聚合物前药及其皮下和/或肌内给药
阅读说明：本技术 聚合物前药及其皮下和/或肌内给药 (Polymeric prodrugs and subcutaneous and/or intramuscular administration thereof ) 是由 尼古拉·察普斯 朱利安·尼古拉 唐吉·布瓦瑟诺 亚历山大·博尔达 于 2018-11-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及活性分子的新前药。这些前药尤其使得能够皮下或肌内给药活性分子,其中,特别是由于在注射部位的毒性,皮下或肌内给药存在问题或不可能。本发明的前药包含与聚合物链,优选亲水和/或热敏聚合物链共价连接的活性成分。本发明尤其涉及包含至少部分地由丙烯酰胺单体或其衍生物之一形成的聚合物链的聚合物前药,所述聚合物包括近端部分和末端部分；共价偶联至聚合物近端部分的第一药物活性分子；以及可能地,共价偶联至聚合物末端部分的第二药物活性分子。(The present invention relates to novel prodrugs of active molecules. These prodrugs enable, in particular, subcutaneous or intramuscular administration of the active molecule, where, in particular, subcutaneous or intramuscular administration is problematic or impossible due to toxicity at the injection site. The prodrugs of the invention comprise an active ingredient covalently linked to a polymer chain, preferably a hydrophilic and/or thermosensitive polymer chain. The invention relates inter alia to a polymeric prodrug comprising a polymer chain at least partially formed by one of acrylamide monomers or derivatives thereof, said polymer comprising a proximal portion and a terminal portion; a first pharmaceutically active molecule covalently coupled to a proximal portion of the polymer; and possibly, a second pharmaceutically active molecule covalently coupled to a terminal portion of the polymer.)
技术领域
本发明涉及活性分子的新前药。这些前药尤其允许皮下或肌内给药活性分子，特别是由于注射部位的毒性，所述活性分子的皮下或肌内给药存在问题或不可能。本发明的前药包含与聚合物链、优选亲水和/或热敏聚合物链共价偶联的活性成分。
背景技术
据发明人所知，在皮下(SC)或肌内(IM)注射的制剂的开发过程中，三个主要参数阻止了它们的使用：活性成分(AI)的生物利用度、SC或IM制剂中AI的稳定性以及给药部位的局部反应。
·AI通过SC途径具有较低的生物利用度。它们的物理-化学性质(logP、溶解度、摩尔质量等)不允许它们穿过SC屏障，或者它们在生物介质中不稳定并且在到达循环之前被降解，有时甚至具有两种缺点；
·它们在皮下组织中引起严重的局部毒性，例如刺激或坏死(刺激性/发泡性)。这些反应可能有多种来源，例如溶液的渗透压、AI的血管收缩作用、组织中的作用或滞留机制等；
·SC给药固有的低注射体积与当前的化疗剂量不兼容。通常，我们可以通过直接注射来注射2ml，而通过缓慢注射(输液、“胰岛素泵”型)则可以注射相对较大的体积。这些体积将取决于AI的吸收速率(5％葡萄糖最多1l/24h)。因此，有必要浓缩溶液中的AI。但是，AI在高浓度溶液中不再稳定，因此会结晶或聚集。
但是，皮下(SC)途径比静脉(IV)途径更具吸引力，因为它使用起来更容易、更快捷。甚至可以考虑患者在家自我给药。但是，在肿瘤学中，SC途径仅可用于9种抗癌化学疗剂(甲氨蝶呤、阿糖胞苷、阿扎胞苷、克拉屈滨、博来霉素、硼替佐米、奥马西他汀(omacetaxine)、利妥昔单抗、曲妥珠单抗)。其中，我们发现很少有最有效和最常用的AI用于治疗癌症。
各种各样的参与者正在试图解决上述问题。例如，Otsuka(与BMS合作)已经开发了一种基于环糊精的技术。这些环状低聚糖具有疏水的内部空腔和亲水的外表面。因此，疏水性AI将被封装在内部空腔中，从而导致其表观溶解度增加。溶解度的增加导致SC生物利用度的增加。
Adocia公司正在开发生物分子伴侣聚合物，该聚合物将通过物理-化学相互作用与诸如胰岛素之类的生物分子缔合。胰岛素将以单一(“单体”)形式稳定，并且比其经典六聚体形式的胰岛素具有更高的SC生物利用度(“单体”形式的吸收更快，因为其摩尔质量较低)。因此，在这里发挥高浓度胰岛素单体的稳定性。
Halozyme公司正在开发一种基于透明质酸酶的制剂；主要由透明质酸组成的酶将可逆地降解SC组织。因此，直接注射体积可以从2ml增加到5ml。
尽管所有这些制剂通过发挥Otsuka的生物利用度、Adocia的稳定性或Halozyme的注射体积来改善SC给药，但它们仅适用于有限数量的分子(分别是抗精神病药、蛋白质(胰岛素)和单克隆抗体)。
目前可用于SC途径的技术局限性与以下事实有关：它们一次仅对上述参数之一(生物利用度和稳定性、注射量)起作用，而没有一个能够降低SC毒性。
因此，需要允许AI皮下或肌内给药、同时避免与其生物利用度及其稳定性有关的问题，并且最重要的是不会在注射部位对患者造成刺激/坏死的技术。
此外，给药高浓度的AI以达到有效的治疗剂量(例如5mg/ml、特别是10mg/ml)通常具有技术上的缺点，即制剂变得太粘并且与SC注射剂不相容。
发明目的
本发明旨在解决上述技术问题。
特别地，本发明旨在解决特别是通过一种或多种活性成分(例如抗癌活性成分)的皮下(SC)或肌内(IM)途径提供可注射组合物的技术问题，同时避免了活性成分的生物利用度和稳定性的问题，并且不会在注射部位对患者造成刺激甚至坏死。
本发明旨在解决特别是通过皮下(SC)或肌内(IM)给药提供具有高浓度AI(特别是浓度5mg/ml、或甚至10mg/ml或更高)的可注射组合物的技术问题。
本发明旨在解决特别是通过皮下(SC)或肌内(IM)给药在小体积可注射溶液(例如1-20ml)中提供治疗有效量的至少一种药物活性成分的可注射组合物的技术问题。
本发明旨在解决特别是通过皮下(SC)或肌内(IM)给药提供在易于注射的低粘度溶液中配制的至少一种药物活性成分的可注射组合物的技术问题。
发明描述
发明人开发了一种新的聚合物前药技术，该技术允许通过SC或IM途径给药活性成分，而没有观察到任何皮肤/局部毒性。令人惊讶地发现，前药方法可以使感兴趣的AI在SC或IM组织的水平上失活，并通过在全身循环中或在作用位点裂解AI/聚合物键来释放AI。AI与高水溶性聚合物(例如聚丙烯酰胺)之间的化学偶联也使修饰治疗分子的物理-化学性质成为可能。聚合物的物理-化学性质将赋予AI。与用于形成前药的其他聚合物(例如聚(乙二醇)及其衍生物)不同，聚丙烯酰胺即使具有较低的摩尔质量，也可以大大提高AI的溶解度。这些特性使得可以在高浓度下保持稳定性，同时限制粘度，以使其从SC或IM组织的吸收最大化，并将其代谢限制在该水平，从而提高生物利用度。能够调整吸收速度和速率的事实结合前药方法(在AI释放前一直处于非活性状态)使得可以抑制坏死性/刺激性AI的局部不良影响。一旦进入全身循环或在作用部位，活性成分就会通过键的裂解从前药中释放出来，然后恢复活性。
发明人开发的技术导致活性成分的物理-化学性质的改变。这使得它们的SC或IM可以高浓度给药，同时限制了刺激和坏死的问题。有利地，本发明的聚合物前药增加了AI的生物利用度和稳定性。
有利地，本发明的聚合物前药保持AI在高浓度下的稳定性，特别是在至少1mg/ml，例如至少2mg/ml的浓度下，优选当量AI浓度中至少5mg/ml的高浓度下的稳定性。根据一个变体，可以以至少10mg/ml，优选至少20mg/ml的AI当量浓度注射聚合物前药。
有利地，本发明的聚合物前药使来自SC或IM组织的AI的吸收最大化。
有利地，本发明的聚合物前药限制了AI的代谢，因此导致生物利用度增加。
有利地，本发明的聚合物前药允许SC注射大剂量的AI，同时避免SC或IM刺激和/或坏死的现象。
有利地，本发明的聚合物前药使得可以适应多种活性成分，这使得聚合物前药、其制备及其用途特别令人感兴趣。
出人意料的是，发明人已经鉴定了其性质允许它们通过SC或IM途径给药而没有刺激或坏死反应的聚合物前药。
发明人已经发现，聚合物的物理化学性质被赋予前药，尤其是通过SC或IM途径在注射溶液中的溶解性。
实际上，与某些活性成分的低溶解度(约1μg/ml)相比，根据本发明的聚合物前药的使用导致获得等效浓度活性成分的溶液，例如从1mg/ml至高于20mg/ml。选择本发明的聚合物前药是因为它们与大量测试的聚合物相比具有高水溶性。由于其极强的亲水性，它们将能够溶解疏水性AI，同时具有较低的摩尔质量。由于这种低摩尔质量，电荷速率将升高，粘度将降低，而在SC组织水平上吸收将迅速(吸收速度与摩尔质量成反比)。此外，聚合物和AI之间键的选择使得仅在被SC或IM组织吸收后(在组织中没有早期释放)才释放分子成为可能。这三个特征使得可以注射大量无毒性的AI。此外，体内试验显示，在不使用我们的制剂进行注射时，以前药形式对通常导致该类型反应的细胞毒素进行SC给药后，没有毒性、刺激或坏死的表现。因此，本发明中使用的前药显示出适合通过SC或IM途径给药的性质。
发明内容
本发明涉及一种聚合物前药，其包括：
-至少部分由丙烯酰胺单体或其衍生物之一形成的聚合物链，所述衍生物例如N-羟基丙烯酰胺、N-(4-羟基丁基)甲基丙烯酰胺、N-(聚(乙二醇))-丙烯酰胺、N-(3-甲氧基丙基)甲基丙烯酰胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-N-甲基甲基丙烯酰胺、N-(2-(二乙基氨基)乙基)-N-甲基甲基丙烯酰胺，所述聚合物包括近端部分和末端部分；
-与聚合物的近端部分共价偶联的第一药物活性分子；
-可能地，与聚合物的末端部分共价偶联的第二药物活性分子。
近端部分和末端部分被任意地定义为基本上线性的聚合物链的端部，即侧链(当存在时)的长度短于主链的长度。通常，主链是包含用于聚合的反应基团的链，并在聚合过程中传播。近端部分和末端部分表示聚合物的端部。优选地，当聚合是定向的时，近端部分表示未延长的端部，而末端部分表示延长的端部。术语近端“部分”和末端“部分”通常并分别表示近端和末端，从而近端部分可包含第一AI和第一单体，而末端部分可包含最后单体以及当存在时的第二AI。本发明还涉及自由基聚合控制剂的近端部分和末端部分。
本发明尤其涉及一种聚合物前药，其包括近端部分和末端部分并且包括：
-至少第一药物活性分子，
-至少一条至少部分地由丙烯酰胺单体或其衍生物之一形成的聚合物链，
-至少一种自由基聚合控制剂，其包括近端部分和末端部分；
第一药物活性分子位于前药聚合物的近端部分并与自由基聚合控制剂的近端部分共价偶联，而自由基聚合控制剂的末端部分位于前药聚合物的末端部分，并与聚合物链共价偶联。
本发明还涉及一种水溶性聚合物前药，其包括近端部分和末端部分并且包括：
-至少一个第一药物活性分子
-至少一条聚合物链
-至少一种自由基聚合控制剂，其包括近端部分和末端部分；
第一药物活性分子位于前药聚合物的近端部分并与自由基聚合控制剂的近端部分共价偶联，
自由基聚合控制剂的末端部分位于前药聚合物的末端部分并与聚合物链共价偶联，水溶性聚合物前药的溶解度在紫杉醇作为第一药物活性分子的情况在蒸馏水中的浓度为200mg/ml时被赞赏。
根据一个变体，该聚合物至少部分地由丙烯酰胺单体或其衍生物之一形成，并且由共聚单体形成，以形成无规或嵌段聚合物，例如丙烯酰胺-丙烯腈共聚物。
根据一个具体变体，该聚合物是聚(丙烯酰胺)。
本发明涉及一种聚合物前药，其包括：
-水溶性聚合物链，所述聚合物包括近端部分和末端部分；
-与聚合物的近端部分共价偶联的第一药物活性分子；
-可能地，与聚合物的末端部分共价偶联的第二药物活性分子；
所述水溶性聚合物链的溶解度在紫杉醇作为第一药物活性分子在蒸馏水中的浓度为200mg/ml时被赞赏。
根据一个变体，聚合物链的多分散指数小于1.5，所述多分散指数通过空间排阻色谱法确定。
根据一个变体，聚合物链的摩尔质量为1000-1,000,000g/mol，优选为小于100,000g/mol，更优选为小于50,000g/mol。
有利地，聚合物包含选自以下自由基聚合控制剂中的自由基聚合控制剂：可逆加成-断裂链转移(RAFT)、原子转移自由基聚合(ATRP)及其衍生物(铜(I)介导的自由基聚合)、氮氧化物-介导的聚合(NMP)、钴介导的自由基聚合(CoMRP)、有机碲介导的活性自由基聚合(TERP)和有机锑介导的自由基聚合(SBRP)，以及例如硫代羰基硫基转移剂(如二硫代碳酸酯、黄原酸酯、二硫代氨基甲酸酯和三硫代碳酸酯)，基于过渡金属(铜、铁、钌等)的配合物，烷氧基胺，钴和有机碲基配合物，以及有机锑。
根据一个变体，聚合物可以包含自由基聚合控制剂，该自由基聚合控制剂在末端部分中包含末端烷基链，该末端烷基链例如包含1-20个碳原子、羧酸官能团、醇官能团、胺官能团、酰胺官能团、硫醇官能团，所述官能团可能由末端烷基链支持，并且所述官能团可能与第二药物活性分子连接。
根据一个变体，该聚合物可以包含自由基聚合控制剂，该自由基聚合控制剂在近端包括选自酰胺、酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、琥珀酸酯、二硫化物、乙缩醛、硫醚、***官能团中的近端官能团；和/或二甘醇酸酯、琥珀酸酯、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC)、甘氨酸酯、葡糖醛酸酯、缬氨酸-瓜氨酸、马来酰亚胺连接子，所述官能团和/或近端连接子与第一药学活性成分形成共价键。
根据一个变体，所述活性分子是抗癌分子、抗生素分子(细菌/真菌-抑制、细菌/真菌-毒性或抗病毒剂)、抗糖尿病分子、治疗血管或心血管疾病的分子、治疗中枢神经系统疾病的分子、抗炎分子、生理受体的激动剂分子、生理受体的拮抗剂或部分拮抗剂分子、免疫调节分子。
根据一个变体，活性分子可以是选自以下的抗癌分子：紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、克拉屈滨、卡培他滨、柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、放线菌素、安吖啶、达卡巴嗪、放线菌素D、长春新碱、长春碱、长春地辛、甲氨蝶呤、秋水仙碱、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、洛莫司汀、卡莫司汀、达卡巴嗪、西异洛丁(cisoroatin)、替诺泊苷或依托泊苷、福莫司汀、丝裂霉素C、米托蒽醌、链脲霉素、曲贝替定、长春氟宁、长春瑞滨、三氧化二砷、苯达莫司汀、白消安、卡巴他赛、卡铂、艾瑞布林、伊立替康、拓扑替康、伊沙匹隆、奈拉滨、奥沙利铂、普拉曲沙、替莫唑胺、培美曲塞、伊马替尼、舒尼替尼和索拉非尼。
有利地，聚合物前药诱导药物活性分子随着时间的流逝散布到血液循环中或作用部位，例如在肿瘤水平或细胞内水平。
本发明涉及根据本发明的聚合物前药及其在人或动物中通过皮下或肌内给药在治疗方法、诊断方法或医学成像方法中的用途。
本发明涉及根据本发明的聚合物前药及其在通过皮下或肌内给药治疗人或动物的方法中的用途，所述聚合物前药包含在药物活性分子和聚合物之间的共价键，所述药物活性分子当未通过共价键与所述聚合物连接时，由于其在注射部位的毒性(组织的刺激/坏死)而不能通过皮下或肌内途径给药，优选所述聚合物前药具有防止局部毒性(在注射部位)的分子的生物利用度，并将药物活性分子释放到血液循环中。
根据一个变体，根据本发明的治疗方法可以是治疗癌症的方法。
本发明涉及至少一种根据本发明的聚合物前药的受控自由基聚合方法，特别是通过称为引发剂活性成分的方法的受控自由基聚合方法，所述方法包括以下步骤：
-至少一个第一药物活性分子与包含近端部分和末端部分的自由基聚合控制剂共价偶联，以形成第一偶联分子；
-在丙烯酰胺单体或其衍生物之一的存在下，第一偶联分子的受控自由基聚合，形成聚合物前药；
-可能地，在聚合物的受控自由基聚合之后，在控制剂的末端部分共价偶联第二药物活性分子。
本发明还涉及一种用于至少一种根据本发明的聚合物前药的受控自由基聚合的方法，所述方法包括以下步骤：
-在丙烯酰胺单体或其衍生物之一的存在下聚合物的受控自由基聚合，形成包含近端部分和末端部分的聚合物；
-至少一个第一药物活性分子与聚合物的近端部分共价偶联，以形成所述聚合物前药；
-可能地，在聚合物前药的末端部分共价偶联第二药物活性分子。
本发明还涉及包含至少一种根据本发明的聚合物前药的药物。
本发明还涉及可注射到哺乳动物、优选人的组织中的组合物，并且特别是配制用于通过皮下或肌内途径注射的组合物，所述组合物包含根据本发明定义的聚合物前药。
本发明涉及一种用于治疗方法的聚合物前药。该方法包括将药学有效量的所述聚合物前药皮下或肌内给药于患者。
定义
在本发明中，以下术语定义如下：
-“聚合物”是指聚合物或共聚物。
-术语“自由基聚合引发剂”是指用于产生自由基并由此引发自由基聚合的所有化合物。这些化合物具有能够通过氧化还原反应、电离辐射、电化学反应和超声处理在热处理、光照射下释放自由基的化学功能。引发剂的非限制性实施例包括偶氮类型的化合物，例如2,2'-偶氮二(2-甲基丙腈)、4,4'-偶氮二(4-氰基戊酸)、1,1'-偶氮二(环己烷甲腈)；无机过氧化物类型；或有机过氧化物类型，例如过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰、过氧化甲乙酮和过氧苯甲酸叔丁酯。
-术语“控制剂”是指在聚合反应期间用于获得数均摩尔质量与重均摩尔质量之比或分散性小于1.5的聚合物的所有化合物。这些化合物的性质取决于受控自由基聚合技术的实施。对于通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)进行的受控聚合，这些是二硫代碳酸酯(黄原酸酯)、三硫代碳酸酯、二硫酸酯或二硫代氨基甲酸酯化合物。对于氮氧化物-介导的聚合(NMP)，自由基聚合引发剂和控制剂结合在一个烷氧基胺型分子中。对于原子转移自由基聚合(ATRP)，自由基聚合引发剂是卤代烷，而控制剂是参与基于过渡金属的复合型催化剂特别设计的氧化还原反应的卤原子。
-“引发剂活性成分”的方法表示使用通过与活性成分化学偶联而改性的控制剂的受控自由基聚合技术。因此，改性的控制剂带有活性成分分子，而获得的聚合物在每条聚合物链的近端部分也带有活性成分。
-“烷基”是指任何线性或支链的饱和烃链，具有1-20个碳原子，优选地具有1-6个碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基及其异构体(例如正戊基、异戊基)、己基及其异构体(例如正己基、异己基)。
-术语“芳基烷基”是指被芳基取代的烷基，并且可以写为：芳基-烷基-。
-术语“芳基”是指具有一个单环(例如苯基)或几个稠合的芳族环(例如萘基)或共价偶联的多不饱和芳族烃基，通常含有5-12个碳原子；优选6-10个，其中至少一个环是芳族的。芳环可以包括与其稠合的1-2个另外的环(环烷基、杂环基或杂芳基)。芳基的非限制性实施例包括苯基、联苯基、联苯基、5或6四亚烷基、萘-1-或-2-基、4，5，6或7-茚基、1-，2-，3-，4-或5-烯基、3-，4-或5-烯基、1-或2-戊烯基、4-或5-茚满基、5-，6-，7-或8-四氢萘基、1,2,3,4-四氢萘基、1、4-二氢萘基、1-，2-，3-，4-或5-吡啶基。
-放在数字前的术语“大约”表示该数字标称值的加减10％。
-“药学上可接受的赋形剂”是指用作溶剂或稀释剂的惰性溶媒或载体，其中配制和/或给药了药物活性剂，并且当将其给药于动物、优选是人类时不会产生不希望的、过敏性或其他反应。这包括所有溶剂、分散介质、涂料、抗菌和抗真菌剂、等渗剂、吸收抑制剂、表面活性剂(例如表面活性剂聚合物)、脂质等。药学上可接受的赋形剂的选择可以由本领域技术人员根据固有属性和药物活性剂的性质、待治疗的受试者以及给药途径来进行选择。对于人类给药，制剂必须符合监管机构(例如FDA或EMA)要求的无菌性、一般安全性和纯度标准。
-“药物或治疗有效量”是指给予受试者所需的足够量的药物或治疗剂，以减慢或停止其至少一种疾病症状的进展、加重或恶化。该量可能有助于缓解疾病症状或治愈疾病。
-“药物”是指健康领域中的化合物或活性成分，例如具有治疗和/或用于治疗诊断(特别是治疗(治愈和/或对症和/或预防)疾病的目的)或用于治疗研究的性质。因此，术语药物的将治疗性分子或活性成分以及诊断性分子组在一起。
-“水性介质”是指基于水分子(H2O)的介质，尤其是水溶液。优选地，相对于介质的总质量，水性介质包含50％-100％的水。水性介质尤其可以是生物流体，例如血液、淋巴液、唾液或尿液。
-“活性分子”和“活性成分”是同义词，是指与健康有关的用于治疗用途的化合物。特别地，可指优选在受试者中治疗或预防疾病的活性分子。这被称为药物活性分子。在本发明的含义内，术语“疾病的治疗”表示减少或减轻与器官、组织或细胞的功能受损有关的疾病、病症或病状的至少一种不良作用或症状。为了本发明的目的，表述“预防疾病”或“抑制疾病的发展”是指预防或避免症状出现的事实。活性成分是指尤其具有用于治疗诊断(特别是用于治疗(治愈和/或对症和/或预防)疾病的目的)或用于治疗研究的治疗和/或用途特性的化合物。
-“前药”：术语“前药”是指活性分子化合物的药理学可接受的衍生物，例如酰胺或酯，其生物转化产物在体内产生生物活性分子。前药通常以生物利用度增加为特征，并且在体内容易代谢为生物活性化合物。优选地，前药是与活性分子共价偶联的水溶性聚合物。
-“聚合物前药”：该术语是指与至少一种活性成分缀合的聚合物。
-“受试者”是指动物，包括人。在本发明的含义内，受试者可以是患者，即正在接受治疗，正在接受或已经接受过医学治疗，或在疾病发展过程中受到监视的人。在一个实施方式中，受试者是第一次接受治疗。在另一个实施方式中，受试者对另一种类型的治疗具有抗性，并且用本发明的前药作为第二、第三或第四作用的一部分进行治疗。
-“上临界溶液温度(UCST)”是指热敏聚合物可完全溶解的临界温度。
-“热敏性”是指其物理性质随温度突然变化的聚合物的性质。在本发明中，有关的性质是聚合物在水性介质中的溶解度。优选地，热敏聚合物具有最高临界溶液温度(UCST)。
具体实施方式
聚合物
有利地，根据本发明的聚合物前药通过单体或共聚单体的聚合获得。
有利地，通过受控自由基聚合获得根据本发明的聚合物前药。
因此，如此形成的前药聚合物的分散性非常低。
有利地，根据本发明的聚合物前药包含通过引发剂活性成分法与亲水聚合物链共价偶联的活性分子。有利地，根据已知的引发剂活性成分法，在聚合之前将AI与聚合控制剂偶联。在这种方法中，AI与聚合控制剂共价偶联。一旦完成这种偶联，就可以从该加合物控制剂/AI中以受控方式生长乙烯基聚合物。AI最终将共价偶联至聚合物的近端。与其他合成聚合物前药(特别是由AI和预先形成的聚合物之间的偶联(称为后功能化)或AI在聚合之前与单体的偶联合成聚合物前药)的方法不同，该技术可以将AI定位在每个聚合物链的一端。所得的聚合物前药具有定义明确的结构、高电荷速率和简单的纯化。它很容易转座到大量的AI和聚合物中。
根据一个方面，根据本发明的聚合物前药包括通过引发剂活性成分法与水溶性聚合物链共价偶联的活性分子。
因此，有利地，在偶联至链转移剂以形成聚合物前药的第一分子的存在下进行丙烯酰胺单体的受控自由基聚合。根据一种实施方式，有可能在丙烯酰胺单体和共聚单体的存在下聚合。
或者，聚合物前药可以由聚丙烯酰胺、亲水性聚丙烯酰胺衍生物或聚丙烯酰胺共聚物(例如丙烯酰胺-丙烯腈共聚物)组成。
有利地，根据本发明的聚合物包括聚丙烯酰胺结构，该聚丙烯酰胺结构的重复单元具有式[-CH2-CH(CONH2)-]n，其中n表示聚合物(或共聚物)中重复单元的数目。
根据一种实施方式，有可能在丙烯酰胺单体的衍生物存在下进行聚合。例如丙烯酰胺衍生物，如N-羟基丙烯酰胺、N-(4-羟基丁基)甲基丙烯酰胺、N-(聚(乙二醇))-丙烯酰胺、N-(3-甲氧基丙基)甲基丙烯酰胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)-N-甲基甲基丙烯酰胺、N-(2-(二乙氨基)乙基)-N-甲基甲基丙烯酰胺。
有利地，根据本发明的步骤或方法可以在前药-聚合物分子的一端提供具有药学活性分子(或AI)的聚合物前药，并且因此有利地使得可以控制AI电荷速率。通常，在现有技术中不存在这种控制，在现有技术中，AI在聚合之后或在聚合之前与单体偶联。这些技术导致每个聚合物链的AI数量可变，并且未偶联的AI的纯化复杂。
根据一种实施方式，第二药物活性分子通过共价偶联偶联至控制剂的末端部分。该偶联发生在自由基聚合结束之后。
聚合物链
有利地，聚合物及其尺寸的选择使得可以获得可以通过SC或IM途径给药的聚合物前药。
有利地，聚合物前药的尺寸由自由基聚合条件控制。
在一种实施方式中，该聚合物前药包含通过引发剂活性成分法与聚丙烯酰胺链共价偶联的活性分子。
在一种实施方式中，该聚合物前药包含与共聚物共价连接的活性分子，该活性分子从丙烯酰胺单体和一种或多种其他共聚单体中获得。
在一种实施方式中，该聚合物前药包含与共聚物共价连接的活性分子，该活性分子通过引发剂活性成分法从丙烯酰胺和丙烯腈单体中获得，从而得到在UCST下对温度敏感的丙烯酰胺-丙烯腈共聚物聚合物前药。
在一种实施方式中，聚合物前药包含通过引发剂活性成分法或由亲水性单体获得的共聚物法与聚合物共价连接的活性分子，该亲水性单体衍自丙烯酰胺亲水性单体，例如N-羟基丙烯酰胺、N-(4-羟基丁基)甲基丙烯酰胺、N-(聚(乙二醇))-丙烯酰胺、N-(3-甲氧基丙基)甲基丙烯酰胺、N-(2-(二甲氨基)乙基)-N-甲基甲基丙烯酰胺、N-(2-(二乙氨基)乙基)-N-甲基甲基丙烯酰胺。
根据一种实施方式，有可能在其他亲水单体的存在下聚合。
根据一种实施方式，根据本发明的共聚物是无规共聚物。
在另一种实施方式中，根据本发明的共聚物是统计共聚物。
优选地，根据本发明的聚合物前药的聚合物不交联。
通常，根据本发明的聚合物前药不形成交联的水凝胶。
有利地，摩尔质量显著大于活性分子的摩尔质量改善了与聚合物和溶剂之间的相互作用有关的性质的维持，并且特别是改善了活性分子在水相中的溶解性。
结果，在一种实施方式中，本发明的聚合物具有1,000-100,000g/mol的分子量。在一种具体的实施方式中，本发明的聚合物的分子量为2,000-70,000g/mol，5,000-70,000g/mol，5,000-60,000g/mol，5,000-50,000g/mol，5,000-40,000g/mol，5,000-30,000g/mol，5,000-40,000g/mol，10,000-40,000g/mol，15,000-40,000g/mol，15,000-30,000g/mol或20,000-30,000g/mol。
根据一个变体，聚合物(仅聚合物部分)的摩尔质量为1,000-80,000g/mol。
有利地，聚合物前药的末端部分改变了聚合物前药的溶解度和/或粘度。
根据一种实施方式，聚合物链(例如聚丙烯酰胺)包含烷基末端链，例如包含2-20个碳原子或卤素-SH、-COOH、-NH2官能团。有利地，烷基链的长度或其性质使得可以改变聚合物前药的粘度。
根据一个变体，聚合物前药是热敏的，在水性介质中具有0-60℃的较高临界溶液温度(UCST)。聚合物前药包含与丙烯酰胺-丙烯腈共聚物的热敏聚合物链共价连接的活性分子。
迄今为止，就发明人的知识而言，没有人描述通过引发剂活性成分法接枝到活性分子上的具有UCST的聚合物。由于活性分子对聚合物的化学修饰，本领域技术人员可以预期热敏特性的变化。
发明人已经证明，活性分子与呈现UCST的聚合物链的共价缔合对所述聚合物的热敏性质几乎没有影响。出乎意料的是，一旦共轭了活性分子，就有可能改变摩尔质量和单体组成，从而发现具有热敏性质的聚合物。因此，活性分子与优化的聚合物的偶联允许保持总是表现出UCST的聚合物的热敏特性。
根据一种实施方式，这些聚合物前药的丙烯酰胺-丙烯腈共聚物链的摩尔质量为1,000-100,000g/mol。
根据一种实施方式，相对于聚合物的摩尔数，丙烯腈的摩尔百分比大于0-100％，优选地1-50％，并且更优选地5-35％。
活性分子
通常，用于制备本发明的聚合物前药的药物活性分子是游离分子或与另一分子连接的分子。根据一种实施方式，用于制备本发明的聚合物前药的活性分子是游离的。
通常，用于制备本发明的聚合物前药的药物活性分子具有能够与根据本发明的受控自由基聚合剂反应的功能，从而通过共价键将活性分子(或AI)与聚合剂偶联。
根据一种实施方式，用于制备根据本发明的聚合物前药的药物活性分子是具有至少一种游离官能团(能够与受控自由基聚合剂反应)的分子，该游离官能团例如选自以下官能团：-OH、-NH2、-NH、-NHR(R＝定义的烷基)、-SH、-COOH、-C＝O、-CHO或卤素。在一种实施方式中，游离官能团是亲核官能团。
药物活性分子不能携带游离官能团。可以在将其偶联到聚合剂上之前对其进行化学处理，以使其具有游离官能团(能够与受控自由基聚合剂反应)。现有技术中已知几种用于使活性分子官能化的方法。本发明的指示性和非限制性实例在于用导致活性分子羟基化的过氧化物处理活性分子。
根据一种实施方式，活性分子的游离亲核官能团选自-OH、-NH2、-NHR和-SH。优选地，亲核官能团是-OH或-NH2。
例如，为了更好地控制聚合物链在活性分子上的接枝，即如果存在分子的其他亲核官能团，则可以或可以不对其进行保护。
根据第一种实施方式，不参与受控自由基聚合的活性分子的亲核官能团不受保护。
根据第二种实施方式，不参与受控自由基聚合的活性分子的亲核官能团被现有技术中已知的基团保护，例如叔丁氧羰基氯、二碳酸二叔丁酯、叠氮化物或叔丁氧羰基酰胺、叔丁基(二甲基)甲硅烷基氯、甲苯磺酰氯、烷基、芳基、烷基芳基、酯、醚、甲硅烷基醚。
如实例所示，本发明可以独立于活性分子的极性来实施。因此，用于本发明聚合物的活性分子是极性、两亲性或非极性分子。根据第一种实施方式，本发明的聚合物中使用的活性分子是极性分子。根据第二种实施方式，本发明的聚合物中使用的活性分子是非极性分子。根据第三种实施方式，本发明的聚合物中使用的活性分子是两亲性分子。
根据一个变体，电荷速率是0.1％-20％(相对于前药-聚合物分子的总质量的AI质量)。
在一种实施方式中，活性分子选自包括以下的活性分子的组：
-抗癌分子，
-抗生素分子(细菌/真菌-抑制、细菌/真菌-毒性或抗病毒剂)，
-抗糖尿病分子，
-治疗血管和心血管疾病的分子，
-治疗中枢神经系统疾病的分子，
-抗炎分子，
-生理受体激动剂分子，
-生理受体的拮抗或部分拮抗分子，
-免疫调节分子。
在一种实施方式中，活性分子是选自以下的抗癌分子：巯基紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、克拉屈滨、卡培他滨、柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、放线菌素、安吖啶、达卡巴嗪、放线菌素D、长春新碱、长春花碱、长春地辛、甲氨蝶呤、秋水仙碱、环磷酰胺、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、洛莫司汀、卡莫司汀、达卡巴嗪、顺铂、氟尿嘧啶、替尼泊苷或依托泊苷、福莫司汀、丝裂霉素C、米托蒽醌、链脲霉素、曲贝替定、长春氟宁、长春瑞滨、三氧化二砷、苯达莫司汀、白消安、卡巴他赛、卡铂、艾日布林、伊立替康、拓扑替康、伊沙匹隆、奈拉滨、奥沙利铂、普拉曲沙、替莫唑胺、培美曲塞、伊马替尼、舒尼替尼、索拉非尼。
在一种实施方式中，活性分子选自抗癌分子(紫杉醇、吉西他滨)、肽(环状RGD)和/或荧光探针(罗丹明和花青5.5)。
在一种实施方式中，活性分子是选自紫杉醇或吉西他滨的抗癌分子。根据一种实施方式，本发明的前药包含紫杉醇作为活性分子。在一种实施方式中，第一活性分子是紫杉醇。
在一种实施方式中，第一活性分子是吉西他滨。
根据一种实施方式，根据本发明的聚合物前药在一端包含活性分子。
根据一种实施方式，根据本发明的聚合物前药在其近端包括活性分子。
根据一种实施方式，根据本发明的聚合物前药在其末端包含活性分子。
根据一种实施方式，根据本发明的聚合物前药包含两个活性分子，在每端各一个。
聚合
本发明涉及特别是如上所述的接枝有聚合物链的分子。
有利地，根据本发明的聚合通过受控自由基途径进行。
有利地，根据本发明的聚合是通过引发剂活性成分法控制的自由基途径进行的。
因此，通过应用受控自由基聚合方法将聚合物链接枝到活性分子上。在一种实施方式中，本发明的聚合物前药是通过选自以下的受控自由基聚合方法获得的：
-通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)控制的聚合，
-通过氮氧化物介导的聚合(NMP)控制的自由基聚合，
-通过原子转移自由基聚合(ATRP)控制的自由基聚合，
-通过单电子转移活性自由基聚合(SET-LRP)控制的自由基聚合，
-通过钴控制的自由基聚合，
-通过有机酸酯(organotellates)控制的自由基聚合，或
-通过有机锑(organostilbine)控制的自由基聚合。
通常，聚合物前药进一步包含链转移剂。
在一种实施方式中，通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)控制的自由基聚合来合成聚合物前药。
在一种实施方式中，通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)控制类型的受控自由基聚合、通过使至少一种单体、自由基聚合引发剂和其上偶联药物活性分子的受控自由基聚合剂(也称为链转移剂)反应获得根据本发明的聚合物前药。
特别地，根据本发明的聚合物前药通过受控自由基聚合制备，并且根据一个变体，其包括至少一个第一药物活性分子与包含近端部分和末端部分的自由基聚合控制剂的共价偶联，从而形成第一偶联分子。
自由基聚合控制剂包括近端部分和末端部分，因为在聚合过程中，聚合控制剂(或链转移剂)被裂解为：在这里称为近端的部分，该部分保持与位于聚合物链的起始处的AI连接；以及在这里称为末端的部分，该部分固定在聚合物链的末端以便完成。该聚合控制剂使得可以精确且有利地控制聚合物链的长度。
根据一个变体，我们指的第一偶联分子表示与聚合控制剂或控制剂的近端部分偶联的AI。
在一种实施方式中，根据本发明的前药的聚合物还包含选自以下的RAFT型链转移剂：
·三硫代碳酸酯、例如3,5-双(2-十二烷基硫代羰基硫醇基硫基-1-氧丙氧基)苯甲酸、2-(十二烷基硫代羰基硫酰基硫基)-2-甲基丙酸3-丁烯酯、2-(2-羧乙基硫烷基硫代羰基硫烷基)-丙酸、4-((((2-羧基乙基)硫基)羰基硫酰基)硫基)-4-氰基戊酸、2-氰基丁烷-2-基4-氯-3,5-二甲基-1H-吡唑-1-碳二硫代酸酯、2-氰基丁烷-2-基3,5-二甲基-1H-吡唑-1-碳二硫代酸酯、4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸、2-(丁基硫代羰基硫酰基硫代)丙酸、4-氰基-4-(乙基羰基硫酰基硫代)戊酸、4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊醇、氰基甲基(3,5-二甲基-1H-吡唑)-碳二硫代酸酯、氰基甲基十二烷基三硫代碳酸酯、氰基甲基[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]三硫代碳酸酯、2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯、S,S-二苄基三硫代碳酸酯、2-(十二烷基-硫代羰基硫酰基硫基)-2-甲基丙酸、2-(十二烷基-硫代羰基硫酰基-硫代)-2-甲基丙酸、3-叠氮基-1-丙醇酯、2-(十二烷基硫代羰基硫酰基硫基)-2-甲基丙酸、4-氰基-4-[[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯、2-(十二烷基硫代羰基硫酰基硫代)-2-甲基丙酸的五氟苯基酯、2-(十二烷基硫代羰基硫酰基硫代)丙酸、2-(十二烷基)-2-甲基丙酸甲酯、季戊四醇四[2-(十二烷基硫代羰基硫酰基硫基)-2-甲基丙酸酯]、邻苯二甲酰亚胺基丁基三硫代碳酸酯、具有2-(十二烷基硫代羰基硫酰基硫基)-2-甲基丙酸末端的聚(丙烯酸)、聚(乙二醇)双[2-(十二烷基硫代羰基硫酰基硫基)-2-甲基丙酸酯]、聚(乙二醇)甲基醚4-氰基-4-[[十二烷基硫烷基硫代羰基]硫烷基]戊酸酯、聚(乙二醇)甲基醚(4-氰基-4-戊酸酯十二烷基三硫代碳酸酯)、聚(乙二醇)甲基醚(4-氰基-4-戊酸酯十二烷基三硫代碳酸酯)、聚(乙二醇)甲基醚(4-氰基-4-戊酸酯十二烷基三硫代碳酸酯)、聚(乙二醇)甲基醚2-(十二烷基硫代羰基硫酰基硫基)-2-甲基丙酸酯、聚(乙二醇)甲基醚2-(十二烷基硫代羰基硫酰基硫代)-2-甲基丙酸酯、聚(乙二醇)甲基醚(2-甲基-2-丙酸十二烷基三硫代碳酸酯)L-丙交酯)4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基-硫代羰基)硫烷基]戊酸酯、聚(L-丙交酯)4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基-硫代羰基)硫烷基]戊酸酯、聚(D,L-丙交酯),4-氰基-4-[((十二烷基硫烷基-硫代羰基)硫烷基]戊酸酯、具有2-(十二烷基硫代羰基硫酰基硫基)-2-甲基丙酸末端的聚苯乙烯，或1,1,1-三[[十二烷基硫代羰基硫酰基硫基)-2-甲基丙酸酯]乙烷；
·二硫代氨基甲酸酯，如1H-吡咯-1-氨基甲二硫代酸苄基酯、氰基甲基二苯基氨基甲二硫代酸酯、氰基甲基甲基(苯基)氨基甲二硫代酸酯、氰基甲基甲基(4-吡啶基)氨基甲二硫代酸酯、2-氰基丙烷-2-基N-甲基-(吡啶基-4-基)氨基甲二硫代酸酯、2-[甲基(4-吡啶基)氨基甲硫酰基硫代]丙酸甲酯、1-琥珀酰亚胺基-4-氰基-4-[N-甲基-N-(4-吡啶基氨基甲硫酰基硫代)]戊酸酯；
·二硫代苯甲酸酯，例如苯并二硫代酸苄酯、苯并二硫代酸氰甲基酯、4-氰基-4-(苯基羰基硫酰基硫代)戊酸、4-氰基-4-(苯基羰基硫酰基硫代)戊酸的N-琥珀酰亚胺酯、2-氰基-2-丙基苯并二硫代酸酯、2-氰基-2-丙基4-氰基苯并二硫代酸酯、2-(4-甲氧基苯基羰基硫酰基硫代)乙酸乙酯、2-甲基-2-(苯基硫代羰基硫代)丙酸乙酯、2-(苯基羰基硫酰基硫代)-2-苯基乙酸乙酯、2-(苯基羰基硫酰基硫代)丙酸乙酯、1-(甲氧基羰基)乙基苯并二硫代酸酯、2-(4-甲氧基苯基羰基硫酰基硫代)乙酸、2-硝基-5-(2-丙炔氧基)苄基4-氰基-4-(苯基羰基硫酰基硫基)戊酸、2-(苯基羰基硫酰基硫代)丙酸或2-苯基-2-丙基苯并二硫代酸酯；
·可转换的RAFT剂，例如氰基甲基甲基(4-吡啶基)氨基甲二硫代酸酯、2-氰基丙-2-基N-甲基-N-(吡啶-4-基)氨基甲二硫代酸酯、2-[甲基(4-吡啶基)氨基甲硫酰基硫代]丙酸甲酯或1-琥珀酰亚胺基-4-氰基-4-[N-甲基-N-(4-吡啶基)氨基甲硫酰基硫基]戊酸酯。
链转移剂例如选自：4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸、2-(十二烷基硫代羰基硫酰基硫基)-2-甲基丙酸、4-氰基酸4-(苯基羰基硫酰基硫代)戊酸、2-(2-羧乙基硫烷基硫代羰基硫烷基)丙酸、2-(丁基硫代羰基硫酰基硫代)丙酸、4-氰基-4-(乙基羰基硫酰基硫代)戊酸、苯并二硫代酸酯2-氰基丙烷-2-基或2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯。常规自由基引发剂选自：2,2'-偶氮二(2-甲基丙腈)、1,1'-偶氮二(环己烷甲腈)、4,4'-偶氮二(4-氰基戊酸)酸、2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)、过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰、过氧化甲乙酮、过氧苯甲酸叔丁酯。
在一种实施方式中、链转移剂选自：4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸、2-(十二烷基硫代羰基硫酰基硫基)-2-甲基丙酸、4-氰基-4-(苯基羰基硫酰基硫代)戊酸2-(2-羧乙基硫烷基硫代羰基硫烷基)丙酸、2-(丁基硫代羰基硫酰基硫代)丙酸、4-氰基-4-(乙基羰基硫酰基硫代)戊酸、2-氰基丙烷-2-基的苯并二硫代酸酯或2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯。
在一种实施方式中、链转移剂选自：
4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸、2-(丁基硫代羰基硫酰基硫代)丙酸、4-氰基-4-(乙基羰基硫酰基硫代)戊酸、N-羟基琥珀酰亚胺酯4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸。
在一种实施方式中、链转移剂是4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸(CDP)。
在一种实施方式中，转移剂直接连接至活性分子。然而，在自由基聚合过程中，转移剂由于其聚合控制功能而被分为两部分，一个保持与活性成分连接的近端部分，另一个则与增长的聚合物反应的末端部分。
根据一个变体，转移剂通过酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、乙缩醛、二硫化物、硫醚、***官能团；二甘醇酸酯、琥珀酸酯、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸(SMCC)、甘氨酸酯、葡糖醛酸酯、缬氨酸-瓜氨酸、马来酰亚胺连接子与药物活性分子共价连接，所述官能团和/或近端连接子与第一活性药物成分形成共价键。
在另一种实施方式中，转移剂预先用羟基羧酸的低聚物官能化。根据该实施方式，该接枝在活性分子和转移剂之间的低聚物链使得可以控制活性分子从本发明的聚合物前药中的释放速率。根据一种实施方式，低聚物是二聚体，优选二乙醇酸。
另外，自由基聚合引发剂是必需的，因为它可以引发聚合并因此使聚合物链从通过RAFT剂官能化的活性分子中生长。该引发剂可以是偶氮类型的，例如2,2'-偶氮二(2-甲基丙腈)、1,1'-偶氮二(环己烷甲腈)、4,4'-偶氮二(4-氰基戊酸)酸、2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)；无机过氧化物类型；或有机过氧化物类型，例如过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰、过氧化甲乙酮、过氧苯甲酸叔丁酯。
在一种特定的实施方式中，自由基引发剂是2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)，CAS编号：78-67-1。
嵌段聚合物
在一种实施方式中，根据本发明的聚合物前药是其活性分子与嵌段共聚物共价连接的聚合物前药。后者包含如上所述的聚合物或共聚物，以及具有至少一种亲水聚合物的延伸。实际上，在聚合物或共聚物链的末端转移剂的存在允许添加另外的聚合物链。本发明的共聚物可以包含至少两个嵌段。
根据一种实施方式，根据本发明的前药包含聚合物，该聚合物的链进一步包括其与另一种聚合物的链的延伸，该另一种聚合物优选为水溶性聚合物。在一个实施方式中、水溶性聚合物选自聚[低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯]、聚[低聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯]、聚[低聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯]、聚丙烯酰胺、糖聚合物(由具有糖功能的甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺乙烯基醚或苯乙烯类单体合成)、聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚苯乙烯磺酸酯、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、亲水性多肽和多糖。
在一种实施方式中，水溶性聚合物是聚丙烯酰胺。
方法
在第二方面，本发明涉及如上所述的聚合物的制备方法。
获得聚合物的方法
本领域技术人员可以根据活性分子的物理化学性质以及聚合物所需的结构和物理化学特征，从现有技术中已知的那些中选择合适的聚合技术。
根据一种实施方式，该方法包括活性分子聚合的至少一个步骤。
根据该实施方式，根据本发明的制备聚合物的方法包括以下步骤：
i)将活性化合物与如上所述的链转移剂偶联，
ii)由活性分子使如上所述的单体聚合。
根据一种实施方式，该方法包括至少一个由活性分子进行受控自由基聚合的步骤。
受控自由基聚合可以选自现有技术中已知的技术，例如：
-通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)控制的聚合，
-通过氮氧化物介导的聚合(NMP)控制的自由基聚合，
-通过原子转移自由基聚合(ATRP)控制的自由基聚合，
-通过单电子转移活性自由基聚合(SET-LRP)控制的自由基聚合，
-通过钴控制的自由基聚合，
-通过有机碲酸酯(organotellate)控制的自由基聚合，或
-通过有机锑(organostilbine)控制的自由基聚合。
在一种实施方式中，根据本发明的用于制备聚合物前药的方法包括至少一个RAFT聚合步骤。
根据该实施方式，根据本发明的制备聚合物的方法包括以下步骤：
i)将活性化合物与如上所述的链转移剂偶联，
ii)由转移剂使如上所述的单体聚合。
对于受控自由基聚合，例如RAFT聚合，步骤(ii)在自由基聚合引发剂(自由基产生剂)的存在下进行。聚合引发剂允许引发聚合，因此增加了由RAFT剂官能化的活性分子的聚合物链。引发剂可以是偶氮类型的，例如2,2'-偶氮二(2-甲基丙腈)、1,1'-偶氮二(环己烷甲腈)、4,4'-偶氮二(4-氰基戊酸)酸、2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)；无机过氧化物类型；或有机过氧化物类型，例如过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰、过氧化甲乙酮、过氧苯甲酸叔丁酯。
在一种特定的实施方式中，自由基引发剂是2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)，CAS编号：78-67-1。
在一种实施方式中，步骤(ii)在室温下进行。在另一种实施方式中，步骤(ii)在25℃-150℃的温度下进行。
远螯聚合物前药
本发明提供了可以应用于多种活性成分、成像和/或靶向剂的平台的优点。聚合物链各端的官能团可用于化学连接目标分子，因此可以制造称为远螯聚合物的单官能或双官能系统。可以设计许多系统，从最简单的系统(在聚合物链的一端接枝的分子)到更复杂的系统(称为异双功能)，其中聚合物的一端可能具有药物活性分子，且成像剂或靶向配体在聚合物另一端。此外，还可以合成具有各种活性成分的各种聚合物前药，然后一起配制以产生联合疗法。
这类具有大分子结构的远螯聚合物特别令人感兴趣，因为它可以制造出具有不同特性并适用于许多领域的聚合物前药。异双功能聚合物更令人感兴趣，因为它们允许将两种不同的功能结合在同一化合物中。因此，根据本发明的这些聚合物前药特别适合于生物医学应用，其中可以在同一链上结合两种类型的分子，这两种类型的分子对于不同的目的可能具有药物/生物活性，例如：
-对于活性成分的靶向递送，通过将活性成分和靶向配体(例如抗体、配体、肽等)结合。
-对于成像，通过结合靶向配体和示踪分子(例如荧光团)。这些聚合物前药可以例如使用癌症细胞的特异性标记物在癌症的情况下用于检测和成像。
存在许多用于合成这些异双功能聚合物的技术。根据一个变体，制备远螯聚合物前药的方法包括一种或多种聚合前或聚合后的修饰，以偶联不同的目标分子。
根据一个变体，聚合物前药包含将第一活性成分与肽(通常为肽偶联物)共价键合。
例如，以下合成原理可用于在目标肽与被RAFT剂封端的聚丙烯酰胺聚合物之间进行生物偶联：
第一种途径(途径1)使得可以通过巯基-马来酰亚胺偶联通过马来酰亚胺型连接子使肽与聚合物缔合，而第二种途径(途径2)允许通过肽偶联形成肽键直接进行偶联。
根据一个变体，聚合可以通过肽引发，然后在聚合之后进行与活性成分的偶联。
本发明涉及包含至少一种根据本发明的聚合物前药的组合物。
在第一种实施方式中，所述组合物包含根据本发明的单一聚合物前药。
在第二种实施方式中，组合物包含至少两种、至少三种、至少四种或至少五种根据本发明的聚合物前药。根据该实施方式，所述组合物包括包含相同活性分子的聚合物前药。具有不同聚合物链的聚合物前药的存在允许活性分子的双峰、三峰或多峰释放。根据不同的实施方式，所述组合物可以包括包含各种活性分子和相同的聚合物链的聚合物前药。这使我们在同一制剂中得到两个具有不同药效学特征的活性分子。根据另一种实施方式，组合物可以包括包含活性分子和不同聚合物链的聚合物前药。这使得可以在相同的制剂中得到两个具有不同药效学特征并且其释放根据这些理化性质而变化的活性分子。
在第三种实施方式中，组合物可以包含至少一种根据本发明的聚合物前药和至少一种游离活性分子，其中它们的药学上可接受的盐或前药是现有技术中已知的。游离活性分子是指未结合的分子，或者至少是未与聚合物共价连接的分子。
制剂
本发明涉及水溶液形式的组合物，其包含水性介质和至少一种根据本发明的聚合物前药。
有利地，根据本发明的聚合物前药可溶于水性介质。
通常，根据本发明的聚合物前药可溶于至少100mg/ml，优选150mg/ml，更优选200mg/ml的蒸馏水中。
优选地，根据以下方法测试聚合物前药的溶解度：
将各种聚合物前药以当量浓度(200mg/ml)溶解，然后以16,783g离心30分钟。通过在Eppendorf底部出现白色或有色沉积物观察不溶性。
有利地，包含根据本发明的聚合物前药的溶液不是很粘。
有利地，可以根据聚合物的尺寸和性质/组成来调节聚合物前药溶液的粘度。受控自由基聚合在这里也表现出本发明的重要技术优势。
有利地，根据本发明的聚合物前药使得可以在不显著增加制剂的粘度的情况下浓缩AI，这使得可以限制注射制剂的量(特别是体积)。
有利地，根据本发明的聚合物前药可以配制成可注射形式。
有利地，根据本发明的聚合物前药被配制在易于注射的水溶液中。
例如，包含根据本发明的聚合物前药的溶液的粘度允许其通过26G针头注射。有利地，包含根据本发明的聚合物前药的溶液通过26G针需要小于30N的注射力。优选地，包含根据本发明的聚合物前药的溶液可通过26G针头以至少50mg/ml，例如至少100mg/ml，优选至少125mg/ml的浓度注射。或者，包含根据本发明的聚合物前药的溶液可通过26G针头以至少150mg/ml，优选至少200mg/ml的浓度注射。
优选地，我们根据以下方法测试可注射性(或可注射性)(表示为相对于浓度的牛顿)：
如Burckbuchler等人所述，使用定制设备结合具有30kg力传感器的纹理分析仪(TA.XT Plus纹理分析仪，稳定微系统(Stable Micro Systems))评估聚合物溶液的可注射性/可注射性(欧洲药物和生物制药杂志(Eur.J.Pharm.Biopharm.),76,2010,351-356)。取出每种溶液400μL，然后以1mm/s的速度通过1ml注射器(Merit Medical，
用途
有利地，将聚合物的至少某些物理化学性质赋予AI。特别地，该聚合物使得可以增加Al的溶解度，从而在高浓度下保持稳定性，使其吸收最大化，并限制其代谢，从而导致生物利用度提高。
本发明尤其涉及聚合物前药在治疗方法中的用途。该方法包括将治疗有效量的聚合物前药给药于患者。
有利地，前药方法(其中AI在释放前是无活性的)使得可以抑制坏死性/刺激性AI的局部不良作用。通常，一旦进入全身循环，活性成分就会通过键的裂解从聚合物中释放出来，然后恢复其活性。裂解是由于血液循环中存在的生物学条件而获得的。一旦进入全身循环，活性成分就会通过键的裂解从前药中释放出来，然后恢复其活性。
通常，将聚合物前药注射到组织中(特别是通过SC或IM途径)并进入血流。然后将聚合物前药裂解以将感兴趣的AI释放到血流中。
有利地，控制单体的性质、聚合物的尺寸和分散性、聚合控制剂的性质以及其与AI之间的键使得可以调整与前药(其中AI在释放前是无活性的)偶联的吸收速度和速率，并有可能抑制坏死性/刺激性AI的局部不良作用。
本发明的聚合物前药及其组合物可在生物医学领域中具有多种应用。
根据一个变体，AI表示与靶向剂连接的活性分子，使得可以靶向待治疗的特定区域，例如，将释放的活性分子导向其作用部位。
根据一个变体，AI表示与诊断剂连接的活性分子，允许对待治疗的特定区域进行成像。
根据一个变体，AI表示与诊断剂连接的靶向剂，使得可以将AI靶向待治疗的组织或细胞。
本发明还涉及包含至少一种根据本发明的聚合物前药的药物。
本发明还涉及根据本发明的聚合物前药在预防和/或治疗疾病、特别是人或动物的疾病中的用途。
本发明还涉及至少一种根据本发明的前药在制备药物中的用途。
通常，药物包含治疗有效量的至少一种根据本发明的聚合物前药。根据一种实施方式，药物还包含药学上可接受的赋形剂。这些赋形剂符合欧洲药典或FDA的标准。
本领域技术人员根据待预防和/或治疗的疾病、药物的给药途径以及活性分子的性质来确定药物制剂。在一种实施方式中，所述制剂是可注射制剂。根据该实施方式，通过推注或连续(输注)给药，优选通过推注给药。根据该实施方式，所述制剂是用于以下给药的可注射制剂：
-皮下，
-肌内，
-瘤内，
-真皮内，或
-静脉内，
优选皮下或肌内。
优选地，通过皮下或肌内途径给药(或可给药)根据本发明的聚合物前药。
方法
本发明还涉及用于治疗方法的聚合物前药。该方法包括将治疗有效量的至少一种根据本发明的聚合物前药给药于受试者，特别是人或动物。
治疗方法可以涉及如上所述的疾病的治疗。
在一种特定的实施方式中，治疗方法是治疗癌症的方法。
至少一种根据本发明的聚合物前药的给药可以与根据本发明配制的其他活性分子同时给药或不与根据本发明配制的其他活性分子同时给药。
至少一种根据本发明的聚合物前药的给药可以与根据本发明配制的其他活性分子相继给药或不与根据本发明配制的其他活性分子相继给药。
在一种实施方式中，这些制剂可以增加活性成分的生物利用度，并且可以通过皮下、肌内、瘤内或真皮内途径，优选通过皮下或肌内途径来给药。
考虑到本发明的多功能性使得可以将几种类型的活性分子偶联到聚合物链上，可以用根据本发明的药物预防或治疗的疾病不限于癌症、细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染、炎症性疾病、代谢性疾病、微血管疾病、大血管疾病、心血管疾病、肺部疾病、内分泌疾病或中枢神经系统疾病。
根据本发明，可以通过给药根据本发明的聚合物前药来治疗的癌症类型不受特别限制，因为治疗取决于接枝的活性分子。根据其与待治疗癌症的生物学、药效学和药代动力学特性来选择接枝到聚合物上的活性分子。
在一种实施方式中，所治疗的癌症可以是实体癌，例如乳腺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌或子宫内膜癌、***癌和/或膀胱癌、胃癌、肠癌、卡波济氏肉瘤、脑癌、骨癌、胰腺癌或肺癌。
在另一种实施方式中，所述癌症是血细胞的癌症，例如白血病。
根据一种实施方式，活性分子被快速释放，例如可以在少于24小时内释放80重量％的活性分子。
根据一种实施方式，活性分子可以缓慢释放，例如在超过72小时内释放50重量％的活性分子。
附图的简要说明
图1显示了三种具有不同RAFT剂的根据本发明的共聚物的透射率随温度变化的三个光谱：CDP-33％-5、PTX-CDP-33％-10和Gem-33％-5。在600nm下以0.5℃/min的升温速率在PBS中以4.5mg/ml的速率采集。
图2顶部显示了透射率与温度的曲线，显示了在聚合物浓度等于4.5mg/ml时CP5-PEGMA和CP7-PEGMA颗粒的UCST行为。图2底部显示了PEG化和CP5配制后获得的CP5和CP5-PEGMA的UCST行为的比较曲线。
图3(顶部(A))显示了紫杉醇的PBS溶液皮下给药的局部毒性作用。图3(底部(B))显示了在皮下给药配制为根据本发明的前药紫杉醇溶液PTX-P(AAm-co-AN)后没有局部毒性，其中PTX-P(AAm-co-AN)具有20％AN。
图4和图5：通过可注射性对各种聚合物前药进行粘度研究的结果图(力(N)随浓度(mg/ml)的变化)。
图6和图7：来自PTX和聚合物之间具有不同化学键(酯、二甘醇酸酯、碳酸酯)的前药聚合物的紫杉醇在PBS(图6)和鼠血浆(图7)中的释放。
图8：通过质谱法测定的聚合物键降解后在血浆中释放的PTX的鼠模型的药代动力学(浓度(mg/ml)随时间(分钟)的变化)。
图9：在鼠模型中的毒性研究。对应于PTX-二甘醇酸酯-PAAm、PTX-酯-PAAm、紫杉醇和PAAm的小鼠体重随时间的变化。
图10：以7mg/kg当量PTX(每只小鼠0.14mg总PTX)的速率静脉和皮下给药市售
图11：通过IV和SC途径给药的游离罗丹明和罗丹明-PAAm的鼠模型的生物分布研究。
图12(顶部)显示了皮下给药紫杉醇的PBS溶液的局部毒性作用。图12(底部)显示在皮下给药配制为根据本发明PTX-PAAm的前药的紫杉醇溶液后没有局部毒性。
图13：聚合物紫杉醇前药溶液的粘度随聚合物中丙烯腈(AN)的浓度和含量的变化。这些测量值使用具有平面几何形状的流变仪获得。
实施例
通过阅读以下实施例将更好地理解本发明，这些实施例举例说明本发明而不限制本发明。
缩略语
AAm:表示丙烯酰胺-CAS编号79-06-1
AIBN:表示自由基引发剂偶氮二异丁腈-CAS编号78-67-1
AN:表示丙烯腈-CAS编号107-13-1
CDP:表示RAFT控制剂4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸-CAS编号870196-80-8
CDP-ol:表示RAFT官能化剂4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊醇-CAS编号1394136-26-5
快速色谱:表示制备分离方法。流动相通过施加10-20psi的压力
与固定相交叉
DCM:表示无水二氯甲烷-CAS编号75-09-2
DMAI:表示4-二甲基氨基吡啶-CAS编号1122-58-3
DMF:表示N,N-二甲基甲酰胺-CAS编号200-679-5
DMSO:表示二甲基亚砜-CAS编号67-68-5
EDC-HCl:表示1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐-CAS编号25952-53-8
EtOAC:表示乙酸乙酯-CAS编号7487-88-9
Gem:表示盐酸吉西他滨-CAS编号122111-03-9
GemTBDMS:表示吉西他滨，其醇官能团受叔丁基二甲基甲硅烷基保护
H:表示小时
NHS:表示N-羟基琥珀酰亚胺-CAS编号6066-82-6
PEGMA:表示聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯，平均Mn为300g/mol-CAS编号26915-72-0
PTX-A％-B:表示紫杉醇-CDP-AAm-AN共聚物的聚合物，其分子量为Bkg/mol，且相对于聚合物的摩尔数包含A％的丙烯腈
PTX-A％-B-PEGMA-C:表示紫杉醇-CDP-AAm-AN共聚物的聚合物，其分子量为B kg/mol，且相对于聚合物的摩尔数包含A％的丙烯腈和C％的PEGMA
PTX:表示紫杉醇-CAS编号33069-62-4
Brine:表示氯化钠的饱和水溶液
TBAF:表示四正丁基氟化铵-CAS编号429-41-4
TBDMS:表示叔丁基二甲基甲硅烷基
TBDMSCl:表示叔丁基二甲基氯硅烷-CAS编号18162-48-6
THF:表示四氢呋喃-CAS编号109-99-9
材料和方法
仪器
除自由基引发剂AIBN由Acros提供外，所有试剂均由SigmaAldrich提供。分别从氯仿和无水乙醇中重结晶丙烯酰胺(AAm)和AIBN。在碱性氧化铝柱上纯化丙烯腈(AN)以除去氢醌的单甲醚。至于其他化学试剂，则直接使用。
方法
NMR
质子核磁共振(NMR)光谱：小分子的1H NMR分析是使用Brucker Avance300至300MHz光谱仪在CDCl3中进行。聚合物样品的所有1H NMR分析均使用Bruker Avance 3HD400光谱仪在d6-DMSO中于400MHz和70℃温度下进行。
UCST转换测量
紫外可见光谱：对于固定浓度为4.5mg/ml的聚合物水溶液的透射率测量，在Perkin-Elmer Lambda 25紫外-可见分光光度计上通过珀尔帖(Peltier)效应系统以0.5℃/min的速度使温度在20℃-60℃上升和下降记录吸收光谱。
粘度/可注射性测量
使用可注射性研究作为浓度的函数来测量粘度。已经使用定制设备结合配有30kg力传感器的纹理分析仪(TA.XT Plus纹理分析仪，稳定微系统)评估了聚合物溶液的可注射性(Burckbuchler等,欧洲药物和生物制药杂志,76,2010,351-356)。取出每种溶液400μl，然后以1mm/s的速度通过1ml注射器(MeritMedical,
实施例1：紫杉醇(PTX)与控制剂4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基] 戊酸(CDP)的偶联
以下实施例显示了CDP控制剂的化学修饰，使其通过酯键与PTX分子连接；以下插图对应于合成产物的化学结构：
将770mg(1.80mmol)CDP、231mg(1.90mmol)DMAI和362mg(1.90mmol)EDC.HCl溶解在5ml无水DCM的配有磁力棒的烧瓶中，然后使用磁力搅拌器在室温下在氩气下混合。15分钟后，滴加557mg(0.66mmol)PTX在2ml无水DCM中的溶液。使反应混合物达到30℃。搅拌12小时后，加入160mg(0.83mmol)的EDC.HCl和120mg(1.00mmol)的DMAI在1ml无水DCM中的溶液，然后将反应混合物在30℃下再搅拌12小时。有机相用NaHCO3水溶液洗涤，并经Na2SO4干燥，然后蒸发溶剂。通过硅胶色谱法以DCM/EtOAc梯度(16％-50％)纯化产物。分离出粘性黄色粉末，收率为65％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.17(d,J＝7.6Hz,2H),7.78(d,J＝7.5Hz,2H),7.72-7.31(m,15H),6.93(d,J＝8.9Hz,1H),6.54-6.15(m,2H),6.01(d,J＝8.9Hz,1H),5.70(d,J＝7.0Hz,1H),5.51(d,J＝3.2Hz,1H),5.00(d,J＝8.7Hz,1H),4.47(s,1H),4.28(dd,J＝34.7,8.5Hz,2H),3.84(d,J＝6.8Hz,1H),3.34(t,J＝9.4Hz,1H),2.51(d,J＝13.8Hz,6H),2.25(s,3H),1.96(s,2H),1.83(d,J＝3.1Hz,3H),1.78-1.60(m,10H),1.38-1.13(m,20H),0.90(t,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ216.76,203.76,171.19,170.69,169.81,167.88,167.03,142.63,136.75,133.68,133.47,132.88,132.04,130.23,129.18,128.74,128.60,127.15,126.51,118.97,84.45,81.08,79.14,76.43,75.59,75.11,74.65,72.13,72.00,58.53,52.79,46.26,45.60,43.18,37.13,35.54,33.61,31.90,29.61,29.53,29.42,29.33,29.07,28.94,27.66,26.82,24.81,24.75,22.74,22.68,22.10,20.82,14.83,14.12,9.61.
在以下实施例中，该种类物质对应于与CDP控制剂共价偶联的紫杉醇(称为PTX-CDP)。
实施例2：通过引发剂的活性成分方法与PTX-CDP作为控制剂的丙烯酰胺聚合
该实施例显示了在PTX-CDP存在下通过RAFT型丙烯酰胺聚合生成紫杉醇-聚丙烯酰胺聚合物前药的过程，以下插图对应于合成的聚合物前药的化学结构：
将0.8mg(0.005mmol)AIBN、30mg(0.024mmol)PTX-CDP、454mg(6.39mmol)AAm和1.76g(1.6ml)DMSO引入配有磁力棒的7ml直瓶中。将烧瓶用隔膜密封，并将反应混合物用氩气鼓泡15分钟。将反应混合物引入预先加热至70℃的油浴中，并在搅拌下使反应进行24小时。然后，将聚合物在过量的冷甲醇中沉淀两次，然后将其溶于DMSO中，并使用3.5kD光谱/Por3透析棒在水中透析三天。然后将溶液冻干24小时以获得淡黄色固体。Mn21.600，Mw/Mn1.12。
实施例3：通过起始活性成分方法合成的聚合物紫杉醇前药的溶解度和粘度的比 较
制备了各种聚合物紫杉醇前药，并比较了它们的溶解度和粘度。
紫杉醇聚合物前药的合成
遵循与实施例2相同的方法，通过改变在丙烯酰胺位置处使用的单体：N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)或低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)，即单甲基丙烯酸甘油酯(GMA)制备各种紫杉醇前药。这三种单体的水溶性是已知的。对于线性紫杉醇-聚(乙二醇)前药，Ceruti等人已经描述了由简单的酯偶联构成的合成(受控释放杂志(Journal ofControlled Release),63,2000,141-153)。
获得的聚合物具有以下特性：PTX-PAAm Mn 21.600,Mw/Mn 1.12(实施例2)；PTX-PDMAAm Mn 20,200,Mw/Mn 1.02；PTX-POEGMA Mn 24,500；PTX-PGMA Mn 20,500,Mw/Mn 1.11；PTX-PEG Mn 21,000,Mw/Mn 1.05。
聚合物前药的溶解度比较
在200mg/ml聚合物前药的浓度下评价溶解度，进行一或两次离心(16,873g，30min),以将可溶性聚合物前药与悬浮液中的聚合物前药区分开。通过在Eppendorf基础水平上不存在可见的聚集体来评估溶解度。
出乎意料的是，除了溶液保持透明的PTX-PAAm外，所有聚合物溶液都有沉积物。因此，PAAm可使200mg/ml的紫杉醇完全溶解。因此，其他前药的溶解度低于PTX-PAAm。
通过可注射性研究不同聚合物前药的粘度
粘度是聚合物溶解度的反映。当聚合物前药非常可溶时，聚合物链的缠结现象更严重，这导致粘度增加。使用可注射性研究作为浓度的函数来测量粘度。已经使用定制设备结合配有30kg力传感器的纹理分析仪(TA.XT Plus纹理分析仪，稳定微系统)评估了聚合物溶液的可注射性(Burckbuchler等,欧洲药物和生物制药杂志,76,2010,351-356)。取出每种溶液400μl，然后以1mm/s的速度通过1ml注射器(MeritMedical,
PTX-PAAm的粘度高于其他聚合物，这与聚合物链的最强缠结和最大粘度有关。令人惊讶地，PAAm是具有最强能力来溶解非常疏水性PA(如PTX)的聚合物。
实施例4：紫杉醇的聚丙烯酰胺前药的粘度作为前药末端部分性质的函数的比较
在该实施例中，比较了三种PTX-PAAm前药的粘度作为前药末端部分性质的函数。为此，通过与实施例1中给出的合成途径相同的合成途径、以不同的RAFT试剂合成了三种控制剂：一种由C12烷基链封端(实施例1，标记为RAFT-C12)，另一种具有C4烷基链(2-(丁基硫代羰基硫酰基硫基)丙酸，表示为RAFT-C4)以及最后一种通过C2烷基链封端(4-氰基-4-(乙基羰基硫酰基硫代)戊酸，表示为RAFT-C2)。然后将它们用于如实施例2中所述的聚合丙烯酰胺，分别获得前药PTX-PAAm-C12(实施例2)、PTX-PAAm-C4和PTX-PAAm-C2。以下插图总结了这些不同的合成：
获得的聚合物具有以下特性：PTX-PAAm-C12 Mn 21,600,Mw/Mn 1.12(实施例1)；PTX-PAAm-C4 Mn 26.400,Mw/Mn 1.04；PTX-PAAm-C2 Mn 24,100,Mw/Mn 1.09。
各种前药的粘度通过与实施例3中所述相同的方法测量；结果如图5所示。
出乎意料的是，根据前药末端部分的性质，观察到粘度降低：PTX-PAAm-C12>PTXPAAm-C4>PTXPAAm-C2。
实施例5：由肽(RGD)引发的聚合
新的RAFT剂RGD-CDP的合成，其化学结构如以下插图所示：
将环-RGD(50.00mg，0.083mmol)溶解于无水DMF(3ml)中，然后加入DIPEA，并搅拌溶液。在另一小瓶中，将NHS活化的CDP(41.00mg，0.083mmol)溶解于无水DMF(2ml)中，并将该溶液滴加到RGD溶液中。将所得溶液在氩气气氛下于室温下搅拌24小时。24小时后，加入RGD(25.00mg，0.042mmol)，并将溶液搅拌过夜。然后除去DMF，得到黄色固体，将其在DCM中研磨并干燥。获得黄色固体形式的RGD-CDP(80.5mg)，收率为98％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.40(s,1H),8.09(t,J＝7.4Hz,2H),8.00(d,J＝5.1Hz,2H),7.70(d,J＝7.1Hz,1H),7.60(s,1H),7.21(m,6H),4.60(m,1H),4.46(m,1H),4.19(m,1H),4.06(m,1H),3.97(s,1H),3.09(m,3H),2.95(s,3H),2.60(s,2H),2.35(d,J＝6.6Hz,3H),1.86(s,3H),1.25(s,18H),0.85(t,J＝6.8Hz,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ171.65,171.13,170.57,157.10,137.23,129.54,128.57,126.73,49.34,47.55,36.88,35.58,34.34,29.34,28.95,28.59,27.72,25.67,24.36,22.54,14.39；IRν＝3270,2924,2854,1635,1546,1439,1379,1200,1182,1075,1130,799,720,698,606,517cm-1。
聚合物的合成
然后，按照实施例2中所述的方法，在这种新的RAFT剂的存在下进行丙烯酰胺的聚合。纯化结束时，获得白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.30(s,2H),8.09(t,J＝7.4Hz,2H),7.76(s,2H),7.58(d,J＝9.0Hz,2H),7.20(m,6H),6.73(m,330H),3.36(m,2H),3.23(s,1H),2.68(m,1H),2.33(m,3H),2.13(s,170H),1.56(s,345H),1.27(s,18H),0.87(t,J＝6.8Hz,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ176.97；)；IRν＝3335,3194,2933,1652,1610,1451,1415,1347,1321,1191,1124,491cm-1。
实施例6：罗丹明荧光聚合物的合成
所用的罗丹明(Rho)哌嗪是按照Nguyen等人已经描述的合成途径合成(有机化学通讯(Organic Letters)，2003，5，3245-3248)。将其与RAFT CDP剂偶联以获得Rho-CDP，其结构如以下插图所示：
将罗丹明哌嗪(200.00mg，0.39mmol)溶解在无水DCM(12ml)中。在氩气气氛下，加入HATU(223.00mg，0.59mmol)、DIPEA(0.20ml，1.20mmol)和CDP(158.00mg，0.39mmol)，并将溶液在室温搅拌过夜。真空下除去溶剂，并将粗混合物通过柱色谱法(DCM，高达2％MeOH/DCM)纯化，得到粉色粉末(170mg)，收率为49％。Rf＝0.75(DCM/MeOH 5％)；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.76(m,4H),7.54(s,2H),7.13(dd,J＝18.4,10.1Hz,4H),6.95(s,3H),3.66(d,J＝6.7Hz,9H),3.40(t,J＝29.9Hz,18H),2.09(s,2H),1.85(s,2H),1.63(s,2H),1.23(m,21H),0.84(t,J＝6.1Hz,3H)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ157.71,155.70,148.72,132.35(CH2),130.04(CH2),127.23(CH2),114.38,110.01,96.09(CH2),46.07,41.45,36.83,32.14,29.17,27.69,22.49,13.78,12.84(CH2)；IRν＝2922,1634,1585,1465,1411,1335,1272,1245,1178,1132,1072,1006,835,682,556cm-1；HR-MS(ESI+):m/z C51H70N5O3S3+[M+H]+为896.4635，计算值为896.4641。
聚合物的合成
然后按照实施例2中所述的方法，在这种新的RAFT剂的存在下进行丙烯酰胺的聚合。纯化结束时，得到粉色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.77-7.72(m,2H),7.70-7.65(m,1H),7.52-7.48(m,J＝8.6Hz,2H),7.23-6.40(m,501H),3.66(dd,J＝14.3,7.2Hz,5H),3.32(m,6H),2.66(m,2H),2.33-2.29(m,5H),2.15(s,227H),1.54(m,484H),1.25(s,18H),1.23(s,5H),1.21(s,3H),1.17(s,1H),1.15(s,1H),0.86(t,J＝6.8Hz,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ177.35；IRν＝3344,3193,1652,1415,1146,1330,556cm-1。
实施例7：花青5.5荧光聚合物的合成
首先，按照实施例2给出的方法，用N-羟基琥珀酰亚胺活化的RAFT CDP剂合成聚丙烯酰胺。聚合物的结构如以下插图所示：
然后将该聚合物溶于DMSO(0.7ml)中。在另一瓶中，将花青(0.005mmol)和TEA(1.4μL，0.01mmol)溶于DMSO(0.3ml)中，并滴加到聚合物溶液中。将混合物在氩气下于室温下搅拌过夜。加入冷甲醇后形成沉淀，将沉淀过滤并重新溶解在DMSO中，并将溶液在Milli-Q水中透析24小时。将溶液冻干，得到蓝色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.77(s,458H),2.12(s,232H),1.69(s,112H),1.47(s,329H),1.26(s,18H),0.87(t,J＝6.3Hz,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ177.36；IRν＝3337,3190,1651,1607,1451,1412,1317,1120cm-1。
实施例8：在活性成分和聚合物之间具有不同键的聚丙烯酰胺前药的合成
为了改变聚丙烯酰胺和活性成分(这里是紫杉醇)之间的化学键，我们合成了三种具有不同键的新型RAFT剂：PTX-二甘醇酸酯(digly)-CDP的二甘醇酸酯键、PTX-氨基甲酸酯-CDP的氨基甲酸酯以及PTX-碳酸酯-CDP的碳酸酯。
PTX-二甘醇酸酯-CDP的合成
该合成分两个阶段进行：第一阶段是在碱(三乙胺)存在下使CDP与乙醇酸酐反应。该反应在室温下进行24小时，并定量形成CDP-乙醇酸1。后者与紫杉醇之间的偶连在EDC作为偶联剂和DMAI作为碱的存在下于30℃进行24小时，得到产物PTX-二甘醇酸酯-CDP 2，收率为50％。(NB：无水乙醇酸(anhydride glycolique)＝乙醇酸酐(glycolic anhydride))
将CDP 1(800mg，1.40mmol)、DMAI(170mg，1.40mmol)、无水DCM(6ml)的EDC.HCl(276mg，1.40mmol)溶解在烧瓶中。然后将紫杉醇(1.00g，1.17mmol)的无水DCM(2ml)溶液加入到烧瓶中。在30℃下反应7之后，加入EDC.HCl(130mg，0.68mmol)和DMAI(75.0mg，0.61mmol)，并将混合物在30℃下搅拌过夜。有机相用NaHCO3水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。产物通过硅胶色谱法用DCM/EtOAc梯度(16-50％)纯化。分离的产物为黄色粉末，收率为50％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.17(d,J＝7.5Hz,2H),7.77(d,J＝7.6Hz,2H),7.69-7.33(m,15H),7.13(d,J＝9.1Hz,1H),6.35-6.19(m,2H),6.05(dd,J＝9.1,2.5Hz,1H),5.70(d,J＝7.0Hz,1H),5.61(s,1H),4.98(d,J＝8.8Hz,1H),4.57-4.39(m,1H),4.40-4.03(m,10H),3.84(d,J＝6.9Hz,1H),3.33(t,J＝7.2Hz,1H),2.49(s,3H),2.24(s,3H),2.06-1.80(m,12H),1.70(s,5H),1.39-1.20(m,23H),0.89(t,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ217.21,203.75,171.18,169.84,169.45,168.98,167.65,167.14,167.00,142.54,136.75,133.64,133.56,132.91,131.98,130.24,129.22,129.13,128.72,128.64,128.57,127.27,126.59,119.23,109.97,84.44,81.07,79.14,76.44,75.57,75.13,74.47,72.09,68.15,68.02,63.75,58.51,52.75,46.68,45.58,43.20,37.07,35.54,31.89,29.60,29.53,29.40,29.32,29.06,28.92,27.67,26.84,24.86,24.79,24.19,22.72,22.67,22.16,20.82,14.80,14.11,9.62。
PTX-氨基甲酸酯-CDP的合成
该合成途径包括3部分，如以下插图所示：
第一部分由CDP-NH2的形成组成。后者从未在文献中描述过。首先，在NHS和DCC存在下激活CDP，以得到收率为60％的产物4。下一步是将二氨基乙烷链与CDP-NHS偶联以形成肽键。为了避免双偶联，通过基团(BOC)保护二氨基乙烷。在0℃下，将二氨基乙烷-BOC加入到CDP-NHS的无水DCM溶液中，得到产物5，收率为91％。然后在室温下在三氟乙酸存在下进行产物5的脱保护步骤，得到CDP-NH2，产物6；定量地，该产物无需进一步纯化即可用于下一步。
第二部分是用对硝基苯基氯甲酸酯活化紫杉醇，以得到PTX-PNPh。通过在吡啶存在下于-50℃在紫杉醇的无水二氯甲烷溶液中连续加入甲酸酯4小时来进行该反应。纯化后，得到PTX-PNPh，产物7，收率为45％。
第三部分在于在三乙胺存在下于-20℃下在无水DMF中将活化的紫杉醇PTX-PNPh与CDP-NH2偶联，得到PTX-氨基甲酸酯-CDP，产物8，收率为51％。
在含有紫杉醇(16.00mg，0.028mmol)和Et3N(10μL)的无水DMF(2ml)溶液的烧瓶中，在氩气和-30℃条件下滴加CDP和Et3N的无水DMF溶液。将混合物在-20℃下搅拌2:30小时。然后将其用饱和碳酸氢盐溶液稀释，并用AcOEt萃取。蒸发有机相，并将粗残余物通过硅胶色谱法(AcOEt:环己烷1:1)纯化。得到的产物为浅黄色粉末，收率为51％。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.16(d,J＝7.6Hz,2H),7.78(d,J＝7.5Hz,2H),7.69-7.31(m,15H),7.09(dd,J＝16.4,7.7Hz,1H),6.28(m,J＝18.3Hz,2H),6.09-5.87(m,2H),5.70(d,J＝7.0Hz,1H),5.50(d,J＝2.8Hz,1H),5.00(d,J＝10.0Hz,2H),4.27(m,J＝25.6Hz,4H),3.83(s,2H),3.32(t,J＝7.5Hz,2H),2.56(s,3H),2.45(s,6H),2.25(s,3H),1.95(s,3H),1.85(s,3H),1.67(d,J＝17.9Hz,10H),1.26(d,J＝9.8Hz,20H),0.90(t,J＝6.5Hz,3H).HRMS(ESI)+C29H89N4O16S3计算值为1325.5436，理论值为1325.5425。
PTX-碳酸酯-CDP的合成
使用PTX-PNPh和以醇官能团CDP-OH封端的RAFT CDP剂进行合成。将混合物在碱(DMAI)、PTX-碳酸酯-CDP存在下在无水DCM中于室温下搅拌48小时，得到PTX-碳酸酯-CDP，产物9，收率为65％。
在烧瓶中将活化的紫杉醇PTX-PNPh(60.00mg，0.058mmol)，CDP-OH(23.00mg，0.058mmol)和DMAP(8.30mg，0.068mmol)以及无水DCM(4ml)混合。将混合物在室温下搅拌48小时，避光。然后将其用DCM稀释并用饱和碳酸氢钠洗涤。有机相经Na2SO4干燥并蒸发。通过硅胶色谱法(Cyclo/AcOEt20->50％)纯化产物，所得产物为浅黄色粉末，收率65％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.17(d,J＝7.3Hz,2H),7.78(d,J＝8.0Hz,2H),7.72-7.30(m,15H),6.95(d,J＝9.1Hz,1H),6.32(s,2H),6.02(d,J＝8.5Hz,1H),5.71(d,J＝7.1Hz,1H),5.44(s,1H),5.00(d,J＝8.7Hz,1H),4.45(d,J＝6.8Hz,1H),4.35(d,J＝8.6Hz,1H),4.23(d,J＝7.2Hz,2H),3.84(d,J＝7.5Hz,1H),3.34(t,J＝7.3Hz,2H),2.49(s,3H),2.25(s,3H),2.01-1.85(m,10H),1.71(s,8H),1.39-1.13(m,20H),0.90(t,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ203.78,203.62,171.25,169.85,167.83,142.61,136.66,133.69,132.87,132.07,130.23,129.17,128.74,128.59,127.16,126.57,84.45,81.10,79.18,76.46,75.59,75.10,72.13,67.82,58.53,57.70,52.74,47.65,47.23,46.65,45.57,43.21,37.07,35.55,35.39,31.91,29.62,29.54,29.42,29.34,29.08,28.94,27.68,26.85,24.92,24.19,22.74,22.69,22.17,20.84,14.84,14.13,9.61。
具有不同化学键的紫杉醇-聚丙烯酰胺前药的合成
按照实施例2中所述的步骤，并使用合成的RAFT剂：PTX-二甘醇酸酯-CDP、PTX-氨基甲酸酯-CDP和PTX-碳酸酯-CDP合成具有不同化学键的紫杉醇的聚丙烯酰胺前药。得到以下聚合物：PTX-二甘醇酸酯-PAAm Mn 27.300，Mw/Mn 1.10；PTX-氨基甲酸酯-PAAm Mn27.100，Mw/Mn1.17；PTX-碳酸酯-PAAm Mn 27,800，Mw/Mn1.09。
紫杉醇在PBS和鼠血浆中的释放动力学
紫杉醇释放实验在PBS(吐温80，1％)和鼠血浆中进行。PTX、PTX-酯-PAAm(实施例2)、PTX-二甘醇酸酯-PAAm和PTX-碳酸酯-PAAm在PBS和鼠血浆中以相同浓度(1μg/ml当量PTX)于37℃下温育。在0、2h、4h、6h、24h和48h，取200μL样品进行定量。
样品制备：将200μl等分试样与600μl乙腈和20μl的1μg/ml氘代紫杉醇(PTX-d5)(内标)混合。在分析之前，将样品摇动15分钟并离心10分钟。
液相色谱条件：柱：C18柱(HILIC)(Nucleodur，EC 125/2，100-5-C18，麦克雷-内格尔(Macherey-Nagel)，霍尔特(Hoerdt)，法国)。流动相：含0.1％甲酸的乙腈/水(50/50)；持续时间：8分钟。
ESI-MS/MS条件：分析是在具有电喷雾电离接口(ESI)的三重四极杆质谱仪(TQD)检测器(QuattroUltima，沃特世(Waters)，基扬古尔(Guyancourt)，法国)上进行的。通过将纯分析物直接注入系统来优化电喷雾和质量参数。ESI参数：毛细管电压3.5kV、锥孔电压35V、源温度120℃、去溶剂化温度350℃、氮气流量506l/h。质量参数：转换监控如下：PTX854/286；PTX-d5859/291。校准：校准曲线在5-1000ng/ml范围内呈线性(在PBS中y＝0.0047x+0.0838R2＝0.9936，在鼠血浆中y＝0.0052x+0.0131R2＝0.9949)。释放曲线如图6和7所示。
具有碳酸酯或酯键的聚合物前药在PBS中的稳定性比具有二甘醇酸酯键的聚合物更好。在鼠血浆中观察到相同的趋势，但酯键和碳酸酯键定量释放出更多的活性分子(此处为PTX)。
实施例9：远螯聚合物
途径1：通过硫醇-马来酰亚胺偶联的生物缀合
合成分为不同阶段：首先，将肽偶联至具有马来酰亚胺官能团的连接子，然后修饰聚合物链末端的三硫代碳酸酯官能团以生成硫醇，然后将两个元素通过硫醚键偶联。
SMCC/肽偶联
第一步在于通过肽偶联将靶向配体偶联至连接子。环序列(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)的环状RGD具有源自赖氨酸残基的游离胺，其可用于将肽与连接子偶联。
将环状-RGD 5的三氟乙酸盐(50.00mg，0.083mmol)溶于无水DCM(3ml)中。逐滴添加DMF，直到固体溶解。加入DIPEA(0.023ml，0.12mmol)并搅拌溶液。在另一瓶中，将SMCC(27.70mg，0.083mmol)溶解在无水DCM(2ml)中，并将该溶液滴加到RGD溶液中。将所得溶液在室温下搅拌24小时。将粗混合物通过制备型HPLC(15分钟内H2O/ACN 10至50％)纯化并冻干，得到白色粉末(69.2mg)，收率51％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.39(m,酰胺质子),8.31(s,酰胺质子),8.29-8.13(m,酰胺质子),7.77(d,J＝8.6Hz,Ha),7.71(t,J＝5.4Hz,H精氨酸),7.23(m,Hl),7.15(dd,J＝10.2,4.3Hz,Hk),6.99(m,Hw),4.59(dd,J＝8.5Hz,Hi),4.44(s,Hg),4.26(s,He and Hm),4.13(m,Hf),3.23(d,J＝7.0Hz,Hv),3.08(m,Hq),2.95(m,Hb),2.63(m,Hj),2.19(dd,J＝16.3,4.8Hz,Hr),2.00(m,Hu),1.68(m,Hd or Hn),1.61(m,Hd or Hn),1.55-1.39(m,Ho/Hp/Hc),1.38-1.19(m,Ho/Hp/Hc),1.19-1.04(m,Ho/Hp/Hc)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ174.87,173.71,172.16,171.25,170.65,167.78,156.93,138.27,134.34,128.94,127.99,126.00,54.83,53.30,50.96,48.68,43.78,43.07,37.83,36.68,36.13,31.81,31.49,29.44,28.57,27.33,24.61,22.94。
插图4：RGD-SMCC缀合物的合成
反应粗产物的LC-MS分析使得可能突显所需RGD/SMCC缀合物的形成。
通过氨解修饰三硫代碳酸酯功能
为了实现硫醇-马来酰亚胺偶联，第二步骤在于在聚合物链的末端改性RAFT剂以得到硫醇。该反应通过氨解用胺切断CDP的三硫代碳酸酯官能团来进行。
将PTX-PAAm-CDP溶解在DMSO中，然后将溶液用氩气脱气10分钟。将丙胺和正三丁基膦加入溶液中，并在氩气气氛下于室温下搅拌48小时。在冷***中沉淀后，得到粉末形式的PAAm-SH。将该粉末重悬于DMSO中，并在Milli-Q水中透析3天。将溶液冻干，得到白色固体PTX-PAAm-SH。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.97(s,1H),8.00(d,J＝7.2Hz,2H),7.84(d,J＝7.4Hz,2H),7.70-7.46(m,13H),7.28-6.43(m,615H),6.31(s,2H),5.90(m,2H),5.66(m,2H),5.46(d,J＝7.0Hz,1H),5.41(d,J＝7.9Hz,1H),4.92(d,J＝10.0Hz,1H),4.65(d,J＝6.4Hz,1H),4.46(s,1H),4.08-4.00(m,3H),2.67(dd,J＝3.8,1.9Hz,4H),2.32(dd,J＝3.7,1.8Hz,6H),2.13(s,290H),1.66(s,141H),1.63(s,325H),1.25(s,12H),0.85(t,J＝7.0Hz,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ177.48；IRν＝3346,3196,2942,1655,1615,1451,1415,1347,1322,1123,519cm-1。
通过硫醚键合成生物缀合物的下一阶段包括马来酰亚胺连接子的硫醇与先前获得的聚合物的游离硫醇之间的偶联。
通过硫醚键获得的PTX-PAAm-RGD生物缀合物
2.途径2：通过肽偶联的生物缀合
PTX-PAAm-RGD生物缀合物的第二种合成途径代表了供选择的策略，该策略允许通过比硫醚键更稳定的肽键将肽与聚合物偶联。该合成首先包括通过自由基途径修饰三硫代碳酸酯基团以产生被羧酸封端的链，然后在于通过肽偶联来偶联靶向配体，例如根据以下合成：
ACPA和通过NHS预激活的ACPA
将PTX-PAAm-CDP(300mg，0.015mmol)、ACPA(84mg，0.30mmol)和DMSO加入圆底烧瓶中。将溶液用氩气脱气10分钟，然后加热到80℃，持续48小时。冷却溶液，并通过滴加到冷二***中使聚合物沉淀，得到粉末。将该粉末重悬于DMSO中，并在Milli-Q水中透析3天。将溶液冻干，得到白色固体PTX-PAAm-COOH，收率为50％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.97(m,1H),8.00(d,J＝7.4Hz,2H),7.85(d,J＝7.5Hz,2H),7.70(t,J＝7.3Hz,2H),7.62(t,J＝7.8Hz,2H),7.57-7.40(m,8H),7.40-6.35(m,756H),5.90(m,2H),5.67(m,2H),5.46(d,J＝6.8Hz,1H),5.42(m,1H),4.92(d,J＝10.4Hz,1H),4.64(d,J＝7.0Hz,1H),4.47(s,1H),3.64(d,J＝6.6Hz,2H),2.21(s,360H),1.69(s,186H),1.48(d,J＝42.9Hz,564H),1.25(s,9H),0.87(t,,J＝6.0Hz,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ177.32；IRν＝3346,3196,2937,1652,1613,1451,1417,1353,1322,1124,519cm-1。
然后将PTX-PAAm-COOH(80.00mg，0.004mmol)溶解于水(8ml)中。接下来，加入NHS(0.5000mg，0.0048mmol)和EDC.HCl(1.500mg，0.008mmol)。将混合物在室温下搅拌24小时。然后，加入环-RGD三氟乙酸酯(2.4mg，0.004mmol)和DIPEA(1.4μL，0.008mmol)，并将混合物再次搅拌24小时。在Milli-Q水中透析4天并冻干后，得到白色粉末PTX-PAAm-RGD(收率82％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.96(m,1H),8.00(d,J＝7.3Hz,2H),7.85(d,J＝7.2Hz,2H),7.71(t,J＝7.2Hz,2H),7.62(t,J＝7.5Hz,2H),7.48(m,11H),6.76(m,720H),5.90(m,2H),5.68(m,2H),5.46(d,J＝7.0Hz,1H),5.40(m,1H),4.92(d,J＝9.0Hz,1H),4.64(d,J＝6.6Hz,1H),4.46(s,1H),3.64(d,J＝7.1Hz,2H),2.29-1.95(m,333H),1.55(t,J＝53.7Hz,713H),1.25(s,8H),0.87(t,J＝6.9Hz,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ177.31；IRν＝3345,3195,2933,1652,1614,1452,1416,1351,1321,1123,491cm-1。
PTX-PAAm-Rho聚合物的合成
通过前述的硫醇-马来酰亚胺偶联方法进行该聚合物的合成。首先，将罗丹明和花青偶联到马来酰亚胺连接子上，然后在马来酰亚胺官能团和氨解后获得的PTX-PAAm聚合物的硫醇之间进行偶联。
将PTX-PAAm-SH(30.00mg，0.0015mmol)溶于烧瓶中的DMSO(1.5ml)中。在另一瓶子中，将罗丹明-马来酰亚胺(2.03mg，0.003mmol)和TEA(1μl，0.003mmol)溶于DMSO(1.5ml)中。将该溶液滴加到聚合物溶液中。将混合物在氩气下于室温下搅拌36小时，然后在水中透析三天。得到的PTX-PAAm-罗丹明为粉色粉末，收率为73％；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.97(s,1H),8.01(d,J＝7.0Hz,2H),7.85(d,J＝7.3Hz,2H),7.70(d,J＝7.4Hz,2H),7.66-7.60(m,2H),7.48(m,9H),7.36-6.28(m,524H),5.92(m 2H),5.47(d,J＝4.9Hz,1H),5.42(m,1H),4.93(d,J＝9.0Hz,1H),4.64(m,2H),4.46(s,1H),4.16(s,2H),3.64(d,J＝7.2Hz,2H),2.20(s,281H),1.70(s,123H),1.48(d,J＝43.7Hz,376H),1.26(s,11H),0.86(t,J＝7.0Hz,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ177.31；IRν＝3337,3190,2929,1651,1451,1411,1318,1121cm-1。
实施例10：SC毒性降低
体内测试表明，与目前临床上使用的紫杉醇制剂不同，根据本发明的组合物在注射后不会在SC组织中引起毒性。每天一次以30mg/kg(紫杉醇当量)的紫杉醇和聚合物-紫杉醇的SC给药，持续4天获得的结果，在注射部位使用紫杉醇显示毒性，而使用聚合物-紫杉醇没有毒性(图12)。
用根据本发明的聚合物与花青5.5偶联进行了相同的研究。游离的花青5.5对SC组织非常坏死，而花青5.5-PAAm不会引起任何SC毒性(一次以0.8mg/kg(花青当量)SC给药花青5.5(高)和花青5.5-聚合物(低))。
据发明人所知，发明人是第一个表明聚合物前药法使得有可能避免在SC注射后AI的刺激/坏死作用。
实施例11：毒性研究
已经在小鼠中研究了毒性。在D0注入大剂量PTX(紫杉酚的商业制剂)、PAAm(不含PA)、PTX-酯-PAAm(实施例2)和PTX-二甘醇酸酯-PAAm(实施例8)。跟踪小鼠的重量。体重减轻-10％表示严重的毒性体征。测试的各种制剂均未观察到毒性。结果如图9所示。
实施例12：药代动力学和生物分布研究(放射标记的PTX)
使用7周龄雌性BALB/c OlaHsd小鼠(
还对含有紫杉醇的聚丙烯酰胺化合物进行了药代动力学和生物分布研究。紫杉醇经过放射性标记，并通过酯键(稳定键)与聚合物偶联，因此可以在血液和各种器官(肝、肺、肾、脾、SC组织)中进行跟踪。放射性标记技术可以跟踪总紫杉醇(总紫杉醇＝偶联紫杉醇+非偶联紫杉醇)。商业紫杉醇用作对照。以7mg/kg的剂量(以紫杉醇当量计)，通过IV途径注射的紫杉醇的半衰期很短(几十分钟)。在相同剂量下，通过SC途径，其缓慢吸收和快速代谢的结合导致极低的血浆浓度(Cmax<1μg/mL)。静脉注射后，如用罗丹明定性显示的，紫杉醇与聚合物的偶联导致半衰期显著增加，并且注射后6天仍可检测到浓度。SC给药聚合物前药后，可获得与IV注射相当的显著的生物利用度(>85％)、快速吸收(在4h时Cmax)和半衰期。当将聚合物前药(总紫杉醇＝偶联紫杉醇+非偶联紫杉醇)与紫杉醇IV的AUC进行比较时，其AUC增加了70倍。因此，与聚合物偶联会阻止紫杉醇的代谢，从而延长紫杉醇的循环时间。
生物分布研究表明，紫杉醇主要在肝脏消除。根据药代动力学，对于紫杉醇聚合物是延迟的。在其他器官中，数量很少，无需担心积累。紫杉醇聚合物在注射部位的数量迅速减少，这证实了前药迅速进入循环，并证实了聚合物-紫杉醇的良好生物利用度。
因此，本发明使得可以增加活性成分的溶解性、高浓度下的稳定性和生物利用度。这些结果与前药方法相结合，令人惊讶地消除了对SC组织的毒性作用。
实施例13：药代动力学和生物分布研究
用荧光探针(罗丹明，实施例6)标记聚丙烯酰胺，并使用激发滤光片在500-535nm之间、滤光片发射在575-650nm之间的Lumina成像系统(PerkinElmer)在小鼠体内进行体内荧光监测。结果如图11所示。
通过SC途径注射的游离罗丹明具有良好的生物利用度(荧光在注射部位在24小时内减少)并被迅速消除。当通过IV途径注射罗丹明-PAAm时，注射后4天仍可检测到罗丹明。接枝到聚合物上可保护探针免受新陈代谢和***，半衰期大大增加。通过SC途径给药的罗丹明聚合物具有生物可利用性，并且循环时间增加(4天时仍存在)。这些结果表明，偶联至聚合物增加了活性分子的循环时间。因此，本发明对于一旦偶联就减慢活性成分的消除是有利的。
释放PTX更快的二甘醇酸酯键可以随着时间的流逝具有更高的浓度。释放速度较慢的酯键可延长释放时间。碳酸酯键释放较弱。
因此，可以根据如图8所使用的本发明的聚合物改变释放曲线。
无规和嵌段共聚物的合成
实施例14：吉西他滨-丙烯酰胺/丙烯腈共聚物-CDP的合成
以下实施例给出了具有极性分子作为接枝活性分子的聚合物的合成。
保护吉西他滨的羟基官能团
在烧瓶中，将4g(13.3mmol)盐酸吉西他滨与5.1g(33.8mmol)叔丁基二甲基氯硅烷和2.75g(40.4mmol)咪唑在6g(6.36ml)无水DMF中混合。然后滴加1.5g(2.07ml或14.9mmol)三乙胺。将混合物在25℃下搅拌24小时。
过滤咪唑盐，并蒸发DMF。加入饱和NaHCO3水溶液，并将该溶液用乙酸乙酯萃取(3次)。将有机EtOAc相分组并用盐水洗涤，然后经MgSO4干燥并浓缩。
将残余物通过硅胶快速色谱法(洗脱液：EtOAc)纯化。
获得5.94g白色粉末形式的GemTBDMS，即收率为93％。
GemTBDMS与CDP的偶联
将1.2g(2.97mmol)CDP添加到9g(10.12ml)无水THF和370mg(510μl或3.66mmol)三乙胺的混合物中。将混合物冷却至0℃，并将氯甲酸乙酯(190μl或2.03mmol)的溶液滴加到3.6g(4.05ml)THF中。在0℃下搅拌混合物30分钟。
将1g(2.03mmol)GemTBDMS溶液滴加到6g(6.36ml)DMF中。将反应混合物在20℃下搅拌2天。
蒸发挥发性溶剂。将获得的溶液用盐水稀释并用乙酸乙酯萃取。将EtOAc相分组并用盐水洗涤，然后经MgSO4干燥，然后在旋转蒸发仪中浓缩。
残余物通过硅胶快速色谱法(洗脱液：石油醚/EtOAc 4∶1)纯化。
获得699.4mg黄色/橙色糊形式的GemTBDMS-CDP，即收率为39.2％。
AAm-AN共聚物聚合物链的接枝
将3.73mg(0.023mmol)AIBN、45.88mg(0.114mmol)GemTBDMS-CDP、415.46mg(5.85mmol)AAA、152.87mg(2.88mmol)AN和2.40g(2.182ml)DMSO引入配有磁力棒的直瓶中。将烧瓶用隔膜密封，并将反应混合物用氩气鼓泡15分钟。将反应混合物引入预先加热至70℃的油浴中，并在搅拌下使反应进行24小时。
随后，将GemTBDMS-聚合物AAm-AN共聚物在甲醇中沉淀一次，然后干燥。
吉西他滨-TBDMS-P(AAm-co-AN)羟基官能团的脱保护
将约700mg聚合物溶解在5.5ml DMSO中(其中加入880μl TBAF)。将反应混合物在室温搅拌下放置45分钟。然后将全部沉淀在冷甲醇中。
1H NMR光谱证实了Gem-P(AAm-co-AN)的存在。
获得的产物特征在于25,700g/mol的摩尔质量。
实施例15：紫杉醇-聚合物AAm-AN共聚物的合成
根据实施例1的紫杉醇(PTX)与CDP的偶联
聚合物链的接枝AAm-AN共聚物
通过应用衍生自实施例1的接枝方法并加入丙烯腈单体，可获得几种紫杉醇-AAm/AN共聚物-CDP聚合物，并列于表1。该共聚物的优点来自于其UCST热敏性。
表1.获得的CDP-P(AAm-co-AN)、PTX-P(AAm-co-AN)聚合物合成原料的介绍
实施例16：透射率测量值与温度的关系
根据本发明人的知识，该实施例首次证明了通过引发剂活性成分方法接枝有活性分子的共聚物，该共聚物是热敏的并且具有UCST，见图1。
表2总结了透射率结果与温度的关系。
UCST确定为透射率达到约100％时的温度，即当聚合物完全溶解时的温度。
聚合物
摩尔质量(g/mol)
UCST(℃)
CDP-33％-5
5000
15
Gem-33％-5
25700
14
PTX-5％-34.4
34.400
26.5
PTX-10％-24.5
24.500
29.5
PTX-14％-18.2
18.200
30.0
PTX-19％-18.7
18.700
37.5
PTX-22％-22
22.000
49.5
PTX-24％-17.8
17.800
58.0
PTX-25％-14.6
14.600
>60.0
PTX-30％-14
14.000
>60.0
表2.合成的聚合物的特性。通过温度斜坡测量UCST。
实施例17：PTX-P二嵌段聚合物(AAm-co-AN)-b-PEGMA的合成
将1.7mg(0.01mmol)AIBN、100mg如实施例16所示合成的PTX-33％-10、37.5mg(0.125mmol)PEGMA和2.475g(2.25ml)DMSO引入配有磁棒的直瓶中。将烧瓶用隔膜密封，并将反应混合物用氩气鼓泡15分钟。将反应混合物引入预先加热至70℃的油浴中，并在搅拌下使反应进行5小时。
反应结束时，将聚合物在1升水中透析24小时。每4个小时更换一次水。透析后，将聚合物冻干。获得白色糊状薄片。
获得的产物的1H-NMR谱证实了在产物PTX-33％-10上PEGMA聚合的存在。
根据相同的方法，合成了其他PTX-P(AAm-co-AN)-b-PEGMA双嵌段共聚物，并列于表4中。
表4.合成的嵌段共聚物的特性。通过温度斜坡测量UCST。
对于每种PTX-P(AAm-co-AN)无规共聚物，添加长度为1400-2000g/mol的PEGMA链。
通过UV-可见光谱仪分析CP5-PEGMA和CP7-PEGMA，以确定它们的UCST分别为41℃和52℃，并且具有低滞后性(约1-2℃)。
通过比较CP5和CP5-PEGMA悬浮液获得的曲线，可以推断出UCST值由于PEGMA嵌段的亲水性而降低了几度。对比测试的结果如图2所示。
实施例18：聚合物前药PTX-PAAm-co-AN的溶解度与AN％的关系
测量了AN含量为0％-15％直至浓度为50mg/ml的PTX-(PAAm-co-AN)溶液的粘度。
粘度方法(取决于剪切速率)：
使用流变仪(ARG2，TA仪器)，其具有尺寸d＝20mm的平面几何形状以及溶剂杯，恒温控制在20℃并配有塑料溶剂罩。使用塑料移液器将样品滴到底部，并在溶剂杯中装满水。该设备将两个平面放置在200nm的距离处，并消除了多余部分，以避免寄生摩擦。
然后应用过程如下：
-样品在20℃下平衡2分钟。
-在从10-1000s-1的剪切速率范围内测量施加的扭矩(每十次测量5次，每次测量最大平衡3分钟)。
根据图13，粘度随丙烯腈含量的增加(高达5mol％)而降低，并且在PTX-P(AAm-co-AN)中已证明其效果高达50mg/ml。
实施例19：PTX-21％-5的毒性测试
在具有PTX-21％-5的小鼠中进行了局部毒性测试。在一组3只“裸”小鼠中，皮下给药在200μl PBS溶液中0.6mg PTX。连续4天重复注射4次。在第三天结束时，所有小鼠的注射部位附近均出现局部毒性(急性刺激、轻微坏死)，如图3所示。
用聚合物前药PTX-21％-5配制的相同剂量的紫杉醇(对应于17.6mg/ml的聚合物浓度)。如图3所示，四次注射后，3只小鼠的组均未显示局部毒性。