具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

鼠源4T1乳腺癌细胞株购自中国科学院细胞库(上海)，使用含1％双抗与10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，培养箱条件为5％CO₂，95％空气，37℃，恒湿环境。所有动物实验均严格按照医院伦理委员会批准的动物研究指南进行。实验用雌性Balb/c小鼠购自成都达硕实验动物有限公司。用4T1细胞建立皮下瘤肿瘤模型，并用于体内分布和成像研究。

实施例1、本发明糖基聚合物的制备

化合物Maleimide-Ppa、MA-PySS和MA-D-galactosamine按文献1和文献2报道的方法合成。

文献1(Pan D,Zheng X,Zhang Q,et al.Dendronized-Polymer DisturbingCells'Stress Protection by Targeting Metabolism Leads to Tumor Vulnerability[J].Advanced Materials,2020,32:1907490.)报道了Maleimide-Ppa和MA-PySS的合成方法，具体合成路线如下：

Maleimide-Ppa：

MA-PySS：

文献2(Wartchow C A,Wang P,Bednarski M D,et al.Carbohydrate ProteaseConjugates:Stabilized Proteases for Peptide Synthesis[J].The Journal ofOrganic Chemistry,1995,60:2216-2226.)报道了MA-D-galactosamine的合成方法。

Maleimide-Ppa的结构为：其中Ppa为光敏剂焦脱镁叶绿酸-a(Pyropheophorbide a)结构部分。MA-Pyss的结构为：MA-D-galactosamine的结构为：

1、酶敏感的功能化链转移剂MA-GFLGK-CTA的制备

酶敏感的功能化链转移剂MA-GFLGK-CTA的合成路线如图1所示。MA-GFLGK-CTA按文献3报道的类似方法合成(文献3：Sun L,Li X,Wei X,et al.Stimuli-ResponsiveBiodegradable Hyperbranched Polymer–Gadolinium Conjugates as Efficient andBiocompatible Nanoscale Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents[J].ACSApplied Materials&Interfaces,2016,8:10499-10512.)。具体合成方法如下：

MA-GFLG-OH(4.6g，10mmol)、HOBt(1.49g，11mmol)与缩合剂HBTU(4.26g，11mmol)置于圆底烧瓶中，氮气保护，冰浴下加入超干的DMF(50mL)使其溶解。将DIPEA(6.7mL，40mmol)滴加到体系中反应0.5小时。称取H-Lys(O^tBu)-Fmoc·HCl(4.62g，10mmol)加入到体系中，混合溶液在冰浴下反应0.5小时后回至室温反应10小时。加入450mL乙酸乙酯(EA)溶解，再依次用饱和碳酸氢钠溶液(100mL×3)、1M稀盐酸(100mL×3)和饱和氯化钠溶液(100mL×3)洗涤，收集有机相，无水硫酸镁干燥后浓缩，4℃静置后析出晶状白色固体MA-GFLGK(O^tBu)-NHFmoc(6.51g，7.51mmol，产率75.1％)。¹H NMR(400MHz，δin ppm)，¹³C NMR(100MHz，d₆-DMSO，δin ppm)，LC-MS(ES+)：m/z＝867.2[M+H]⁺。MALDI-HRMS:m/z＝889.4474[M+Na]⁺。

冰浴下，MA-GFLGK(O^tBu)-NHFmoc(4.33g，5mmol)用40mL DCM/TFA(v:v＝1:9)的混合溶液溶解，回至室温反应。TLC监测，待反应完全后旋转蒸发除去溶剂，加入乙醚后析出白色固体粉末，得到的白色固体粉末用乙醚洗涤两次并干燥得产物MA-GFLGK(OH)-NHFmoc(3.61g，4.45mmol，产率89.0％)。¹H NMR(400MHz，δin ppm)，¹³C NMR(100MHz，d₆-DMSO，δinppm)，LC-MS(ES+)：m/z＝811.3[M+H]⁺，834.3[M+Na]⁺，MALDI-HRMS：m/z＝833.3842[M+Na]⁺。

以MA-GFLGK(OH)-NHFmoc为原料，采用固相多肽合成法，经以下步骤合成功能单体MA-GFLGK-CTA。MA-GFLGK(OH)-NHFmoc(1.62g，2mmol)与DIPEA(0.67mL，4mmol)溶于10mLDMF后加入氯三苯甲基氯树脂(5.0g，1.15mmol/g)反应2小时。将树脂移至聚丙烯管中，用DCM:MeOH:DIPEA(v:v:v＝17:2:1)(100mL)的混合溶液冲洗3次，再分别用DCM和DMF冲洗3次。Fmoc保护基团用50mL含20％哌啶的DMF处理三次后加入氰基戊酸二硫代苯甲酸(CTA-COOH，2.79g，10mmol)、DIC(1.26g，10mmol)和HOBt(1.35g，10mmol)，反应12小时。产物用TFE/DCM(v:v＝3:7)在室温下处理2小时并通过过滤除去树脂。将母液减压浓缩，溶于少许甲醇后加入到乙醚中沉淀纯化，再通过高效液相色谱进一步纯化，得到粉红色固体产物MA-GFLGK-CTA(892mg，1.05mmol，产率52.5％)。¹H NMR(400MHz，δin ppm)，¹³C NMR(100MHz，d₆-DMSO，δin ppm)，LC-MS(ES+)：m/z＝851.3[M+H]⁺。MALDI-HRMS：m/z＝848.3408[M-H]^-，870.3181[M+Na-2H]^-。

2、酶敏感的功能化交联剂MA-GFLGKGLFG-MA的制备

组织蛋白酶B敏感的功能化交联剂MA-GFLGKGLFG-MA合成路线如图2所示。MA-GFLGKGLFG-MA按文献3报道的类似方法合成(文献3：Sun L,Li X,Wei X,et al.Stimuli-Responsive Biodegradable Hyperbranched Polymer–Gadolinium Conjugates asEfficient and Biocompatible Nanoscale Magnetic Resonance Imaging ContrastAgents[J].ACS Applied Materials&Interfaces,2016,8:10499-10512.)。具体合成方法如下：

BocNH-GFLG-OH(2.46g，5mmol)、HOBt(743mg，5.5mmol)和HBTU(2.13g，5.5mmol)置于圆底烧瓶，并在氮气保护下加入20mL超干DMF。冰浴下加入DIPEA(3.35mL，20mmol)反应0.5小时。向体系中加入H-Lys(OCH₃)-OH·2HCl(583mg，2.5mmol)后回至室温反应20小时。将反应液加入到250mL乙酸乙酯中，依次用饱和碳酸氢钠溶液(20mL×3)、1M稀盐酸(20mL×3)和饱和氯化钠溶液(20mL×3)洗涤，收集有机相，无水硫酸镁干燥后浓缩，置于4℃结晶得到白色固体产物BocNH-GFLGKGLFG-NHBoc(1.62g，1.46mmol，产率58.4％)。¹H NMR(400MHz，δin ppm)，¹³C NMR(100MHz，δin ppm)，LC-MS(ES+)：m/z＝1109.4[M+H]⁺，MALDI-HRMS：m/z＝1131.6045[M+Na]⁺。

将BocNH-GFLGKGLFG-NHBoc(1.33g，1.2mmol)置于氮气保护的圆底烧瓶中，冰浴下加入25mL DCM/TFA(v:v＝1:1)混合溶液，回至室温反应12小时后旋去溶剂，加入无水乙醚两次后抽干得到白色的固体中间产物，将其溶于100mL H₂O/ACN(v:v＝4:1)的混合溶液中，冰浴下滴加1M的NaOH溶液调节pH至7-8，然后将甲基丙烯酰氯(0.3mL，3mmol)溶于乙腈(ACN)后滴加到体系中，与此同时缓慢滴加1M的NaOH溶液使体系维持在pH＝10，冰浴下反应1小时后置于室温反应4小时，将反应液加入200mL乙酸乙酯中，用1M的稀盐酸调节pH至2-3，水相用EA萃取三次合并有机相用氯化钠溶液(20mL×3)洗涤，最后用无水硫酸镁干燥后浓缩，所得浓缩液置于4℃结晶得到白色固体产物MA-GFLGKGLFG-MA(700mg，0.68mmol，产率56.7％)。¹H NMR(400MHz，δin ppm)，¹³C NMR(100MHz，δin ppm)，LC-MS(ES+)：m/z＝516.3[M+2H]²⁺，1031.4[M+H]⁺。MALDI-HRMS：m/z＝1031.5506[M+H]⁺，1053.5377[M+Na]⁺，1029.5364[M-H]^-。

3、可降解的支化/交联糖基聚合物光动力治疗体系的构建与制备

可降解的支化/交联糖基聚合物光动力治疗体系的合成路线如图3所示。具体合成方法如下：

单体MA-D-Galactosamine(1446mg，4.63mmol)、MA-PySS(100mg，0.39mmol)、交联剂MA-GFLGKGLFG-MA(23.5mg，22.8μmol)、链转移剂MA-GFLGK-CTA(53.0mg，62.4μmol)与引发剂VA044(6.7mg，20.8μmol)溶于H₂O/CH₃OH(7.2mL，1:4，v/v)的混合溶液中，将聚合瓶避光置于冰浴中并通氩气鼓泡除氧45分钟后将其密闭，避光置于45℃油浴反应12小时，用液氮淬灭反应后将反应液低温透析冻干，得淡红色固体Branched-GFLG-poly D-galactosamine-PySS(B-gala-PySS，1480mg，产率91.2％)。聚合物前体Branched-GFLG-poly D-galactosamine-PySS(B-gala-PySS)的氢谱如图4所示。

将1300mg B-gala-PySS溶于10mL水溶液，加入1000mg二硫苏糖醇(DTT)处理过夜后透析(4℃，MWCO 3.5KDa)2天，样品用水相滤头处理后冻干得到白色固体粉末Branched-GFLG-poly D-galactosamine-SH(B-gala-SH，1150mg，产率88.5％)。聚合物前体Branched-GFLG-poly D-galactosamine-SH(B-gala-SH)的氢谱如图5所示。

Branched-GFLG-poly D-galactosamine-S-Ppa(BSP)按如下方法制备：500mg B-gala-SH溶于5mL RO H₂O后加入10mL DMSO配制成B-gala-SH/DMSO混合液，75mgMaleimide-Ppa溶于2mL DMSO后搅拌下滴加到B-gala-SH/DMSO混合液中将得到的墨绿色溶液，于室温环境避光反应过夜后透析(避光，MWCO 3.5KDa)2天除去DMSO，离心(7000rpm×5min)后取上清液经水相滤头(0.45μm)过滤，滤液冻干得黑绿色固体粗品(504mg，产率87.7％)。将粗品用2mL水溶解后滴加到200mL乙腈中出现大量沉淀，离心(10000rpm×5min)处理后收集固体残留物并重复处理纯化三次，得到的固体再次溶于20mL去离子水后冻干得产物(BSP，420mg)。聚合物Branched-GFLG-poly D-galactosamine-S-Ppa(BSP)的氢谱如图6所示。

BSP的氨基酸分析结果如表1所示。

表1.糖基支化/交联聚合物BSP的氨基酸分析结果

一般而言，聚合物载体在生物体内有效代谢的肾阈值约为50kDa，因而需要保证降解后的聚合物主链分子量低于这一水平。研究发现，本发明糖基聚合物材料能在酶作用下迅速降解，4小时后的降解产物(Mn＝32.4×10³,Mw＝46.7×10³,PDI＝1.44)有着较好的均一性，其分子量低于肾阈值。

实施例2、BSP包载药物奥拉帕尼的制备

通过透析法制备，称取300mg BSP溶于5mL去离子水并加入10mL DMSO。30mg奥拉帕尼(Olaparib)溶于2mL DMSO后滴加到含有BSP的H₂O/DMSO混合溶液。避光搅拌过夜，将反应液透析(3.5kDa MWCO)2天去除DMSO溶剂，然后用水相滤膜处理后冻干，得到包载奥拉帕尼的聚合物，聚合物命名为BSPO(O代表olaparib)。

实施例3、本发明细胞膜-糖基聚合物的制备

将正常培养的4T1细胞(贴壁密度80～90％)刮下收集到磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，通过离心(700g×7min)收集细胞沉淀。再将其在含有蛋白酶抑制剂混合物的PBS中重悬。用不含聚碳酸酯多孔膜的Avanit微型挤出器挤压20次使得细胞被完全破坏。将所得的溶液依次低温离心分离(1000g×15min，3000g×15min，10000g×30min；4℃)，取含有细胞膜的上清液(细胞膜的TEM结果如图7a所示)。将上清液与含BSPO的水溶液混合搅拌过夜(4℃)后离心收集(20000g×30min)，所得沉淀即为目标产物，命名为CM-BSPO，重悬后用TEM观察其形貌，如图7b所示，能够明显的观察到糖基聚合物外围的细胞膜结构，表明细胞膜的成功包裹。

对照例1、Branched-GFLG-poly D-galactosamine-S-hexyl-Ppa(BShP)的制备

1、功能化光敏剂Maleimide-hexyl-Ppa的制备

功能化光敏剂的合成路线如图8所示。

称取马来酰亚胺丙酸(Maleimide-COOH，1.17g，6.9mmol)和缩合剂HATU(3.74g，9.85mmol)溶于10mL DMF，冰浴下加入DIEA(3.2mL，18.3mmol)反应5分钟后再将N-Boc-1,6-己二胺盐酸盐(1.80g，8.3mmol)加入体系反应2小时。将50mL饱和碳酸氢钠溶液和30mL DCM加入到反应液中，收集有机相并将水相用DCM萃取三次，合并有机相并用饱和碳酸氢钠溶液、稀盐酸和饱和氯化钠溶液洗涤两次，无水硫酸镁干燥后去除溶剂得到黄色固体粗产物。过柱纯化(CH₃OH:DCM＝1:20，v/v)后用高效液相色谱进一步分离纯化，得到无色液体产物Maleimide-hexyl-NHBoc(1.66g，产率65.4％)。¹H NMR(400MHz，δin ppm)，¹³C NMR(100MHz，δin ppm)，LC-MS(ES+)：m/z＝368.3m/z[M+H]⁺，390.2m/z[M+Na]⁺。MALDI-HRMS：m/z＝390.2000[M+Na]⁺。

在0℃下，将Maleimide-hexyl-NHBoc(220mg，0.60mmol)溶于10mL DCM中后加入10mL TFA，反应过夜后除去溶剂，残留物通过无水乙醚处理得到固体粉末。将上步所得的固体粉末、焦脱镁叶绿酸a(270mg，0.50mmol)与缩合剂HATU(285mg，0.75mmol)溶于DCM中并加入DIEA(0.23mL，1.33mmol)，反应液在室温下反应1.5小时后旋去溶剂，过柱纯化(DCM:CH₃OH＝30:1-20:1，v/v)得到黑色固体粉末Maleimide-hexyl-Ppa(237mg，产率50.5％)。¹HNMR(400MHz，δin ppm)，LC-MS(ES+)：m/z＝784.4m/z[M+H]⁺。MALDI-HRMS：m/z＝806.3995[M+H]⁺，m/z＝822.3678[M+K]⁺。

2、Branched-GFLG-poly D-galactosamine-S-hexyl-Ppa(BShP)的制备

Branched-GFLG-poly D-galactosamine-S-hexyl-Ppa(BShP)按如下方法制备：500mg B-gala-SH溶于5mL RO H₂O后加入10mL DMSO配制成B-gala-SH/DMSO混合液，80mgMaleimide-hexyl-Ppa溶于2mL DMSO后搅拌下滴加到B-gala-SH/DMSO混合液中得到墨绿色溶液，于室温环境避光反应过夜后透析(避光，MWCO 3.5KDa)2天除去DMSO，离心(7000rpm×5min)后取上清液经水相滤头(0.45μm)过滤，滤液冻干得黑绿色固体粗品(520mg，产率89.7％)。将粗品用2mL水溶解后滴加到200mL乙腈中出现大量沉淀，离心(9000rpm×5min)处理后收集固体残留物并重复处理纯化三次，得到的固体再次溶于20mL去离子水后冻干得产物(BShP，450mg)。聚合物Branched-GFLG-poly D-galactosamine-S-hexyl-Ppa(BShP)的氢谱如图9所示。

对照例2、线性糖基聚合物光动力治疗体系的制备

线性糖基聚合物光动力治疗体系的合成路线如图10所示：

作为对照，设计合成了线性糖基聚合物光动力治疗体系。单体MA-D-Galactosamine(722mg，2.31mmol)、MA-PySS(50mg，0.20mmol)、链转移剂4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(CTA，5.3mg，19.0μmol)与引发剂VA044(2.1mg，6.5μmol)溶于H₂O/CH₃OH(3.5mL，1:4，v/v)的混合溶液中，将聚合瓶避光置于冰浴中并通氩气鼓泡除氧45分钟后将其密闭，避光置于45℃油浴反应12小时，用液氮淬灭反应后将反应液低温透析冻干，得淡红色固体Linear-poly D-galactosamine-PySS(L-gala-PySS：725mg，产率93.3％)。聚合物前体Linear-poly D-galactosamine-PySS的氢谱如图11所示。

将620mg L-gala-PySS溶于10mL水溶液，加入600mg DTT处理过夜后透析(4℃，MWCO 3.5KDa)2天，样品用水相滤头处理后冻干得到白色固体粉末Linear-poly D-galactosamine-SH(L-gala-SH，560mg，产率93.3％)。聚合物前体Linear-poly D-galactosamine-SH的氢谱如图12所示。

Linear-poly D-galactosamine-S-Ppa(LSP)的制备与可降解的支化/交联糖基聚合物光动力治疗体系的制备方法类似：500mgL-gala-SH溶于5mL RO H₂O后加入10mL DMSO配制成L-gala-SH/DMSO混合液，80mg Maleimide-Ppa溶于2mL DMSO后搅拌下滴加到L-gala-SH/DMSO混合液中得到的墨绿色溶液，于室温环境避光反应过夜后透析(避光，MWCO3.5KDa)2天除去DMSO，离心(7000rpm×5min)后取上清液经水相滤头(0.45μm)过滤，滤液冻干得黑绿色固体粗品(512mg，产率88.3％)。将粗品用2mL水溶解后滴加到200mL乙腈中出现大量沉淀，离心(10000rpm×5min)处理后收集固体残留物并重复处理纯化三次，得到的固体再次溶于20mL去离子水后冻干得产物(LSP，496mg)。聚合物Linear-poly D-galactosamine-S-Ppa(LSP)的氢谱如图13所示。

对照例3、基于HPMA的可降解支化/交联聚合物光动力治疗体系的制备

作为糖基材料的对照，设计合成了基于HPMA的可降解支化/交联聚合物光动力治疗体系。基于HPMA的可降解支化/交联聚合物光动力治疗体系的合成路线如图14所示。

具体合成方法如下：

单体HPMA(722mg，5.04mmol)、MA-PySS(50mg，0.20mmol)、交联剂MA-GFLGKGLFG-MA(11.8mg，11.4μmol)、链转移剂MA-GFLGK-CTA(26.5mg，31.2μmol)与引发剂VA044(3.4mg，10.4μmol)溶于H₂O/CH₃OH(3.6mL，1:4)的混合溶液中，将聚合瓶避光置于冰浴中并通氩气鼓泡除氧45分钟后将其密闭，避光置于45℃油浴反应12小时，用液氮淬灭反应后将反应液低温透析冻干，得淡红色固体Branched-GFLG-poly HPMA-PySS(B-HPMA-PySS，740mg，产率91.2％)。聚合物前体Branched-GFLG-poly HPMA-PySS的氢谱如图15所示。

将640mg B-HPMA-PySS溶于10mL水溶液中，加入1000mgDTT处理过夜后透析(4℃，MWCO 3.5KDa)2天，样品用水相滤头处理后冻干得到白色固体粉末Branched-GFLG-polyHPMA-SH(B-HPMA-SH，600mg，产率93.8％)。聚合物前体Branched-GFLG-poly HPMA-SH的氢谱如图16所示。

Branched-GFLG-poly-HPMA-S-Ppa(BHSP)的制备如下：500mg B-HPMA-SH溶于5mLRO H₂O后加入10mL DMSO配制成B-HPMA-SH/DMSO混合液，80mg Maleimide-hexyl-Ppa溶于2mL DMSO后搅拌下滴加到B-HPMA-SH/DMSO混合液中得到的墨绿色溶液，于室温环境避光反应过夜后透析(避光，MWCO 3.5KDa)2天除去DMSO，离心(7000rpm×5min)后取上清液经水相滤头(0.45μm)过滤，滤液冻干得黑绿色固体粗品(500mg，产率86.2％)。将粗品用2mL水溶解后滴加到200mL丙酮中出现大量沉淀，离心(9000rpm×5min)处理后收集固体残留物并重复处理纯化三次，得到的固体再次溶于20mL去离子水后冻干得产物(BHSP，460mg)。聚合物Branched-GFLG-poly HPMA-S-Ppa(BHSP)的氢谱如图17所示。

以下通过具体试验例证明本发明的有益效果：

试验例1、糖基聚合物的表征

1、糖基聚合物的粒径与电位测定

称取BSP、BShP、LSP，纯水溶解稀释至终浓度为1.0mg/mL，使用粒度仪表征样品粒径和Zata电位(每次测量重复三次)，最终数据使用GraphPad Prism软件进行分析。同时将浓度为200μg/mL的样品滴加到铜网上自然风干，使用透射电镜观察粒径大小与形貌。

通过透射电镜观察到各组材料的形貌如图18所示。BShP的组装体呈十分均匀的圆形纳米粒；相较而言BSP形成的纳米粒则并不是太规则，但也能观察到类似圆形的形貌；而不具有支化/交联结构的LSP则呈松散的丝状分布，没有聚集形成特殊形貌。

如图19所示：通过DLS测得BSP、BShP和LSP的粒径分别约为238nm、164nm和374nm，即BShP形成的粒子最为致密，BSP却相对松散但仍保持纳米粒子形态。三组材料的Zeta电位分别为-16.81mV、-19.23mV和-21.97mV，均为电负性。

2、糖基聚合物的体外ROS产生测定

将BSP、BShP和LSP溶解稀释至光敏剂焦脱镁叶绿酸-a(Pyropheophorbide a,Ppa)浓度为5.0μg/mL，同时加入SOSG检测试剂至终浓度为2.5μM。吸取各组溶液100μL至96孔板，并设3个复孔，随后用660nm激光进行辐照(功率密度：10mW/cm²，持续时间：15min)。在0.5、1、1.5、2、3、5、10、15min时间点用多功能酶标仪测定荧光强度(激发波长为490nm，发射波长为525nm)并记录各样品在525nm波长处的荧光强度。用PBS作为空白对照。

Ppa能吸收特定波长光子而从基态跃迁到激发态，随后将吸收的能量转移到附近的氧气分子产生单线态氧。Ppa经光照激发产生的ROS可以通过试剂盒检测。其中，单线态氧荧光探针(Singlet oxygen sensor green,SOSG)是一种对单线态氧具有高度选择性的检测试剂，该指示剂最初具有弱蓝色荧光，与单线态氧作用后会发出与荧光素相似的绿色荧光(最大激发/发射波长约为504/525nm)，绿色荧光强弱与产生的ROS量成正相关。如图20所示，在吸收660nm激发能量后，BSP所产生的荧光强度最强，LSP次之，BShP最弱，且BSP荧光强度显著高于LPS和BShP。说明BSP体外ROS产生的量和效率更高，而BShP和LSP的ROS产生效率则相对较低。进一步说明BSP对肿瘤有更好的杀伤作用。

3、糖基聚合物体外IC50值测定

将4T1细胞按5×10⁴个/每孔的细胞浓度接种于96孔板中，待细胞贴壁(约孵育12小时)后吸弃培养基，加入用培养基配制的含BSP、LSP和BShP的梯度浓度(Ppa浓度：50、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.01μg/mL)溶液后继续孵育6小时，孵育完成后分别给予2J/cm²剂量光照，再孵育12小时后根据试剂盒说明书使用CCK8试剂，通过酶标仪检测450nm左右吸光度。使用GraphPad Prism(vison 8.0)软件对测定结果进行作图分析。

通过体外细胞实验进行了IC₅₀值的比较(图21)。在同样的Ppa浓度梯度、光照剂量以及培养条件下，三组聚合物IC50值分别为BSP 0.25μg/mL，LSP 0.91μg/mL，BShP 4.8μg/mL，说明BSP肿瘤细胞杀伤效果最强。

4、糖基聚合物体内肿瘤部位信号检测

1×10⁶个4T1细胞接种于Balb/c小鼠(20克，6-8周龄)侧腹部，待肿瘤生长到直径约5mm左右开始进行实验。将小鼠随机分为3组(每组5只)，分别经尾静脉注射Ppa浓度为5mg/kg的不同组材料(BSP、BShP和LSP)。于注射完成不同时间点(5min、30min、1h、3h、6h、12h和24h)通过活体荧光成像系统观察肿瘤部位荧光信号，并通过数据分析系统处理数据并分析。

结果表明，BSP材料在注射后肿瘤部位荧光强度逐渐升高，6小时左右达到最高，并且在各个时间点的肿瘤部位荧光强度均远高于LSP和BShP组(图22)。

在同样Ppa浓度下，BSP无论是体外ROS的产生量、对肿瘤细胞的毒性作用和在肿瘤组织聚集度均高于LSP和BShP，这保证了光动力治疗的效果。BSP可作为光敏剂，用于光动力治疗肿瘤具有优异的效果。

试验例2、糖基聚合物包载奥拉帕尼及其表征

1、聚合物包载奥拉帕尼

聚合物包载奥拉帕尼通过透析法制备，称取300mg LSP、BSP、BShP及BHSP分别溶于5mL去离子水并加入10mL DMSO，得到含有材料的H₂O/DMSO混合溶液。30mg奥拉帕尼(Olaparib)溶于2mL DMSO后滴加到含有材料的H₂O/DMSO混合溶液。避光搅拌过夜，将反应液透析(3.5kDa MWCO)2天去除DMSO溶剂，然后用水相滤膜处理后冻干，得到包载奥拉帕尼的聚合物，聚合物依次命名为LSPO、BSPO、BShPO和BHSPO(O代表olaparib)。

2、奥拉帕尼包载量的测定

LSP、BSP、BShP和BHSP对于奥拉帕尼的包载量通过HPLC结果计算。载药量(wt％)＝(包载的药物的质量/聚合物与包载药物的总质量)×100％。将各组材料分别用流动相溶解后超声，并将有机相滤头处理后的滤液进行HPLC检测。色谱柱型号为(Column name:Shim-pack GLST，C18，5μm.Size:250×4.6mm I.D.)，测试柱温为30℃，流速为1.0mL/min，进样量为20μL，样品浓度约为100μg/mL，检测器选择为UV light(276nm)，流动相为CH₃OH/H₂O(v:v＝1:1)的混合溶液。

结果如表2所示。BSP聚合物的包载量最高，达到4.03％；BShP的包载量为2.17％，差于BSP。相较而言，对照材料LSP和BHSP无法有效包载小分子药物，其包载量分别仅为0.33％和0.13％。说明BSP“合适”的组装堆叠形态能够包载更多的小分子药物。通过HPLC收集包载的小分子药物进行检测，HRMS结果表明olaparib仍然为活性原药(图23)。

表2.各组聚合物的Ppa含量及对应Olaparib的包载量

试验例3、细胞膜-糖基聚合物的效果研究

本研究采用方差分析(Analysis of variance，简称ANOVA)进行多重比较的统计学分析，***表示p<0.01具有非常显著差异，**表示p<0.05具有显著差异，ns表示无显著性差异。

一、肿瘤部位聚集活体荧光检测

1、试验方法

将1×10⁶个4T1细胞接种于Balb/c小鼠(20克，6-8周龄)背部，待肿瘤生长到体积约50mm³左右开始进行实验。将肿瘤模型小鼠随机分为4组，每组5只，分别经尾静脉注射Ppa浓度为5mg/kg的不同组材料(游离Ppa、实施例1制备的BSP、实施例2制备的BSPO和实施例3制备的CM-BSPO)。注射完成后，于不同时间点(1小时、4小时、8小时、1天、2天、4天和7天)通过活体荧光成像系统(IVIS，PerkinElmer，美国)观察肿瘤部位荧光信号，并通过数据分析系统处理数据并分析。

2、试验结果

如图24所示，游离Ppa注射进入小鼠体内后约4小时观察到最高的荧光信号强度，随后时间点内肿瘤部位的荧光信号强度逐渐降低，大约在2天后基本不能观察到肿瘤部位的荧光信号。小分子光敏剂游离Ppa分子量约为548，能在体内经肾脏代谢快速排出体外；同时由于没有纳米结构和尺寸，无法通过被动靶向在肿瘤部位有效聚集，所以观察到荧光信号快速降低并消失。BSP和BSPO组注射到小鼠体内后，其在肿瘤组织的荧光信号在前8小时内逐步增强而后开始缓慢降低，但在第7天仍然能够检测到较高的荧光信号，说明BSP、BSPO能够在小鼠肿瘤部位聚集并有效滞留。相比与BSP和BSPO，表面包裹了肿瘤细胞膜的CM-BSPO在小鼠肿瘤部位的荧光信号在前几小时内明显更高，且这一高荧光强度信号的持续时间更长。通过荧光信号半定量并做信号变化曲线图(如图25)发现，游离Ppa的信号变化曲线比较陡峭，在4小时后迅速下降直至消失，而BSP和BSPO组信号持续到1天左右才开始缓慢下降，7天后仍然能够检测到荧光信号。CM-BSPO组在各个时间点的信号强度都比BSP和BSPO高，说明其在肿瘤部位的聚集更加明显。与游离Ppa相比，聚合物给药系统的体内代谢时间明显延长，这不仅增加了光敏剂和奥拉帕尼在肿瘤部位的聚集强度，也延长了光动力治疗的窗口期，有效提高了肿瘤光动力治疗和奥拉帕尼联合应用的作用时间。

二、小鼠肿瘤模型体内抗肿瘤治疗

1、试验方法

小鼠肿瘤模型的肿瘤治疗流程图如图26所示。将1×10⁶个4T1细胞接种于Balb/c小鼠(20克，6-8周龄)背部，待肿瘤生长到体积约50mm³左右(约7天)开始进行实验。将肿瘤模型小鼠随机分为10组，每组5只：

光照组(+L)共5组，分为：CM-BSPO+L、BSPO+L、BSP+L、Ppa+L和Saline+L；

未光照组(-L)共5组，分为：CM-BSPO-L、BSPO-L、BSP-L、Ppa-L和Saline-L。

分别经尾静脉注射Ppa浓度为5mg/kg的BSP、BSPO、CM-BSPO和生理盐水。注射完成后12小时，光照组用660nm激光器进行光照，光照剂量为2J/cm²，每隔2天进行一次光动力治疗，共进行3次，治疗过程中测量监测肿瘤体积。

①MRI、CT等影像手段检测肿瘤治疗效果

进行光动力治疗的同时，通过磁共振成像(MRI)来测量肿瘤的大小。肿瘤部位的MR图像通过7T MRI扫描仪获取。MRI序列的参数如下：TR＝100ms，TE＝2.5ms，FOV：40mm×40mm，矩阵：256×256，扫描时间＝128s。同时治疗20天后，通过Micro-CT仪器进行小鼠胸部扫描，以观察肿瘤在小鼠双肺中的转移情况。

②肿瘤组织切片HE染色及免疫组化染色

治疗结束后(实验第19天)，小鼠安乐死后收集肺脏和肿瘤组织，多聚甲醛(4％溶于pH 7.4的PBS)固定24小时后，石蜡包埋并切片。肺脏经HE染色后拍照获取图像。肿瘤组织经过处理后进行CD31和Ki67免疫组化染色，拍照获取图像。

2、试验结果

(1)肿瘤体积

不同治疗组每只老鼠肿瘤体积变化如图27所示，光照组(+L)分为：CM-BSPO+L、BSPO+L、BSP+L、Ppa+L和Saline+L；同样，未光照组(-L)分为：CM-BSPO-L、BSPO-L、BSP-L、Ppa-L和Saline-L。将不同治疗组小鼠肿瘤体积进行统计，如图28所示，未进行光照治疗和只进行光照的生理盐水组、Ppa组小鼠肿瘤体积没有显著差异(ns)，均远远大于进行光照治疗的CM-BSPO、BSPO和BSP组，且在观察期间肿瘤大小随时间增加而增大。未进行光照的各组，其中CM-BSPO、BSPO和BSP组虽然在肿瘤部位有大量的Ppa聚集，但是没有光照不能产生ROS杀伤肿瘤细胞，所以没有明显的抗肿瘤效果。进行光照治疗各组中，生理盐水组没有Ppa作为光敏剂同样无法产生ROS杀伤肿瘤细胞，没有明显的抗肿瘤效果。游离Ppa在肿瘤部位的滞留时间仅有几小时，给药后24小时进行光照，余留在肿瘤部位的游离Ppa量不足以产生大量的ROS杀死肿瘤细胞。聚合物Ppa相比于游离Ppa在肿瘤体内的聚集时间相对更长，提供的治疗窗口期更长，明显提升了肿瘤的治疗效果。

实验结果显示，BSP+L、BSPO+L和CM-BSPO+L组Ppa在肿瘤部位高度聚集，加上光照可以产生大量的ROS，从而杀伤肿瘤细胞。体积监测发现小鼠肿瘤体积明显更小，治疗期间肿瘤的体积增加并不明显。包载奥拉帕尼的BSPO+L组，奥拉帕尼可以增强肿瘤细胞的DNA损伤，从而增加杀伤肿瘤细胞的作用，因此肿瘤体积相比于BSP组有明显减小，具有统计学差异(p<0.01，n＝5)。表面包裹细胞膜的CM-BSPO+L由于肿瘤部位的聚集度增加，细胞摄取量增多，因而也明显提高了治疗效果，在整个治疗期间肿瘤体积没有明显增加，同时与BSPO+L组相比，治疗后肿瘤体积有明显的统计学差异。

(2)抑瘤率

将其他组与生理盐水未加光照组比较，可以计算出肿瘤治疗的抑瘤率，如图29所示，抑瘤率高低依次为：CM-BSPO+L 87.66％，BSPO+L 81.34％，BSP+L 69.55％，Ppa+L36.99％，Saline+L 26.18％，其余各未光照组的抑瘤率仅为12％左右。由此可以看出CM-BSPO加光照的治疗效果最明显。

(3)磁共振成像

治疗过程中通过磁共振成像手段每隔一周进行肿瘤扫描，即治疗的第1天、第7天、第14天和第19天进行磁共振扫描，结果如图30和图31。磁共振图像反映出同样的治疗效果。BSP+L、BSPO+L和CM-BSPO+L组肿瘤体积显著减小。在治疗的第19天，对各治疗组小鼠进行了肺部CT扫描，观察小鼠肺部转移情况，同时将肺组织取出进行组织拍摄和HE染色。

图30和图31中CT扫描结果显示CM-BSPO+L和BSPO+L组小鼠没有观察到肺部有明确的转移灶，标本组织肉眼观察同样没有观察到异常组织。而其他各组中，CT肺部图像均可以观察到一个或多个高密度孤立结节，大体标本观察可以看到结节状突起；并且HE染色(图32)可以观察到深染变大的细胞核，细胞形态与周围正常肺组织有异质性。

(4)免疫组化染色

肿瘤组织切片进行CD31免疫组化染色，观察肿瘤部位血管分布，如图33所示，肿瘤治疗效果明显的CM-BSPO+L、BSPO+L和BSP+L肿瘤内CD31表达量较其他组更低，说明肿瘤治疗效果更好，肿瘤内新生血管较少。

同时也进行Ki-67免疫组化染色，观察肿瘤内细胞增殖情况，如图34所示。半定量统计分析结果如图35所示，CM-BSPO+L、BSPO+L和BSP+L三组之间肿瘤内Ki-67表达量没有显著差异，且均低于Ppa+L和Saline+L组，具有统计学差异。说明CM-BSPO+L、BSPO+L和BSP+L三组肿瘤细胞内增殖受到抑制，其治疗效果要优于其他各对照组。

上述试验结果表明：本发明制备的糖基聚合物，特别是细胞膜-糖基聚合物具有良好的光动力效应，可作为光敏剂用于光动力治疗，且对肿瘤的杀伤效果优良。同时，该糖基聚合物作为药物载体效果好，载药量高，且载药后治疗效果进一步增强。

综上，本发明提供了一种细胞膜-糖基聚合物，该细胞膜-糖基聚合物克服了现有PDT光敏剂肿瘤部位聚集不够，对肿瘤杀伤作用不强的缺点，可以在肿瘤部位聚集，具有良好的靶向作用；其具有光动力效应，作为光敏剂用于光动力治疗ROS产生效率高，对肿瘤细胞杀伤作用强。同时，该细胞膜-糖基聚合物还可以作为给药系统包载药物，特别是肿瘤药物，如奥拉帕尼，用于肿瘤治疗，效果优异。本发明细胞膜-糖基聚合物用于制备治疗肿瘤的药物具有优良的应用前景。