Bacillus)中性蛋白酶，链霉菌(Streptomyces)中性蛋白酶，曲霉(Aspergillus)中性蛋白酶，“Thermoase”等，“酸性蛋白酶”中可列举：胃蛋白酶、曲霉(Aspergillus)酸性蛋白酶、“Smithum AP”等，“硫醇蛋白酶”中可列举：菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等，“丝氨酸蛋白酶”中可列举：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、链霉菌(Streptomyces)碱性蛋白酶、“Alcalase”、“Bioprase”等。除此以外的酶也可以通过作用pH、与抑制剂的反应性确认其分类。由于在活性中心不同的酶之间，与底物的作用部位大大不同，因此，可以减少“切割残留”，有效地得到酶分解物。或者可以通过组合使用不同来源(来源生物)的酶而更有效地制造酶分解物。

蛋白酶处理的反应pH、反应温度配合使用的蛋白酶的特性设定即可，通常反应pH在最适pH附近进行即可，反应温度在最适温度附近进行即可。可以在大致反应温度为20～80℃、优选为40～60℃进行反应。反应之后，以对使酶失活而言足够的温度(60～170℃左右)进行加热，使残存的酶活性失活。

蛋白酶处理之后的反应液可以直接或浓缩而使用，其中，通常可以杀菌进行喷雾干燥，冷冻干燥等并以干燥粉末的状态利用。杀菌优选为加热杀菌，加热温度优选为110～170℃，进一步优选130～170℃。加热时间优选为3～20秒。另外，也可以事先将反应液调整为任意pH，也可以将pH调整时产生的沉淀物、悬浊物通过离心、过滤等除去。另外，也可以进一步通过活性炭、吸附树脂进行纯化。

(基于酸或碱的水解)

在蛋白质水解的基于酸或碱的水解中，底物浓度、酶量、处理温度、pH、时间等条件可以适当设定。

本实施方式的肽可以用于抑制肝脂肪合成的食品组合物的制造。另外，本实施方式的肽可以用于肝脂肪合成抑制剂的制造。

(用于抑制肝脂肪合成的食品组合物)

在一些实施方式中，本发明提供包含在上述“(具有肝脂肪合成抑制作用的肽)”的实施方式中记载的肽的用于抑制肝脂肪合成的食品组合物。更具体而言，本实施方式的用于抑制肝脂肪合成的食品组合物的特征为含有作为有效成分的选自11种二肽(Ala-Gly、His-Asn、His-Ser、His-Thr、His-Trp、Val-Met、Trp-Glu、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-Ser及Tyr-Tyr)及25种三肽(Val-Ile-Leu、Gly-Ser-Leu、Val-Leu-Gln、His-Ala-Gln、Arg-Ala-Val、Lys-Leu-Gly、Ile-Val-Ile、Lys-Pro-Ile、Leu-Val-Ile、Leu-Arg-Asp、Gln-Glu-Glu、Ser-Gly-Glu、Arg-Trp-Phe、Asp-Phe-Phe、Asp-Val-Phe、Pro-Phe-Tyr、Phe-Ile-Arg、Asn-Gly-Arg、Ile-Ile-Pro、Ile-Asp-Arg、Ile-His-Arg、Ile-Asp-Arg、Asn-Arg-Val、Ser-Ser-Val及Val-Phe-Val)中的一种或两种以上的肽。在一些实施方式中，本实施方式的用于抑制肝脂肪合成的食品组合物中含有的肽包含一种以上的二肽。在其它实施方式中，本实施方式的用于抑制肝脂肪合成的食品组合物中含有的肽包含一种以上的三肽。在另一些实施方式中，本实施方式的用于抑制肝脂肪合成的食品组合物中含有的肽为一种以上的二肽及一种以上的三肽的混合物。

本实施方式的用于抑制肝脂肪合成的食品组合物可以以补充剂(supplement)的形式，食品添加剂的形式，或者添加到食品中的形式，仅利用上述肽，或根据需要适当与其它原材料混合而制造。所述食品组合物以补充剂的形式提供时，可以以液体、粉末、颗粒、片剂、药片(Tablet)、胶囊等各种形式使用。所述食品组合物以食品添加剂的形式提供时，可以以液体、糊、凝胶、粉末、颗粒、固态状等各种形式使用。所述食品组合物以在食品中混合的形式提供时，与饼干、蛋糕、面包、食物棒、肉产品等固态状食品进行混合使用也不存在障碍，溶解于水而制成饮料或与如酸奶、布丁、果冻的流动状，半固态状食品进行混合也没有问题。对在本实施方式的食品组合物中混合的其它原料而言，只要是可以作为食品添加剂、食品使用的那些即可，没有特别限定。作为其它原料的例子，可列举：醋、豆酱、酱油及氨基酸等调味料；乙酸、柠檬酸、苹果酸及乳酸等酸味剂；阿斯巴甜、三氯蔗糖、乙酰磺胺酸钾及甜菊提取物等甜味料；苦味剂；香辛料；防腐剂；色素；香料；盐类；葡萄糖，果糖，蔗糖及乳糖等糖类；油脂；抗氧剂；维生素类；矿物质类；稳定剂；增稠剂；增量剂；果胶、结冷胶、琼脂及明胶等胶凝剂；及乳糖、淀粉、糊精及纤维素等赋形剂等。在更具体的实施方式中，本实施方式的食品组合物为补充剂的形式。作为进一步的具体例子，可列举：在胶囊中封入仅上述肽的补充剂、在上述肽中添加赋形剂而制成粉末、颗粒制剂的补充剂、在上述肽中添加赋形剂而压片的片剂的补充剂、在上述肽中添加胶凝剂而装袋的果冻状的补充剂等。

本实施方式的用于抑制肝脂肪合成的食品组合物中的上述肽的含量没有特别限定，可列举例如：相对于食品组合物约0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1、1.2、1.5、1.7、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、7、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、92、95、97、98、99、100重量％等。另外，可以为这些值中的任一个作为上限、下限的任意范围的含量。另外，本实施方式的用于抑制肝脂肪合成的食品组合物的摄取量没有特别限定，可列举例如：作为食品组合物中的上述肽的量，每1次为约0.001～100mg/kg体重，例如约0.01～50mg/kg体重，约0.1～25mg/kg体重，约0.5～10mg/kg体重等。

(肝脂肪合成抑制剂)

在一些实施方式中，本发明提供包含上述“(具有肝脂肪合成抑制作用的肽)”的实施方式中记载的肽的肝脂肪合成抑制剂。更具体而言，本实施方式的肝脂肪合成抑制剂的特征为含有作为有效成分的选自11种二肽(Ala-Gly、His-Asn、His-Ser、His-Thr、His-Trp、Val-Met、Trp-Glu、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-Ser及Tyr-Tyr)及25种三肽(Val-Ile-Leu、Gly-Ser-Leu、Val-Leu-Gln、His-Ala-Gln、Arg-Ala-Val、Lys-Leu-Gly、Ile-Val-Ile、Lys-Pro-Ile、Leu-Val-Ile、Leu-Arg-Asp、Gln-Glu-Glu、Ser-Gly-Glu、Arg-Trp-Phe、Asp-Phe-Phe、Asp-Val-Phe、Pro-Phe-Tyr、Phe-Ile-Arg、Asn-Gly-Arg、Ile-Ile-Pro、Ile-Asp-Arg、Ile-His-Arg、Ile-Asp-Arg、Asn-Arg-Val、Ser-Ser-Val及Val-Phe-Val)中的一种或两种以上的肽。在一些实施方式中，本实施方式的肝脂肪合成抑制剂中含有的肽包含一种以上的二肽。在其它实施方式中，本实施方式的肝脂肪合成抑制剂中含有的肽包含一种以上的三肽。在另一些实施方式中，本实施方式的肝脂肪合成抑制剂中含有的肽为一种以上的二肽及一种以上的三肽的混合物。

本实施方式的肝脂肪合成抑制剂可以仅利用上述肽，或根据需要适当与其它原材料混合而制造。典型地，本实施方式的肝脂肪合成抑制剂可以为药物组合物。

本实施方式的肝脂肪合成抑制剂的剂型没有特别限定，可列举例如：颗粒剂、细粒剂、片剂等口服施用剂；液剂，即用即溶型粉末剂等注射用剂；软膏、液剂、膏剂、凝胶剂等经皮用剂；栓剂等。

本实施方式的肝脂肪合成抑制剂的施用方法没有特别限定，可列举例如：口服施用、静脉内施用、肌内施用、患部局部施用、经皮施用、经直肠施用等。作为更具体的施用方法的例子，可列举口服施用。

本实施方式的肝脂肪合成抑制剂除了作为有效成分的上述肽以外，也可以包含药学上允许的其它原料，例如：药学上允许的载体、赋形剂、稀释剂、等渗剂、添加剂、崩解剂、粘合剂、稳定剂、包覆剂、分散介质、增量剂、pH缓冲剂、润滑剂、滑行剂、滑润剂、调味剂、甜味剂、增溶剂、溶剂、胶凝剂、营养剂等。利用这样的其它原料，也可以对本实施方式的肝脂肪合成抑制剂的吸收性、血中浓度造成影响，带来体内药物动力学的变化。作为其它原料的具体例子，可列举：水、生理盐水、动物性油脂、植物性油脂、乳糖、淀粉、明胶、结晶性纤维素、树胶、滑石、硬脂酸镁、羟丙基纤维素、聚亚烷基二醇、聚乙烯醇、甘油等。

本实施方式的肝脂肪合成抑制剂中的上述肽的含量没有特别限定，可列举例如：相对于肝脂肪合成抑制剂总量约0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1、1.2、1.5、1.7、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、7、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、92、95、97、98、99、100重量％等。另外，可以为这些值中的任一个作为上限、下限的任意范围的添加量。另外，本实施方式的肝脂肪合成抑制剂的施用量没有特别限定，可列举例如：以上述肽的量计，每1次约0.001mg/kg～100mg/kg体重，例如约0.01～50mg/kg体重，约0.1～25mg/kg体重，约0.5～10mg/kg体重等。

本实施方式的肝脂肪合成抑制剂的施用频率没有特别限定，可列举例如一日1次～多次，例如2、3、4或5次施用或基于点滴注射等的连续施用。

(抑制肝脂肪合成的方法)

在一些实施方式中，本发明提供抑制对象中肝脂肪合成的方法，所述方法包括摄取上述用于抑制肝脂肪合成的食品组合物，或施用上述肝脂肪合成抑制剂。

在本说明书中使用的术语“对象”可以举出人或非人动物，可以例示例如：人、小鼠、大鼠、猴、猪、犬、兔、仓鼠、豚鼠等，但不限于这些。

在一些实施方式中，本实施方式中的术语“对象”为需要抑制肝中脂肪合成的对象。更具体而言，作为需要抑制肝中脂肪合成的症状，可列举例如：肥胖、脂肪肝、脂肪肝炎、肝硬化、糖尿病、心肌病、动脉硬化等。即，在其它实施方式中，本实施方式的方法提供需要肝中脂肪合成抑制的症状的治疗或预防方法。

在其它实施方式中，本发明的方法包括同时进行施用用于治疗或预防肥胖、脂肪肝、脂肪肝炎、肝硬化、糖尿病、心肌病、动脉硬化等症状的药品。对施用时期而言，可以为同时施用，可以为用于抑制肝脂肪合成的食品组合物或肝脂肪合成抑制剂然后药品的顺序，也可以为相反顺序。

上述“用于抑制肝脂肪合成的食品组合物”及“用于抑制肝脂肪合成的食品组合物”的实施方式中的全部记载(例如对形式或剂型，摄取量或施用量等的规定)也适用于本实施方式的方法。

实施例

以下通过记载实施例，由此说明本发明。另外，例中的％为只要没有具体说明，则作为表示容量标准。

(小鼠的饲养方法)

用于采集肝细胞的小鼠为利用12小时的明暗周期管理照明，在恒温环境中，通过自由饮水及自由摄食进行饲养。对于8～12周龄小鼠，在戊巴比妥钠及异氟烷下的麻醉下，通过胶原酶回流进行肝细胞提取。如下述记载这样制作报告小鼠，野生型小鼠使用从日本SLC株式会社购买的不具有导入基因的C57BL/6J小鼠。

(1次筛选方法)

在1次筛选中，为了笼统地确认肝脂肪合成抑制效果是否存在，使用源自导入了作为脂肪酸合成酶的基因的Fasn(Fatty acid synthase)基因的报告小鼠的培养肝细胞，通过测定Fasn启动子活性而评价Fasn基因表达。具体而言，包括肝Fasn报告小鼠的制作、评价等工序。具体方法示于以下。

(肝Fasn报告小鼠的制作)

对于内包Fasn基因位点的全长240.2kb的DNA，在紧接Fasn基因启动子后，***在两末端具有loxP序列(源自噬菌体P1基因组的34bp的DNA序列)的置入了YFP(黄色荧光蛋白)及polyA链的基因表达盒，接着***高斯荧光素酶(GLuc)及polyA链，制作小鼠导入用DNA。将该小鼠导入DNA导入从C57BL/6J小鼠提取的受精卵，作成小鼠A。通过将小鼠A与C57BL/6J小鼠交配而得到后代后，与导入有大鼠白蛋白启动子及Cre重组酶的小鼠B进行交配，将具有小鼠A及小鼠B的两种基因的小鼠作为报告小鼠制作。在该报告小鼠中，通过利用大鼠白蛋白启动子而在肝特异性表达的Cre重组酶，由此在肝组织中特异性地发生置入了YFP(黄色荧光蛋白)及polyA链的基因表达盒的脱落，得到肝组织特异性的基于Fasn基因启动子的高斯荧光素酶(GLuc)表达(图1)。需要说明的是，该Fasn基因启动子引起肝中的脂肪合成酶特异性的高斯荧光素酶(GLuc)的表达增加及活性增加。

(评价)

将从肝Fasn报告小鼠摘出的肝细胞，利用96孔板利用含有1％的青霉素和链霉素，10％牛胎儿血清(FCS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)培养8小时之后，置换为含有1％的青霉素和链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)，使其饥饿(Starvation)16小时。

收集培养基，利用含有胰岛素、LXR(肝X受体)激动剂、氨基酸混合物、各肽(在培养基中为100μg/ml)的培养基培养24小时。另外，将取代肽而添加10％DMSO(二甲亚砜)的细胞也同样地培养24小时。

通过在培养基中添加胰岛素、LXR激动剂、氨基酸混合物进行培养，使促进参与脂肪酸合成的Fasn基因的表达的启动子被活化。由于如果启动子被活化，则高斯荧光素酶(GLuc)基因表达，因此测定其活性。

对高斯荧光素酶的活性而言，将腔肠素(Coelenterazine)作为发光底物，按照Biochem.Biophys.Res.Commun.365，96-101(2007)所述的方法利用光度计LB941(Berthold公司制)测定发光活性。

分别测定肽添加组的测定值，或仅添加10％DMSO的测定值(无添加肽组)，计算在将无添加肽组的测定值作为1的情况下的肽添加组的相对活性并进行评价。

需要说明的是，显著性差异检验使用统计分析软件“StatView”(SAS Institute公司制)，作为与对照的比较而使用Bonferroni法进行评价。

(2次筛选方法)

在2次筛选中，使用源自野生型小鼠(C57BL/6J小鼠)的分离肝细胞，通过测定Fasn基因的mRNA表达量进行评价。

具体而言，将源自野生型小鼠(C57BL/6J小鼠)的分离肝细胞利用12孔板，利用含有1％的青霉素和链霉素，10％牛胎儿血清(FCS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)培养8小时之后，置换为含有1％的青霉素和链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)，使其饥饿(Starvation)16小时。

收集培养基，利用含有胰岛素、LXR(肝X受体)激动剂、氨基酸混合物、各肽(在培养基中的终浓度为100μg/ml)的培养基培养24小时。另外，将取代肽而添加10％DMSO(二甲亚砜)的细胞也同样地培养24小时。

从各孔除去培养基后，进行mRNA的提取。mRNA提取利用SV Total RNA分离系统(Promega，Z3105)进行，从RNA进行的反转录通过PrimeScript RT试剂盒(Takara，RR0037A)进行，定量PCR使用SYBR Select Master Mix试剂盒(Life technologies，4472908)采用CFX384Real-Time系统及C1000热循环仪进行。方法遵照该试剂盒及仪器的指南。

(3次筛选方法)

改变肽的添加量(在本说明书中，只要没有特别明确记载，则肽的终浓度为10、30、100μg/ml)，与2次筛选同样地评价了Fasn基因的表达量。

实施例1：二肽

(1次筛选)

研究了从336种二肽文库(Anaspec公司制)之中具有参与肝脂肪合成抑制的可能性的那些。依照上述“(1次筛选方法)”中记载的方法实施。结果示于图2～8。

统计而言，显示了高斯荧光素酶活性受到抑制的二肽为22种(图2～8，表1)。为此，为了仔细地确认这些22种二肽实际上是否有脂肪合成抑制效果，合成这些二肽而进行了二次筛选。

(表1)在1次筛选中有效果的22种二肽

二肽文库编号	二肽	二肽文库编号	二肽
				#005	Ala-Gly(AG)	#116	Ile-Pro(IP)
#006	Ala-His(AH)	#144	Leu-Glu(LE)
				#018	Ala-Tyr(AY)	#242	Arg-Val(RV)
#048	Glu-Arg(ER)	#247	Ser-Phe(SF)
				#095	His-Lys(HK)	#290	Val-Met(VM)
#098	His-Asn(HN)	#301	Trp-Glu(WE)
				#101	His-Ser(HS)	#302	Trp-Phe(WF)
#102	His-Thr(HT)	#306	Trp-Lys(WK)
				#104	His-Trp(HW)	#325	Tyr-Lys(YK)
#107	Ile-Asp(ID)	#332	Tyr-Ser(YS)
				#108	Ile-Glu(IE)	#336	Tyr-Tyr(YY)

(2次筛选)

对二肽而言，使用了使用不二制油株式会社所有的肽合成仪(ResPep SL(INTAVIS公司))合成的二肽。合成表1所示出的二肽，依照上述“(2次筛选方法)”进行了评价。将测定的结果示于图9。

结果为22种二肽之内的13种二肽(Ala-Gly、Ala-His、Ala-Tyr、His-Asn、His-Ser、His-Thr、His-Trp、Val-Met、Trp-Glu、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-Ser、Tyr-Tyr)相对于对照而显著抑制了Fasn基因的表达。

(3次筛选)

对于在2次筛选中存在Fasn基因表达的抑制效果的13种二肽，依照上述“(3次筛选方法)”进行了评价。将测定的结果示于图10、11。

结果为13种二肽之内的11种二肽(Ala-Gly、His-Asn、His-Ser、His-Thr、His-Trp、Val-Met、Trp-Glu、Trp-Lys、Tyr-Lys、Tyr-Ser或Tyr-Tyr)相对于对照而显著抑制了Fasn基因的表达结果。根据这些结果可知，11种二肽具有肝脂肪合成抑制效果。

实施例2～3：三肽

从作为绿豆蛋白的主要成分的α-8S球蛋白的氨基酸序列构想的404种三肽文库，及从α＇/β-8S球蛋白的氨基酸序列构想的183种三肽文库的合计587种三肽文库之中，研究了具有参与肝脂肪合成抑制的可能性的那些。对587种三肽而言，使用了使用肽合成仪(ResPep SL(INTAVIS公司))合成的那些。

实施例2：从α-8S球蛋白的氨基酸序列构想的404种三肽文库的研究(1次筛选)

将对于从α-8S球蛋白的氨基酸序列构想的404种三肽文库，依照上述的“(1次筛选方法)”中记载的方法实施的1次筛选的结果示于图12～19。

统计而言，显示了高斯荧光素酶活性受到抑制的三肽为68种(图12～19，表2)。

(表2)在1次筛选中有效果的68种三肽

(2次筛选)

将表2所示的68种三肽使用肽合成仪(ResPep SL(INTAVIS公司))合成，依照上述“(2次筛选方法)”进行了评价。将测定的结果示于图20、21。

68种三肽之内的25种三肽相对于对照而显著抑制了Fasn基因的表达结果(图20、21，表3)。

(表3)在2次筛选中有效果的25种三肽

(3次筛选)

对于在2次筛选中，存在Fasn基因表达的抑制效果的25个三肽，依照上述“(3次筛选方法)”进行了评价。将测定的结果示于图22～24。

25种三肽之内的19种三肽(Val-Ile-Leu、Gly-Ser-Leu、Val-Leu-Gln、His-Ala-Gln、Arg-Ala-Val、Lys-Leu-Gly、Ile-Val-Ile、Lys-Pro-Ile、Leu-Val-Ile、Leu-Arg-Asp、Gln-Glu-Glu、Ser-Gly-Glu、Arg-Trp-Phe、Asp-Phe-Phe、Asp-Val-Phe、Pro-Phe-Tyr、Phe-Ile-Arg，Asn-Gly-Arg或Ile-Ile-Pro)相对于对照而显著抑制了Fasn基因的表达结果。

实施例3：从α′/β-8S球蛋白的氨基酸序列构想的183种三肽文库的研究

(1次筛选)

将对于从α′/β-8S球蛋白的氨基酸序列构想的183种三肽文库，依照上述的“(1次筛选方法)”中记载的方法实施的1次筛选的结果示于图25～28。

统计而言，显示了高斯荧光素酶活性受到抑制的三肽为62种(图25～28，表4)。

(表4)

(2次筛选)

将62种三肽使用肽合成仪(ResPep SL(INTAVIS公司))合成，依照上述“(2次筛选方法)”进行了评价。将测定的结果示于图29、30。

结果为62种三肽之内的15种三肽相对于对照而显著抑制了Fasn基因的表达(图29、30，表5)。

(表5)

(3次筛选)

对于在2次筛选中存在Fasn基因表达的抑制效果的15个三肽，依照上述“(3次筛选方法)”进行了评价。将测定的结果示于图31，32。

结果为15种三肽之内的6种三肽(Ile-Asp-Arg，Ile-His-Arg、Ile-Asp-Arg、Asn-Arg-Val、Ser-Ser-Val或Val-Phe-Val)相对于对照而显著抑制了Fasn基因的表达结果。

如上所述，从α-8S球蛋白的氨基酸序列构想的404种三肽文库的研究结果及从α′/β-8S球蛋白的氨基酸序列构想的183种三肽文库的研究结果可知，合计25种三肽(Val-Ile-Leu、Gly-Ser-Leu、Val-Leu-Gln、His-Ala-Gln、Arg-Ala-Val、Lys-Leu-Gly、Ile-Val-Ile、Lys-Pro-Ile、Leu-Val-Ile、Leu-Arg-Asp、Gln-Glu-Glu、Ser-Gly-Glu、Arg-Trp-Phe、Asp-Phe-Phe、Asp-Val-Phe、Pro-Phe-Tyr、Phe-Ile-Arg、Asn-Gly-Arg、Ile-Ile-Pro、Ile-Asp-Arg、Ile-His-Arg、Ile-Asp-Arg、Asn-Arg-Val、Ser-Ser-Val或Val-Phe-Val)具有肝脂肪合成抑制效果。