具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种高赖氨酸生物饲料的制备方法，包括以下步骤：

步骤一；制备赖氨酸种子液：

配制种子培养液：葡萄糖50-80g/L、酵母膏30-50g/L、玉米浆 4-7g/L、磷酸二氢钾3-6g/L、磷酸氢二钾0.5-1.5g/L、七水硫酸亚铁 0.3-0.6g/L、七水硫酸镁0.3-0.7g/L、生物素10-20mg/L、维生素B1 3-7mg/L，110℃蒸汽处理时间15min进行灭菌，待培养液冷却至25℃ -35℃时；

步骤一(1)；将谷氨酸棒杆菌接种到培养液中，培养60-80h，谷氨酸棒杆菌还是赖氨酸的主要产生菌；

步骤二；赖氨酸扩大培养种子液：

当步骤一中的种子液中谷氨酸棒杆菌的密度达到4×10⁸-5× 10⁸CFU/mL时，转入扩大培养。

将赖氨酸种子液按照8％-10％的比例接种到扩大培养液中，在 25-35℃条件下培养70h-80h，得到扩大培养种子液；

具体含量如下：

葡萄糖15-30g/L、(NH₄)₂SO₄ 3-6g/L、尿素0.5-1.2g/L、玉米浆1.5-2.5g/L、磷酸二氢钾0.8-1.3g/L、磷酸氢二钾0.6-1.3g/L、七水硫酸亚铁0.3-0.8g/L、七水硫酸镁0.2-0.4g/L、生物素10-20mg/L、维生素B1 4-6mg/L，调节pH为7.0。

步骤三；制备黑曲霉培养液：称取马铃薯15-25％，蔗糖2-4％，其余为水，在121℃温度下灭菌处理15min；将黑曲霉菌种接种到马铃薯培养液中，且黑曲霉菌种占培养液重量的3-5％，28℃，通风条件下培养28h；

步骤四；制备固态发酵培养基：按质量称取鲜食玉米副产品40-55％ (主要为去除鲜食玉米的玉米芯、玉米残余、少量玉米袍衣)、豆渣 30-40％(水分30％)、麸皮10-20％，总重按照100％为基准，按照接种量为6-8％加入黑曲霉菌种液，使菌种液的接种量占固态发酵培养基的6-8％，控制固态发酵培养基的含水量不超过60％，在25℃通风条件下，发酵80h。

步骤四(1)；酶解反应：向步骤四制备好的固态发酵培养基中加入溶菌酶和酸性蛋白酶，酶解时pH为5.8-6.2，温度为55℃。溶菌酶的添加量为0.02％-0.03％，酸性蛋白酶的添加量0.01％；酶解时间24h；酶解后对酶解物进行灭菌处理，110℃，蒸汽处理时间15min。

步骤五；赖氨酸发酵：将步骤二制备的赖氨酸扩大培养种子液加入到步骤四(1)酶解后的固态发酵培养基中，添加量为8％，进行好氧发酵，发酵温度为32-35℃，时间为80h。在发酵的48h-80h期间，开始喷淋添加玉米浆，氨水，以补充糖和氮的不足。喷淋添加玉米浆的量以控制在发酵底物的含水量不超过85％，谷氨酸棒杆菌发酵过程中需要进行搅拌处理，搅拌速度为15-50转/分；在不高于85℃的温度下进行干燥至含水量小于15％，制成多酶高赖氨酸饲料，其中蛋白含量20-30％，饲料含赖氨酸5-6％。

本发明在于提供一种利用鲜食玉米加工副产品(主要是玉米芯、碎玉米)、豆渣(不限于黄豆渣)辅助少量的玉米浆，通过黑曲霉和谷氨酸棒杆菌的有序处理，发酵制得富含赖氨酸生物饲料，同时还具备丰富的蛋白含量。

采用固态发酵法生产高赖氨酸生物饲料，大大提高了发酵效率，由于避免了赖氨酸提纯，降低能耗，提高饲料原料的利用效率。

采用黑曲霉发酵，对鲜食玉米副产品和豆渣进行充分的发酵利用，利用副产品提高赖氨酸产量，同时提高蛋白质含量，可替代部分豆粕、降低大豆进口压力。

采用黑曲霉和谷氨酸棒杆菌的依次发酵，避免了混菌发酵过程中对谷氨酸棒杆菌生长不利的影响。

鲜食玉米副产品、豆渣、麸皮的比例达到5:4:1时，能够获得较大的赖氨酸产量。

通过比较发现，黑曲霉发酵培养基经酶解灭菌，对谷氨酸棒杆菌的促进作用最强，赖氨酸产量显著。

固态发酵过程中，采用喷淋添加玉米浆、氨水的方法，对赖氨酸的产量有显著促进作用。

本发明过程中对固态发酵培养基的搅拌速度是一个动态调整过程，且随着培养基湿度的加大，搅拌速度加大，但是不能超过50转/ 分。

本实施例中，具体操作路程如图1所示

实施例1

赖氨酸扩大培养种子液添加量为10％，黑曲霉接种量为6％

步骤一、制备赖氨酸种子液：葡萄糖50-80g/L、酵母膏30-50g/L、玉米浆4-7g/L、磷酸二氢钾3-6g/L、磷酸氢二钾0.5-1.5g/L、七水硫酸亚铁0.3-0.6g/L、七水硫酸镁0.3-0.7g/L、生物素10-20mg/L、维生素 B1 3-7mg/L，

步骤一(1)；将谷氨酸棒杆菌接种到培养液中，培养60-80h，当种子液中谷氨酸棒杆菌的密度达到4×10⁸-5×10⁸CFU/mL时，转入扩大培养。

步骤二、制备赖氨酸扩大培养种子液：葡萄糖15-30g/L、(NH₄) ₂SO₄ 3-6g/L、尿素0.5-1.2g/L、玉米浆1.5-2.5g/L、磷酸二氢钾0.8-1.3 g/L、磷酸氢二钾0.6-1.3g/L、七水硫酸亚铁0.3-0.8g/L、七水硫酸镁 0.2-0.4g/L、生物素10-20mg/L、维生素B1 4-6mg/L，调节pH为7.0。将赖氨酸种子液按照8％的比例接种到扩大培养液中，在25-35℃条件下培养80h，得到扩大培养种子液。

步骤三、制备黑曲霉培养液称取马铃薯15-25％，蔗糖2-4％，其余为水，在121℃温度下灭菌处理15min；将黑曲霉菌种接种到马铃薯培养液中，且黑曲霉菌种占培养液重量的3-5％，28℃，通风条件下培养28h；

步骤四、制备固态发酵培养基按质量称取鲜食玉米副产品 40-55％(主要为去除鲜食玉米的玉米芯、玉米残余、少量玉米袍衣)、豆渣30-40％(水分30％)、麸皮10-20％，总重按照100％为基准，按照接种量为8％加入黑曲霉菌种液，使菌种液的接种量占固态发酵培养基的8％，控制固态发酵培养基的含水量不超过60％，在25℃通风条件下，发酵80h。

步骤四(1)、酶解反应；向步骤四制备好的固态发酵培养基中加入溶菌酶和酸性蛋白酶，酶解时pH为5.8-6.2，温度为55℃。溶菌酶的添加量为0.02％-0.03％，酸性蛋白酶的添加量0.01％；酶解时间24h；酶解后对酶解物进行灭菌处理，110℃，蒸汽处理时间15min。

步骤五、赖氨酸发酵：将步骤二制备的赖氨酸扩大培养种子液加入到步骤四(1)酶解后的固态发酵培养基中，添加量为8％，进行好氧发酵，发酵温度为32-35℃，时间为80h。在发酵的48h-80h期间，开始喷淋添加玉米浆，氨水，以补充糖和氮的不足。喷淋添加玉米浆的量以控制在发酵底物的含水量不超过85％，谷氨酸棒杆菌发酵过程中需要进行搅拌处理，搅拌速度为15转/分；在不高于85℃的温度下进行干燥至含水量小于15％，制成多酶高赖氨酸饲料，其中蛋白含量 25％，饲料含赖氨酸5.4％。

实施例2

赖氨酸扩大培养种子液添加量为8％，黑曲霉接种量为6％

步骤一、制备赖氨酸种子液：葡萄糖50-80g/L、酵母膏30-50g/L、玉米浆4-7g/L、磷酸二氢钾3-6g/L、磷酸氢二钾0.5-1.5g/L、七水硫酸亚铁0.3-0.6g/L、七水硫酸镁0.3-0.7g/L、生物素10-20mg/L、维生素 B1 3-7mg/L，当种子液中谷氨酸棒杆菌的密度达到4×10⁸-5×10⁸CFU/mL时，转入扩大培养。

步骤二、制备赖氨酸扩大培养种子液：葡萄糖15-30g/L、(NH₄) ₂SO₄ 3-6g/L、尿素0.5-1.2g/L、玉米浆1.5-2.5g/L、磷酸二氢钾0.8-1.3 g/L、磷酸氢二钾0.6-1.3g/L、七水硫酸亚铁0.3-0.8g/L、七水硫酸镁 0.2-0.4g/L、生物素10-20mg/L、维生素B1 4-6mg/L，调节pH为7.0。将赖氨酸种子液按照8％的比例接种到扩大培养液中，在25-35℃条件下培养80h，得到扩大培养种子液。

步骤三、制备黑曲霉培养液称取马铃薯15-25％，蔗糖2-4％，其余为水，在121℃温度下灭菌处理15min；将黑曲霉菌种接种到马铃薯培养液中，且黑曲霉菌种占培养液重量的3-5％，28℃，通风条件下培养28h；

步骤四、制备固态发酵培养基：按质量称取鲜食玉米副产品40-55％ (主要为去除鲜食玉米的玉米芯、玉米残余、少量玉米袍衣)、豆渣 30-40％(水分30％)、麸皮10-20％，总重按照100％为基准，按照接种量为6％加入黑曲霉菌种液，使菌种液的接种量占固态发酵培养基的 6％，控制固态发酵培养基的含水量不超过60％，在25℃通风条件下。

步骤四(1)、酶解反应；向步骤四制备好的固态发酵培养基中加入溶菌酶和酸性蛋白酶，酶解时pH为5.8-6.2，温度为55℃。溶菌酶的添加量为0.02％-0.03％，酸性蛋白酶的添加量0.01％；酶解时间24h；酶解后对酶解物进行灭菌处理，110℃，蒸汽处理时间15min。

步骤五、赖氨酸发酵：将步骤二制备的赖氨酸扩大培养种子液加入到步骤四(1)酶解后的固态发酵培养基中，添加量为8％，进行好氧发酵，发酵温度为32-35℃，时间为80h。在发酵的48h-80h期间，开始喷淋添加玉米浆，氨水，以补充糖和氮的不足。喷淋添加玉米浆的量以控制在发酵底物的含水量不超过85％，谷氨酸棒杆菌发酵过程中需要进行搅拌处理，搅拌速度为15-50转/分；在不高于85℃的温度下进行干燥至含水量小于15％，制成多酶高赖氨酸饲料，其中蛋白含量25％，饲料含赖氨酸5.2％。

实施例3

赖氨酸扩大培养种子液添加量为10％，黑曲霉接种量为8％，搅拌速度20转/min

步骤一、制备赖氨酸种子液：

配制种子培养液：葡萄糖50-80g/L、酵母膏30-50g/L、玉米浆 4-7g/L、磷酸二氢钾3-6g/L、磷酸氢二钾0.5-1.5g/L、七水硫酸亚铁 0.3-0.6g/L、七水硫酸镁0.3-0.7g/L、生物素10-20mg/L、维生素B1 3-7mg/L，当种子液中谷氨酸棒杆菌的密度达到4×10⁸-5×10⁸CFU/mL 时，转入扩大培养。

步骤二、制备赖氨酸扩大培养种子液：葡萄糖15-30g/L、(NH₄) ₂SO₄ 3-6g/L、尿素0.5-1.2g/L、玉米浆1.5-2.5g/L、磷酸二氢钾0.8-1.3 g/L、磷酸氢二钾0.6-1.3g/L、七水硫酸亚铁0.3-0.8g/L、七水硫酸镁 0.2-0.4g/L、生物素10-20mg/L、维生素B1 4-6mg/L，调节pH为7.0。将赖氨酸种子液按照10％的比例接种到扩大培养液中，在25-35℃条件下培养80h，得到扩大培养种子液。

步骤三、制备黑曲霉培养液：称取马铃薯15-25％，蔗糖2-4％，其余为水，在121℃温度下灭菌处理15min；将黑曲霉菌种接种到马铃薯培养液中，且黑曲霉菌种占培养液重量的3-5％，28℃，通风条件下培养28h；

步骤四、制备固态发酵培养基：按质量称取鲜食玉米副产品40-55％ (主要为去除鲜食玉米的玉米芯、玉米残余、少量玉米袍衣)、豆渣 30-40％(水分30％)、麸皮10-20％，总重按照100％为基准，按照接种量为8％加入黑曲霉菌种液，使菌种液的接种量占固态发酵培养基的 8％，控制固态发酵培养基的含水量不超过60％，在25℃通风条件下，发酵80h。

步骤四(1)；酶解反应：向步骤四制备好的固态发酵培养基中加入溶菌酶和酸性蛋白酶，酶解时pH为5.8-6.2，温度为55℃。溶菌酶的添加量为0.02％-0.03％，酸性蛋白酶的添加量0.01％；酶解时间24h；酶解后对酶解物进行灭菌处理，110℃，蒸汽处理时间15min。

步骤五，赖氨酸发酵：将步骤二制备的赖氨酸扩大培养种子液加入到步骤四(1)酶解后的固态发酵培养基中，添加量为8％，进行好氧发酵，发酵温度为32-35℃，时间为80h。在发酵的48h-80h期间，开始喷淋添加玉米浆，氨水，以补充糖和氮的不足。喷淋添加玉米浆的量以控制在发酵底物的含水量不超过85％，谷氨酸棒杆菌发酵过程中需要进行搅拌处理，搅拌速度为20转/分；在不高于85℃的温度下进行干燥至含水量小于15％，制成多酶高赖氨酸饲料，其中蛋白含量 26％，饲料含赖氨酸5.4％。

根据实施例1-实施例3得出下表数据。

采用固态发酵法生产高赖氨酸生物饲料，大大提高了发酵效率，由于避免了赖氨酸提纯，降低能耗，提高饲料原料的利用效率。

采用黑曲霉发酵，对鲜食玉米副产品和豆渣进行充分的发酵利用，利用副产品提高赖氨酸产量，同时提高蛋白质含量，可替代部分豆粕、降低大豆进口压力。

采用黑曲霉和谷氨酸棒杆菌的依次发酵，避免了混菌发酵过程中对谷氨酸棒杆菌生长不利的影响。

鲜食玉米副产品、豆渣、麸皮的比例达到5:4:1时，能够获得较大的赖氨酸产量。

通过比较发现，黑曲霉发酵培养基经酶解灭菌，对谷氨酸棒杆菌的促进作用最强，赖氨酸产量显著。

固态发酵过程中，采用喷淋添加玉米浆、氨水的方法，对赖氨酸的产量有显著促进作用。

本发明过程中对固态发酵培养基的搅拌速度是一个动态调整过程，且随着培养基湿度的加大，搅拌速度加大，但是不能超过50转/ 分。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。