阅读说明：本技术 一种羟基红花黄色素a复合物及其制备工艺、应用 (Hydroxy safflower yellow A compound and preparation process and application thereof ) 是由 李范珠 朴寄纲 朱志红 邹佳峰 陈晓劼 朱晶晶 张钶 秦泽敏 于 2020-05-27 设计创作，主要内容包括：本发明属于口服药物技术领域,具体涉及一种羟基红花黄色素A复合物及其制备工艺、应用。羟基红花黄色素A复合物的制备工艺,包括以下步骤：(1)将SNAC、EPO均匀分散于溶剂中,得到混合液；(2)将HSYA滴加至混合液中,然后调节溶液pH至5-8,接着在30-60℃温度环境下反应预定时长；(3)反应结束后进行溶剂蒸发,得到羟基红花黄色素A复合物。本发明基于SNAC和EPO的协同促吸收优势,在体外制备了安全高效的新型口服复合物SNAC-EPO-HSYA,克服了SNAC体内复合时间短等缺陷,显著改善了HSYA的口服生物利用度。(The invention belongs to the technical field of oral medicines, and particularly relates to a hydroxysafflor yellow A compound, and a preparation process and application thereof. The preparation process of the hydroxysafflor yellow A compound comprises the following steps: (1) dispersing SNAC and EPO uniformly in a solvent to obtain a mixed solution; (2) dropwise adding HSYA into the mixed solution, then adjusting the pH value of the solution to 5-8, and then reacting for a predetermined time at the temperature of 30-60 ℃; (3) after the reaction, the solvent was evaporated to obtain a hydroxysafflor yellow A complex. Based on the synergistic absorption promotion advantages of the SNAC and the EPO, the invention prepares a safe and efficient novel oral compound SNAC-EPO-HSYA in vitro, overcomes the defects of short in-vivo compounding time of the SNAC and the like, and obviously improves the oral bioavailability of the HSYA.)

一种羟基红花黄色素A复合物及其制备工艺、应用

技术领域

本发明属于口服药物技术领域，具体涉及一种羟基红花黄色素A复合物及其制备工艺、应用。

背景技术

心肌缺血(Myocardial ischemia，MI)是一种多因素的病理生理状况，涉及冠状血管和心肌之间的复杂且特异的相互作用，在患有冠状动脉粥样硬化性心脏病的患者中常常发生。同时，MI也是心绞痛和心肌梗塞等心血管疾病的主要诱因之一，极易引发心脏性猝死。临床上一般采用心脏搭桥等手术途径来使狭窄的血管恢复通畅，但其成本昂贵、手术风险大。因此，在患者病情较轻时，临床上一般通过***、单硝酸异山梨酯等药物来进行治疗。然而，***极易耐受，不适合长期治疗；单硝酸异山梨酯存在胃肠道不良反应。近年来，红花(Carthamus tinctorius L.)、三七等活血化瘀中药在抗MI中取得诸多进展，展现出巨大的临床治疗潜力。

红花(Carthamus tinctorius L.)是菊科、红花属植物，具有活血化瘀、散湿去肿等功效。其主要药用活性成分为羟基红花黄色素A(Hydroxysafflor yellow A，C₂₇H₃₂O₁₆，HSYA)，具有扩张冠状动脉、抗MI以及脑缺血等药理作用，其机制可能与其抗氧化、抗炎及抑制血小板聚集等药理作用有关。临床上HSYA的给药方式以静脉注射为主，例如已经上市的

注射用红花黄色素，主要用于冠心病、心绞痛等慢性心血管疾病的治疗。但是注射给药临床应用时存在过敏等副作用，且患者顺应性差。因此，开发一种具有较好的安全性和患者顺应性的口服HSYA制剂对拓宽HSYA临床应用前景具有重要意义。

HSYA属于BCSⅢ类药物，具有高溶解性、低渗透性的特点，口服生物利用度仅为1.2％，且主要吸收方式为被动转运。目前改善BCSⅢ类药物的口服吸收常用的策略有：

(1)制成微粒递药系统，通过增加肠道滞留时间等途径，提高药物的生物利用度；

(2)制成前体药物或复合物，提高药物疏水性；

(3)加入吸收促进剂，即选择有效的吸收促进剂，促进药物的吸收。

已有学者将HSYA制备成固体脂质纳米粒，来改善其口服吸收利用度，但制备工艺繁琐，成本较高，较难量化生产；HSYA酯化前药仍存在合成困难、纯化及脱乙酰化等问题；HSYA磷脂复合物主要通过打开肠道紧密连接提升口服生物利用度，但其作用有限，且存在一定的用药隐患；虽已有多种用于改善HSYA口服生物利用度的渗透促进剂，如辛酸钠等被用于增加HSYA的口服生物利用度，操作简单，但效果仍有待加强，需通过合理的辅料选择和设计来进一步改善HSYA的吸收。综上，HSYA的口服促吸收策略仍需不断完善。

N-[8-(2-羟基苯甲酰基)氨基]辛酸钠(Sodium N-[8-(2-hydroxybenzoyl)amino]caprylate，SNAC)作为低毒性口服渗透促进剂，可显著增强亲水性大分子或小分子药物的渗透性，已获FDA批准用于降钙素、维生素B₁₂等临床研究。已有研究表明其促吸收机制可能与膜流动性和运输途径的改变有关。亦有相关学者认为SNAC可在胃肠道中形成复合物来改善药物的生物利用度，并推测其主要通过弱相互作用力，如氢键、静电作用力等进行络合。但SNAC在肠道吸收快、稳定性差，难以在较长时间内维持SNAC的作用，因此，也很难在体内形成大量稳定的复合物。

EPO(EPO)是一种常用的阳离子共聚物，发明组在前期研究中发现其可延长HSYA的滞留时间，且相较于单独使用SNAC，联合使用SNAC和EPO的物理混合物(Physical mixture)能更显著改善HSYA的口服生物利用度，但其重复性和质量可控性极差。而通过共价或非共价相互作用力形成的药物复合物(Drug composite，DC)，能够有效的整合药物和辅料的作用，且EPO与药物形成的复合物可改善BSCⅢ类药物的体外渗透能力以及吸收情况，其结构中的二甲胺基(R₁R₂C＝N-N＝CR₁R₂)在改善复合物稳定性的方面也具有重要意义。

基于此，若能在体外形成大量、可控、负载HSYA、SNAC、EPO的复合物(SNAC-EPO-HSYA)，可有效联合SNAC和EPO的优势进一步改善HSYA的口服生物利用度。

发明内容

基于现有技术中存在的上述不足，本发明提供一种羟基红花黄色素A复合物及其制备工艺、应用。

为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种羟基红花黄色素A复合物的制备工艺，包括以下步骤：

(1)将SNAC、EPO均匀分散于溶剂中，得到混合液；

(2)将HSYA滴加至混合液中，然后调节溶液pH至5-8，接着在30-60℃温度环境下反应预定时长；

(3)反应结束后进行溶剂蒸发，得到羟基红花黄色素A复合物。

作为优选方案，所述步骤(3)中，将溶剂蒸发后得到的产物复溶于二氯甲烷，并用水萃取以除去未反应的HSYA，挥发除去二氯甲烷后，减压干燥，即得羟基红花黄色素A复合物。

作为优选方案，所述溶剂为甲醇或乙醇或乙酸乙酯。

作为优选方案，所述溶剂的比例不低于70％。

作为优选方案，所述EPO与SNAC的浓度之比为1：(1-4)。

作为优选方案，所述HSYA的浓度为0.5-6.0mg/mL。

作为优选方案，所述预定时长为4-24h。

作为优选方案，所述溶剂为甲醇，所述溶剂比例为70％，所述pH为6.0，所述EPO与SNAC的浓度之比为1：1，所述HSYA的浓度为2.0mg/mL，所述温度环境的温度为50℃，所述预定时长为12h。

本发明还提供一种羟基红花黄色素A复合物，如上任一项方案所述的制备工艺制得。

本发明还提供上述方案所述的羟基红花黄色素A复合物的应用，用于制备抗心肌缺血的药物。

本发明与现有技术相比，有益效果是：

(1)本发明根据“溶剂蒸发法”制备的羟基红花黄色素A复合物SNAC-EPO-HSYA形态完整，整体呈无定形态，颗粒均匀，相较于HSYA，其lgP_ow显著增加。SNAC-EPO-HSYA对HSYA具有较高的复合率，说明SNAC-EPO-HSYA在负载HSYA方面具有一定优势，为SNAC-EPO-HSYA体内外的评价奠定了一定的理论基础。

(2)本发明基于SNAC和EPO的协同促吸收优势，在体外制备了安全高效的新型口服复合物SNAC-EPO-HSYA，克服了SNAC体内复合时间短等缺陷，显著改善了HSYA的口服生物利用度。相较于HSYA，SNAC具有显著的离体促渗透作用。同时，相较于HSYA，SNAC-EPO-HSYA显著增加了Caco-2细胞对HSYA的摄取和转运量以及Caco-2细胞的膜流动性，从体外角度验证了SNAC-EPO-HSYA的促吸收作用。

(3)药动学实验方面，SNAC-EPO-HSYA的口服生物利用度的显著增强，从体内角度验证了SNAC-EPO-HSYA的促吸收作用。

(4)本发明所制备的新型复合物体系可以作为理想的HSYA的口服递送体系，丰富了SNAC-EPO-HSYA在改善HSYA口服生物利用度方面的研究与应用，也可为拓宽BCSⅢ类药在口服方面的应用奠定一定基础。

附图说明

图1是本发明实施例的HSYA体外标准曲线；

图2是本发明实施例的HSYA体内低(A)、高浓度(B)标准曲线；

图3是本发明实施例的HSYA，SNAC，EPO，Physical mixture和SNAC-EPO-HSYA的DSC图；

图4是本发明实施例的HSYA(A)、SNAC(B)、EPO(C)、Physical mixture(D)和SNAC-EPO-HSYA(E)的SEM图；SNAC-EPO-HSYA表面放大后的SEM图(F)；

图5是本发明实施例的SD大鼠静脉注射HSYA(A)与灌胃HSYA和SNAC-EPO-HSYA后的平均血药浓度-时间曲线(B)。

具体实施方式

以下将通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步解释说明。

本发明实施例在制备羟基红花黄色素A复合物的体系研究包括如下四个部分：

第一部分HSYA分析方法的建立及辅料促吸收研究

本部分在通过高效液相法(High performance liquid chromatography，HPLC)建立了HSYA体内和体外分析方法。

一、材料与方法

(一)实验材料

1.药品与试剂

HSYA(≥85.0％，中国，浙江永宁药业股份有限公司)；HSYA对照品(≥98.0％，中国，上海麦克林生化科技有限公司)；EPO(中国，上海艾伟特医药科技有限公司)；SNAC(≥98.0％，德国，Sigma有限公司)；羧甲基纤维素钠(0.5％，CMC-Na，德国，Sigma有限公司)；磷酸(中国，西陇化工有限公司)；甲醇(美国，天地有限公司，色谱级)；其他试剂均为分析纯。

2.动物

动物种属及来源：Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，清洁级，体重(250.0±20.0)g，购自浙江中医药大学动物实验中心。所有动物实验均按照浙江中医药大学动物饲养和使用指南进行。

(二)实验方法

1.体外分析方法的建立

1.1色谱条件

色谱柱：CNW Athena C-18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：甲醇：0.7％磷酸＝21:79，pH＝6.0(三乙胺调节)；流速：1mL/min；柱温：30.0℃；进样体积：10.0μL；检测波长：403nm。

1.2对照品溶液的配制

称取适量HSYA对照品用25.0％甲醇溶解，用10mL棕色容量瓶定容，配制成质量浓度为200.0μg/mL的对照品储备液，避光保存。

1.3供试品溶液的配制

取适量干燥的SNAC、EPO和HSYA的物理混合物(Physical mixture)样品加入25.0％甲醇溶液，超声10.0min，涡旋3.0min以充分溶解，过0.45μm微孔滤膜，收集续滤液即得。

1.4定量限与检测限

取一定浓度的HSYA对照品溶液，逐级稀释后，通过HPLC测定当前浓度下峰面积及信噪比(S/N)，直到信噪比分别为10和3时，记录此时溶液浓度，得到该仪器对HSYA的定量限和检测限。

1.5标准曲线的建立

取HSYA对照品贮备液适量，用25.0％甲醇定容至200.0、100.0、50.0、20.0、10.0、5.0和2.0μg/mL，根据“1.1”项下色谱条件测定其峰面积，并以HSYA色谱峰面积(Y)对HSYA浓度(X)进行线性回归。

1.6精密度实验

取高、中、低3个浓度的HSYA对照品按“1.1”项下色谱条件于1日内连续进样3次，测定其峰面积，根据标准曲线计算各样品中HSYA浓度，并计算其日内精密度；连续进样3日，同法测定并计算日间精密度和相对标准偏差(Relative standard deviation，RSD)。

1.7专属性实验

分别取HSYA(HSYA浓度为50.0μg/mL)和SNAC、EPO两者物理混合物(SNAC/EPO)的样品适量，按“1.3”项所述条件进行处理后，根据“1.1”项下色谱条件下进行检测。

1.8稳定性实验

取质量浓度为50.0μg/mL的对照品溶液，分别于第0、2、4、8、12、24h按“1.1”项下色谱条件下进行检测，平行测定3次，计算RSD。

1.9回收率实验

取干燥的Physical mixture适量，按“1.3”项所述条件进行处理后稀释，得到不同浓度的供试品溶液(HSYA浓度分别为24.0μg/mL、20.0μg/mL、16.0μg/mL)。量取1mL的供试品溶液各三组，每组分别根据“1.1”项下色谱条件测定其峰面积，平行测定3次，计算相应的回收率和RSD。

2.体内分析方法的建立

2.1色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：乙腈：0.1％磷酸＝14:86；流速：1.0mL/min；柱温：30.0℃；进样体积：50.0μL；检测波长：403nm。

2.2 HSYA标准溶液及内标液的配制

HSYA对照品溶液：称取HSYA对照品适量用25.0％甲醇配制成质量浓度为200.0μg/mL的对照品贮备液，于棕色容量瓶中避光保存。

维生素B₂内标溶液：称取维生素B₂对照品2.0mg，用适量10.0％冰醋酸溶解，再以50.0％甲醇定容至100.0mL，得到浓度为20.0μg/mL的内标溶液，避光贮存。

2.3血浆样品处理方法

取血浆样品100.0μL，加入内标溶液40.0μL后涡旋10.0s混匀，继续加入10.0％高氯酸60.0μL，涡旋3.0min后于12000rpm下离心10.0min；将上清液移至1.0mL离心管中，氮吹后加入25.0％甲醇100.0μL复溶，过0.45μm微孔滤膜后，按“2.1”项下色谱条件进行检测。

2.4定量限与检测限

取一定浓度的HSYA血浆标样(按“2.3”项下方法处理)，逐级稀释后，按“2.1”项下色谱条件，测定当前浓度下峰面积及信噪比(S/N)，直到信噪比分别为10和3时，记录此时溶液浓度，得到该仪器对HSYA的定量限和检测限。

2.5标准曲线的建立

取HSYA对照品贮备液适量，均分为两份，一份使用25.0％甲醇逐级稀释至5.0、2.0、1.0、0.5和0.1μg/mL；另一份使用25.0％甲醇逐级稀释至100.0、50.0、10.0、5.0、和2.0μg/mL。吸取上述不同浓度的HSYA标准溶液50.0μL与100.0μL空白血浆样品混匀，并按“2.3”项下方法处理样品后，分别通过HSYA与内标峰面积比值(Y)对HSYA浓度(X)进行线性回归，即得标准曲线。

2.6精密度实验

配制高、中、低三个浓度的HSYA对照品溶液，与大鼠空白血浆混匀后，按“2.3”项下方法对样品进行处理。之后，将样品按“2.1”项下色谱条件于单日内连续进样3次，计算其日内精密度；连续进样3日，同法测定并计算日间精密度和RSD。

2.7专属性实验

分别取HSYA血浆标样和SNAC/EPO血浆标样，按“2.3”项下方法处理，并按“2.1”项下色谱条件进行检测，绘制专属性图谱。

2.8稳定性实验

取质量浓度为1.0μg/mL的HSYA血浆标样，按“2.3”项下方法处理，分别于第0、2、4、8、12、24h按“2.1”项下色谱条件下进行检测，平行测定3次，计算RSD。

2.9回收率实验

配制高、中、低三个浓度的HSYA对照品溶液，与大鼠空白血浆混匀后，获得不同浓度HSYA血浆标样，并按“2.3”下方法处理样品后进样，测得HSYA与内标物峰面积的比值，计算回收率和RSD。

二、结果

1.体外分析方法的建立

1.1标准曲线的建立

以HSYA色谱峰面积(Y)对HSYA浓度(X)进行线性回归。可得线性回归方程：Y＝13.55X+4.5487，相关系数R²＝0.9993，表明当HSYA浓度在2.0-200.0μg/mL范围内线性关系良好，标准曲线见图1所示。

1.2精密度实验

日内精密度和日间精密度均符合方法学要求。

1.3稳定性实验

平行测定3次，计算得到RSD为1.27％，符合方法学要求。

1.4专属性、定量限和检测限实验

实验表明，SNAC与EPO对HSYA的出峰没有显著影响，该色谱条件下，HSYA的专属性良好。测得定量限为0.15μg/mL(信噪比S/N＝10)，检测限为0.10μg/mL(信噪比S/N＝3)。

1.5回收率实验

平行测定3次，计算得到回收率均符合要求，RSD为1.02％、0.91％、0.72％，均符合方法学要求。

2.体内分析方法的建立

2.1标准曲线的建立

进行线性回归后得线性回归方程：Y＝0.9675X+0.0401(R²＝0.9992)，表明当HSYA浓度在0.05-2.5μg/mL范围内线性关系良好，标准曲线见图2(A)；Y＝0.944X-0.1723(R²＝0.9993)，表明当HSYA浓度在1.0-50.0μg/mL范围内线性关系良好，标准曲线见图2(B)。

2.2精密度实验

日内精密度和日间精密度均符合方法学要求。

2.3稳定性实验

平行测定3次，计算得到RSD为1.18％，符合方法学要求。

2.4专属性、定量限和检测限

实验表明，HSYA样品峰型良好，与内标峰的分离度良好，SNAC和EPO对HSYA的出峰没有显著干扰，专属性良好。测得定量限为0.05μg/mL(信噪比S/N＝10)，检测限为0.03μg/mL(信噪比S/N＝3)。

2.5回收率

平行测定3次，计算得到回收率均符合要求，RSD为1.67％、0.90％、0.72％，均符合方法学要求。

三、分析与讨论

1.体外分析方法的建立

建立科学、可靠、方便的体内外定量分析方法是药物研究工作的前提。高效液相色谱法以其灵敏度高、简单易行、准确可靠、动态线性范围宽等优势被广泛应用于HSYA的测定。本部分利用高效液相色谱法测定HSYA含量，建立了HSYA的体外分析方法学。利用高效液相色谱法测定HSYA含量时，分析波长的选择至关重要，当检测波长为403nm时，实验表明EPO、SNAC等辅料对其干扰少、专属性强、分析强度高、稳定性好，可满足分析要求。

2.体内分析方法的建立

本部分建立了HSYA血浆样品的前处理方法和HPLC检测方法，选择了维生素B₂作为内标，并对方法学进行了验证。实验表明EPO、SNAC等辅料对其干扰少、专属性强，在考察浓度范围内线性良好、精密度、回收率稳定，证明该前处理方法及检测方法符合生物样品检测要求。

综上，第一部分实验建立了HSYA体内、外分析方法。

第二部分羟基红花黄色素A复合物SNAC-EPO-HSYA的制备及性质研究

药物复合物(Drug composite，DC)是药物递送的重要载体，且呈现出与原药具有显著差异的理化性质和生物学性质，已被广泛用于口服药物的研究。本部分拟通过SNAC、EPO和HSYA制备SNAC-EPO-HSYA，并对复合物的制备工艺、理化性质和离体促吸收能力进行考察，为SNAC-EPO-HSYA的制备和评价提供了一定的理论基础。

一、材料与方法

(一)实验材料

1.药品与试剂

HSYA(≥85.0％，中国，浙江永宁药业股份有限公司)；HSYA对照品(≥98.0％，中国，上海麦克林生化科技有限公司)；EPO(中国，上海艾伟特医药科技有限公司)；SNAC(德国，Sigma有限公司)；氯化钠、碳酸氢钠和氯化镁均购自西陇化工有限公司；氯化钾(中国，上海源叶生物科技有限公司)；三乙胺(中国，西陇化工有限公司)；磷酸(中国，西陇化工有限公司)；甲醇(美国，天地有限公司，色谱级)；四氢呋喃和丙酮均购自于杭州双林化工试剂有限公司；无水甲醇、无水乙醇和乙酸乙酯等分析纯试剂均购自于天津科密欧化学试剂有限公司。

2.动物

动物种属及来源：雄性SD大鼠，清洁级，体重(250.0±20.0)g，购自浙江中医药大学动物实验中心。所有动物实验均按照浙江中医药大学动物饲养和使用指南进行。

(二)实验方法

1.SNAC-EPO-HSYA的制备

1制备方法及复合率的测定

1.1 SNAC-EPO-HSYA的制备

本发明采用“溶剂蒸发法”来制备SNAC-EPO-HSYA：分别称取处方量的EPO和SNAC于圆底烧瓶中，加入适量的溶剂搅拌使其均匀分散，随后将一定量的HSYA溶液滴加至烧瓶中，调节pH。反应结束后旋蒸，除去溶剂即得覆于烧瓶底部的复合物。加入适量二氯甲烷复溶，用蒸馏水萃取以除去未反应的HSYA，挥发除去二氯甲烷后，减压干燥过夜即得干燥的复合物，研细过筛后，即得SNAC-EPO-HSYA。

1.2 SNAC-EPO-HSYA复合率的测定

本部分采用“直接法“计算复合率(Compound rate，CR)，即直接测定SNAC-EPO-HSYA中的药物含量，其计算公式如下：

CR％＝W_s/W₀×100％

式中CR％表示SNAC-EPO-HSYA中HSYA的复合率，W_s表示SNAC-EPO-HSYA中HSYA的含量，W₀表示羟基红花黄色素A的投入量。

1.3 SNAC-EPO-HSYA制备条件的考察

分别考察反应溶剂、溶剂比例、反应pH、EPO和SNAC浓度比例、HSYA投料量、反应温度以及反应时间等因素对SNAC-EPO-HSYA复合率的影响。

1.3.1反应溶剂对SNAC-EPO-HSYA的影响

固定EPO和SNAC浓度比例为1：1，HSYA浓度为2.0mg/mL，反应温度为40.0℃，反应时间为12h，考察SNAC-EPO-HSYA的反应溶剂为纯水、四氢呋喃、乙酸乙酯、无水甲醇、无水乙醇时的复合率，每组平行操作3次。

1.3.2溶剂比例对SNAC-EPO-HSYA的影响

固定EPO和SNAC浓度比例为1：1，HSYA浓度为2.0mg/mL，反应温度为40.0℃，反应时间为12h，反应溶剂为甲醇，考察SNAC-EPO-HSYA的反应溶剂比例为90.0、80.0、70.0、60.0、50.0％时的复合率，每组平行操作3次。

1.3.3反应pH对SNAC-EPO-HSYA的影响

固定EPO和SNAC浓度比例为1：1，HSYA浓度为2.0mg/mL，反应温度为40.0℃，反应时间为12h，反应溶剂为70.0％甲醇，通过氢氧化钠和盐酸调节pH，考察SNAC-EPO-HSYA的反应pH为8.0、7.0、6.0、5.0、1.2时的复合率，每组平行操作3次。

1.3.4 EPO与SNAC的浓度比对SNAC-EPO-HSYA的影响

固定HSYA浓度为2.0mg/mL，反应温度为40.0℃，反应时间为12h，反应溶剂为70.0％甲醇(pH＝6.0)，考察SNAC-EPO-HSYA反应的EPO与SNAC浓度比为1：1、1：2、1：3、1：4时的复合率，每组平行操作3次。

1.3.5 HSYA浓度对SNAC-EPO-HSYA的影响

固定EPO和SNAC浓度比例为1：1，反应温度为40.0℃，反应时间为12h，反应溶剂为70.0％甲醇(pH＝6.0)，考察不同HSYA浓度时(0.5、1.0、2.0、4.0和6.0mg/mL)，SNAC-EPO-HSYA的复合率，每组平行操作3次。

1.3.6反应温度对SNAC-EPO-HSYA的影响

固定EPO和SNAC浓度比例为1：1，HSYA浓度为2.0mg/mL，反应时间为12h，反应溶剂为70.0％甲醇(pH＝6.0)，考察SNAC-EPO-HSYA的反应温度分别为30.0、40.0、50.0和60.0℃时的复合率，每组平行操作3次。

1.3.7反应时间对SNAC-EPO-HSYA的影响

固定EPO和SNAC浓度比例为1：1，HSYA浓度为2.0mg/mL，反应温度为50.0℃，反应溶剂为70.0％甲醇(pH＝6.0)，考察SNAC-EPO-HSYA的反应时间分别为4、5、6、12和24h时的复合率，每组平行操作3次。

1.3.8验证实验

依据最佳工艺条件平行操作3次，记录SNAC-EPO-HSYA的复合率，计算RSD。

2.SNAC-EPO-HSYA的性质考察

2.1 SNAC-EPO-HSYA的理化性质考察

2.1.2差示扫描量热

采用STA 449F3同步热分析仪分别对HSYA、EPO、SNAC、Physical mixture和SNAC-EPO-HSYA进行分析。检测条件如下：

升温速率：10℃/min，范围：50-400℃。

2.1.3扫描电子显微镜

使用双面铝带将样品固定在黄铜短管上，然后在真空下镀金，以提高其导电性。之后，通过扫描电子显微镜分析HSYA、EPO、SNAC、Physical mixture和SNAC-EPO-HSYA的微观形状和形态。

2.1.4表观油水分配系数

分别测定HSYA、SNAC-EPO-HSYA的油水分配系数(Apparent oil-water partitioncoefficient，lgP_ow)，以此作为依据，判断EPO、HSYA、SNAC是否发生络合。

将正辛醇与PBS(pH＝6.8)经互相饱和处理后，称取HSYA原料药(HSYA浓度：5mg/mL)和复合物适量(HSYA浓度：5mg/mL)，溶于缓冲液溶液。将各组溶液置于蓝盖瓶中，在25℃条件下，恒温避光振摇24h。静置后，按照第一部分“1.3”下HPLC条件，分别检测油、水相中HSYA的浓度C_o和C_w。同时，根据lgP_ow＝lgC_o/C_w计算表观油水分配系数。

2.2 SNAC-EPO-HSYA在不同介质中稳定性考察

PBS(pH＝6.8、4.5)、盐酸溶液(pH＝1.2)、人工胃液和人工肠液的配制分别按照2015版《中国药典》第四部通则8004中PBS(pH＝6.8、4.5)、盐酸溶液(pH＝1.2)、人工胃液和人工肠液的制法配制。

分别量取PBS(pH＝6.8)、人工胃液、人工肠液的介质各200mL置于具塞样品瓶中，量取适量SNAC-EPO-HSYA混悬液置于预先处理过的透析袋内，排除气泡后密封，在(37.0±0.5)℃的恒温水浴摇床内，以50rpm/min震荡，分别在5、15、30、60、120、240、480、720、1440min取样1mL。将样品于9000rpm高速离心8min，取上清液，按“第一部分、一、(二)、1.3”项方法处理样品，并通过HPLC法测定并计算其中HSYA含量和累计释放度。

3.SNAC-EPO-HSYA离体肠吸收考察

3.1台氏液的配制

称取氯化钠8.0g，碳酸氢钠1.0g，氯化钾0.3g，氯化镁0.1g于500.0mL水中溶解，密封4.0℃冷藏。

3.2离体肠灌流实验

取SD大鼠禁食12h后处死，打开腹腔，取十二指肠(约10.0cm)、空肠(约10.0cm)和回肠(约10.0cm)之后通过台氏液，清除其内部内容物。翻转各肠段使其黏膜层向外，用台氏液漂洗后，结扎肠段一端，结扎另一端于特制的乳胶管后形成肠囊，记录肠段吸收面积(A，cm²)。取适量台氏液于肠囊中，并将肠囊置于含HSYA和SNCA-EPO-HSYA的溶液试管中，记为初始浓度(C₀，ng/min)。试管于37.0℃恒温水浴震荡器中，以100rpm/min震荡，期间需向试管中持续通入混合气体(O₂：CO₂＝95：5)保持肠膜活性。分别在0、30、60、90和120min从肠囊内取含药台氏液200.0μL，同时补加同温的空白台氏液200.0μL，按第一部分“1.3”项处理样品，并按“1.1”项下色谱条件进样，通过药物含量计算药物渗透率(d_Q/d_t，ng/min)，根据公式2-2计算离体表观渗透系数(In vitro apparent permeability coefficient，In vitroP_app)。

In vitro P_app＝(d_Q/d_t)/(A×C₀)

二、结果

1.SNAC-EPO-HSYA的制备

1.1 SNAC-EPO-HSYA的制备

本发明制备的SNAC-EPO-HSYA为淡黄色粉末。

1.2 SNAC-EPO-HSYA制备处方的单因素考察

1.2.1反应溶剂

由表1可知，当反应溶剂不同时，反应所得到SNAC-EPO-HSYA的复合率也不同；其中，当反应溶剂为无水甲醇时，复合率可达(17.5±3.4)％；当反应溶剂为四氢呋喃时，反应无法进行；当反应溶剂为乙酸乙酯时，复合率仅为(3.3±1.2)％。本部分选用复合率较高的无水甲醇为反应溶剂进行实验。

表1不同反应溶剂下的复合率

Solvent	Combination Ratio/％
		Tetrahydrofuran	/
Ethyl acetate	3.3±1.2
		Methanol	17.5±3.4
Ethanol	12.9±2.3

1.2.2溶剂比例对SNAC-EPO-HSYA的影响

由表2可知，当甲醇比例不同时，反应所得到复合物的复合率也不同，当比例为70.0％时，其复合率为(43.5±5.2)％，远高于其他各组，故本部分选择70.0％的溶剂比例进一步考察。

表2不同反应溶剂比例下的复合率

Solvent Ration/％	Combination Ratio/％
		90.0	22.1±2.0
80.0	33.0±3.1
		70.0	43.5±5.2
60.0	/
		50.0	/

1.2.3反应pH对SNAC-EPO-HSYA的影响

由表3可知，复合物的复合率随着pH降低，逐渐增大，当pH 6.0时，复合率为(62.4±0.1)％。在pH低于5.0时，会产生大量絮状漂浮物。因此，本部分选择pH 6.0进一步实验。

表3不同反应pH下的复合率

pH	Combination Ratio/％
		8.0	36.8±0.8
7.0	45.1±3.1
		6.0	62.4±0.1
5.0	/
		1.2	/

1.2.4 EPO和SNAC的浓度比对SNAC-EPO-HSYA的影响

由表4可知，当SNAC占比逐步增大时，复合物的复合率逐步降低，当两者比值为1：1时，其复合率最高，为(70.3±1.2)％。故本部分选择1：1浓度比进一步研究。

表4不同EPO和SNAC的浓度比下的复合率

EPO-SNAC concentration ratio	Combination Ratio/％
		1：1	70.3±1.2
1：2	61.1±2.7
		1：3	49.0±1.9
1：4	37.8±5.2

1.2.5 HSYA浓度对SNAC-EPO-HSYA的影响

由表5可知，当HSYA浓度在0.5-2.0mg/mL范围内时，随着HSYA浓度逐渐增加，其复合率逐渐增加，但当浓度大于4.0mg/mL时，其复合物的复合率无显著性变化，甚至有大量HSYA未反应导致复合率下降。综合考虑成本因素，本部分选择2.0mg/mL作为HSYA浓度进一步研究。

表5不同HSYA浓度下的复合率

HSYA concentration(mg/mL)	Combination Ratio/％
		0.5	44.5±1.7
1.0	52.1±2.5
		2.0	67.5±3.4
4.0	64.6±1.8
		6.0	66.2±0.2

1.2.6反应温度对SNAC-EPO-HSYA的影响

由表6可知，复合物的复合率随着温度的增加而增加，当温度为50℃时，其复合率为(78.4±1.5)％，但当温度为60.0℃时，其复合率开始减少。因此选择50.0℃进一步研究。

表6不同温度下的复合率

Temperature(℃)	Combination Ratio/％
		30.0	63.4±0.3
40.0	73.7±2.4
		50.0	78.4±1.5
60.0	75.2±0.6

1.2.7反应时间对SNAC-EPO-HSYA的影响

由表7中可知，复合物的复合率随着反应时间的延长而增加，当反应时间为12h时，其复合率为(80.6±1.5)％，之后，随着时间增长复合率无显著变化，从经济成本角度考虑，选择了反应时间为12h进一步研究。

表7不同反应时间下的复合率

1.2.8验证实验

根据单因素考察，本部分初步确定SNAC-EPO-HSYA的最终工艺条件为：取EPO和SNAC按1：1分散于甲醇溶液(70.0％)中，并在50.0℃恒温水浴搅拌使其均匀分散，随后于搅拌下缓慢加入HSYA甲醇溶液(70.0％)，使HSYA的浓度为2.0mg/mL。调节溶液pH至6.0，于50.0℃下持续搅拌反应12h。反应结束后旋蒸，除去溶剂即得覆于烧瓶底部的复合物。加入适量二氯甲烷复溶，用蒸馏水萃取以除去未反应的HSYA，挥发除去二氯甲烷后，减压干燥过夜即得干燥的复合物，研细过筛后，即得SNAC-EPO-HSYA。由表8可知，最优工艺条件下，其复合率为(80.4±0.8)％。

表8验证实验结果

Number	Combination Ratio/％
		1	79.3
2	80.6
		3	81.2
X±SD	80.4±0.8

2.SNAC-EPO-HSYA的性质考察

2.SNAC-EPO-HSYA的理化性质考察

2.1差示扫描量热

由图3中可知，HSYA在100.0℃和175.0℃处有一个吸热峰，在235.0℃有一个放热峰；SNAC在70.0℃和200.0℃处均有一个明显的吸热峰，在90.0℃左右有一个明显的放热峰；EPO在315.0℃处有一个明显的吸热峰，在60.0℃左右有一个明显的放热峰；Physicalmixture的基本峰型主要是HSYA、SNAC和EPO的叠加，但在一定程度上产生了偏移，其吸热峰分别偏移至62.0℃、212.5℃和280.0℃，其放热峰偏移至265.0℃。而复合物的峰型，相较于其他组具有明显的差异，曲线平滑，在考察温度内较稳定。

2.2扫描电镜图像

HSYA，SNAC，EPO，Physical mixture，SNAC-EPO-HSYA的SEM如图4(A)、4(B)、4(C)、4(D)、4(E)所示，HSYA为长而宽的晶体，EPO是不规则的条状聚合物，SNAC为短而细的类方形晶体。Physical mixture的SEM图中，长而宽的类方形晶体上附着大量条状聚合物和晶体的混合状态。而复合物则呈均匀的颗粒状，其颗粒表面放大后，能看到明显的药物络合现象。

2.3表观油水分配系数

由表9可知，HSYA极性较大，水溶性极强，在水饱和正辛醇溶液中浓度为(1.0±4.4)×10⁵μg/mL，表观油水分配系数lgP_ow为-(4.2±0.4)。形成SNAC-EPO-HSYA后，其在正辛醇饱和水溶液中的浓度由(18.9±2.2)μg/mL显著增加为(9.5±0.6)×10³μg/mL(P<0.01)。SNAC-EPO-HSYA的lgP_ow也显著增加至(0.2±0.02)(P<0.01)。

表9 HSYA和SNAC-EPO-HSYA在不同水溶液中的溶解度及各自油水分配系数

**P<0.01vs HSYA

2.4 SNAC-EPO-HSYA在不同介质中稳定性考察

已有研究表明载体的释放度可在一定程度上反映载体的稳定性，结果显示，SNAC-EPO-HSYA在盐酸溶液(pH＝1.2)和模拟胃液中快速释放，由此推测SNAC-EPO-HSYA在酸性溶液中稳定性较差。同时，根据实验结果推测SNAC-EPO-HSYA在不同溶液介质中的稳定性依次为：PBS(pH＝6.8)＞PBS(pH＝4.5)＞盐酸溶液(pH＝1.2)；PBS(pH＝6.8)＞人工肠液＞人工胃液。

3.SNAC-EPO-HSYA离体肠吸收考察

在十二指肠中，HSYA的表观渗透系数为(2.1±0.1)×10^-7，SNAC-EPO-HSYA的表观渗透系数为(6.1±1.3)×10^-7，相较于HSYA极显著增加(P<0.01)。在空肠和回肠中SNAC-EPO-HSYA的表观渗透系数分别为(9.3±0.5)×10^-7和(10.8±2.2)×10^-7，相较于HSYA的(4.0±0.6)×10^-7和(2.8±0.3)×10^-7极显著增加(P<0.01)。

三、分析与讨论

1.SNAC-EPO-HSYA的制备

1.1溶剂的选择

在复合物制备过程中，溶剂的选择取决于药物和辅料的溶解度。已有文献表明可使用非质子传递溶剂、质子传递溶剂或混合物溶剂来增加溶解性。但是，考虑到安全性问题，大多数溶剂(如***，二氯甲烷，二恶烷，氯仿和正己烷)已被甲醇或乙醇替代。本部分选用了溶剂蒸发法常用的溶剂(甲醇、乙醇、乙酸乙酯和四氢呋喃)进行实验。其中由于四氢呋喃对药物和辅料的溶解度均较低，难以形成复合物。而溶剂为乙酸乙酯时，出现剧烈的颜色变化，推测其主要是由于乙酸乙酯在搅拌加热过程中，与HSYA反应所导致的。因此，本发明选择了复合率最高的甲醇进一步研究。

1.2溶剂比例的选择

当溶剂比例低于70.0％时，大量辅料EPO难以溶于溶剂当中，且在反应过程中，沉淀析出逐渐增加，反应难以进行。而当溶剂比例高于70.0％时，其复合率随着溶剂比例降低而增加，推测是溶剂中存在去离子水的环境下，氢键作用更强，反应更易进行。

1.3反应pH、EPO-SNAC浓度比和温度的选择

当反应pH≤5.0时，产生大量红色絮状漂浮物，推测是由于EPO在强酸性环境下发生降解所导致的。当SNAC占比逐步增大时，推测这主要是由于EPO占比减少后，其稳定作用降低所致。当温度为60.0℃时，其复合率开始下降，这主要是由于HSYA在60.0℃下稳定性较差所致。

2.SNAC-EPO-HSYA的性质考察

2.1 SNAC-EPO-HSYA的理化性质考察

DSC曲线中显示HSYA药物在考察的温度内热稳定性较好。本发明采用SEM观察HSYA、SNAC、EPO、Physical mixture和复合物的三维形态。实验发现HSYA、SNAC及Physicalmixture均存在明显的结晶形，而EPO和复合物没有明显的结晶形态，且呈现大小均一，分散均匀的颗粒状。最后，本发明考察了HSYA和SNAC-EPO-HSYA的表观油水系数，SNAC-EPO-HSYA的脂溶性显著增大，推测是由于形成复合物后，辅料中的EPO和SNAC在一定程度上增加了脂溶性，这也说明了SNAC-EPO-HSYA的成功制备。

2.2 SNAC-EPO-HSYA不同介质中的稳定性考察

药物在体内的稳定性受体内pH环境、各种酶及微生物的影响，本实验通过考察复合物在不同环境中的释放程度来考察其稳定性影响因素。实验结果显示，SNAC-EPO-HSYA在胃蛋白酶和盐酸溶液(pH＝1.2)中释放较快，稳定性较差，推测其主要原因是由于复合物在盐酸溶液(pH＝1.2)中的分解度高于其他pH。模拟胃液介质中复合物的含量变化与pH＝1.2的介质中释放度相似，表明胃蛋白酶对复合物的稳定性无显著影响。与pH＝6.8的介质相比，复合物在模拟肠液中的释放没有显著性差异，表明胰蛋白酶的存在对其稳定性没有显著性影响。因此，复合物在人工肠液中的稳定性优于人工胃液，关键的影响因素是pH，推测这主要是由于复合物中的辅料EPO在酸性环境不稳定所导致的。本部分通过考察SNAC-EPO-HSYA在不同介质中HSYA的含量变化，发现复合物在近中性pH介质及人工肠液环境条件下均较稳定。但人体肠道内还存在各种各样的内容物，该复合物稳定性的具体影响因素仍需在进一步模拟体内环境的情况下研究，从而帮助本发明客观地预测HSYA的体内吸收过程。

3.SNAC-EPO-HSYA离体肠吸收考察

外翻肠囊法属于目前药物的肠吸收研究方法中的离体法，已被广泛地用于新型给药系统(如脂质液晶纳米粒、复合物等)促进药物的肠吸收特性研究。已有研究表明HSYA的主要吸收部位在小肠，主要通过被动转运吸收。本部分采用外翻肠囊法考察了HSYA和SNAC-EPO-HSYA在小肠不同肠段的吸收情况。结果显示SNAC-EPO-HSYA在不同肠段的吸收较HSYA均有显著提高。

本部分通过外翻肠囊法考察了SNAC-EPO-HSYA与HSYA的离体肠吸收特性，结果发现SNAC-EPO-HSYA在小肠段的吸收优于HSYA，有明显的促进作用。可能是由于：(1)部分游离的SNAC改变了细胞膜流动性，从而促进了HSYA的吸收；(2)SNAC-EPO-HSYA的脂溶性增加，且复合物中的辅料EPO延长了复合物在肠道的滞留时间，从而改善了HSYA在肠道的吸收；(3)SNAC-EPO-HSYA改变了HSYA的吸收方式，从而促进了药物在小肠中的吸收。

本部分采用溶剂蒸发法制备SNAC-EPO-HSYA，并通过单因素实验明确如下最佳制备工艺：反应溶剂甲醇、溶剂比例为70.0％、EPO与SNAC的浓度比为1：1，HSYA浓度为1.0mg/mL，调整pH＝6.0，在50.0℃下反应时间12h。最佳工艺制得的SNAC-EPO-HSYA的复合率为(80.4±0.8)％，且处方工艺重现性良好。同时，通过XRD、DSC、SEM等实验说明其形成了新的复合物，而非简单的物理混合，且SNAC-EPO-HSYA具有显著的促吸收能力，也为下一步体外细胞吸收研究的开展提供了一定的科学基础。

第三部分SNAC-EPO-HSYA的体外细胞学评价

在第二部分本发明已制备了SNAC-EPO-HSYA，且实验结果显示复合物可以提高药物的小肠吸收。本部分采用MTT实验考察了复合物对Caco-2细胞的细胞毒性，并通过检测胞内浓度含量考察了Caco-2细胞对SNAC-EPO-HSYA的摄取能力。同时，采用Caco-2细胞单层模型考察了SNAC-EPO-HSYA的跨膜转运行为，选择能量抑制剂和P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)抑制剂进一步探索SNAC-EPO-HSYA的摄取和转运机制。最后，为了进一步探明其作用机制，考察了SNAC-EPO-HSYA对细胞膜完整性和膜流动性的影响。

一、材料与方法

(一)实验材料

1.药品与试剂

DMEM培养基(高糖)、胰蛋白酶、青霉素-链霉素溶液(100X)和胎牛血清均购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝(Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT)(美国，Sigma公司)；膜示踪荧光探针(1,6-dipheny-1,3,5-hexatriene，DPH，上海懋康生物科技有限公司)；四氢呋喃(中国，杭州双林化工试剂有限公司)；叠氮钠(NaN₃，美国，Sigma公司)；维拉帕米(Verapami，美国，Sigma公司)；BCA试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司(中国，上海)；人结直肠腺癌Caco-2细胞株(中国医学科学院细胞中心(来源于美国ATCC))；二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)等分析纯试剂均购自上海源叶有限公司(中国，上海)。

(二)实验方法

1.SNAC-EPO-HSYA细胞毒性考察

1.1 Caco-2细胞的培养

Caco-2细胞在37.0℃、5.0％CO₂及饱和湿度的恒温培养箱中培养，每隔2-3d更换培养液。培养细胞至融合度为80.0％-90.0％时，用胰酶消化传代。

1.2复合物的细胞毒性评价

采用MTT法考察空白载体的安全性。取对数生长期Caco-2细胞以1.0×10⁴个/孔的密度接种于96孔板，在37.0℃、5.0％CO₂及饱和湿度的恒温培养箱中培养24h后，弃去培养液。分别加入不同浓度的HSYA、Physical mixture、SNAC-EPO-HSYA(以HSYA浓度计)、SNAC和EPO的溶液进行干预，同时设置阴性对照孔和空白调零孔。细胞培养48h后，每孔加入10.0μLMTT溶液(5.0mg/mL)。37.0℃继续避光培养4h后，每孔加入100.0μL DMSO。在避光条件下充分震荡后，用酶标仪测定570nm波长处的吸光度值OD，记录每孔测量结果，根据公式计算细胞存活率(Cell viability)：

Cell viability％＝(OD_实验组-OD_空白组)/(OD_对照组-OD_空白组)×100％

2.SNAC-EPO-HSYA细胞摄取考察

将Caco-2细胞以2.5×10⁵细胞/孔的密度接种到六孔板上，并培养14d，以进行摄取实验。首先，用HSYA与Caco-2细胞共同孵育1h、2h和4h，以考察Caco-2细胞摄取实验的最佳摄取时间。随后用HSYA、HSYA/SNAC、Physical mixture和SNAC-EPO-HSYA(HSYA浓度：1.0mg/mL)处理细胞，以研究SNAC和复合物对HSYA摄取产生的影响。同时，将Caco-2细胞与抑制剂(1.3mg/mL，NaN₃)预孵育30min后，分别给予HSYA、HSYA/SNAC、Physical mixture和SNAC-EPO-HSYA处理细胞，以考察制剂的摄取机制。

样品处理：摄取实验终止后，每孔加入1.0mL HBSS，置于-80.0℃超低温冰箱中反复冻融3次以破碎细胞，按BCA试剂盒说明书方法，测定各组蛋白含量。将细胞破碎液移入EP管14 000r/min离心10min后，分离上清液400.0μL加入2.0mL正己烷-异丙醇(95:5)涡旋混合3min，3500r/min离心10min。氮吹后用100.0μL 25.0％甲醇溶解，9000r/min离心5min，通过HPLC法进行检测。

3.SNAC-EPO-HSYA跨膜转运考察

3.1 Caco-2细胞单层模型的构建

将处于对数期生长的Caco-2细胞按2×10⁵个/mL的密度接种于Transwell(12孔板)聚酯膜的上室中，膜孔径为0.4μm，膜面积为1.12cm²，上室加入0.5mL。在Transwell的下室中加入1.5mL的空白完全培养液，放入培养箱中培养。前一周隔天换液，后两周每天换液，检测跨膜电阻值(Transmembrane resistance，TEER)，培养21-28d，电阻值为400-700Ω时，即形成Caco-2细胞单层模型。

3.2 Caco-2细胞模型的评估

通过跨膜电阻仪测定Caco-2细胞单层的TEER来评价培养好的Caco-2细胞，隔2d测定1次。首先将跨膜电阻仪的电极平衡15min，然后将电极放入Transwell小室(上室加0.5mL，下室加1.5mLHanks液)，并保持电极垂直并且不要碰到任何内壁，读取数值，重复测定3次。

3.3跨膜转运评估

将Caco-2细胞以2.5×10⁵细胞/孔的密度接种到12孔transwell上，并在类似于TEER测量期间的条件下进行培养。第21d按本部分“3.2”评估细胞模型后，将HSYA、HSYA/SNAC、Physical mixture和SNAC-EPO-HSYA(HSYA浓度：1.0mg/mL)添加至细胞顶侧，并将1.5mL无FBS的DMEM添加至基底外侧。在15、30、45、60、90、120min时，从基底外侧收集500.0μL样品，并用等体积的不含FBS的新鲜DMEM代替。同时，将Caco-2细胞与抑制剂(NaN₃(1.3mg/mL)，Verapami(10.0μg/mL))预孵育30min后，按上述给药取样方法进行实验，以考察转运机制。

样品处理：转运实验终止后，每孔加入0.5mL甲醇，然后进行25次探头超声处理(4.0℃，150.0W，在3s内每2s激活1次)。所有样品均以13000rpm离心5min。取上清200.0μL进HPLC分析，计算表观渗透系数(Apparent permeability，P_app)。

3.4跨膜电阻值评估

将Caco-2细胞以2.5×10⁵细胞/孔的密度接种到12孔transwell上，并在类似于TEER测量期间的条件下进行培养。第21d按本部分“3.2”评估细胞模型后，将HSYA、HSYA/SNAC、Physical mixture和SNAC-EPO-HSYA(HSYA浓度：1.0mg/mL)添加至顶侧，孵育2h后移出制剂并测量TEER，以评估SNAC-EPO-HSYA对Caco-2细胞膜完整性的影响，在移出制剂后并继续培养24h并测量TEER。

4.SNAC-EPO-HSYA对细胞膜流动性的影响考察

4.1荧光探针处理

取2.3mg DPH，加入5.0mL四氢呋喃振荡混匀，制得浓度为2.0mmol/L的母液，置于棕色瓶中4.0℃冰箱避光保存待用。临用前以PBS液(pH＝7.4)稀释至1/1000，使DPH标记液浓度为2.0μmol/L，震荡5-10min后，待用。

4.2细胞标记及处理

Caco-2细胞长至紧密融合后，用Hanks液冲洗2次，洗去杂质，实验组加入HSYA、HSYA/SNAC、Physical mixture和SNAC-EPO-HSYA(Hanks液配制，HSYA浓度：1.0mg/mL)，对照组为空白Hanks液。共同培养120min后，弃上清培养液，冲洗细胞2-3次后，消化细胞，用PBS液稀释密度为2.0×10⁵个/mL的细胞悬液。取细胞悬液2.0mL，加入2.0mL DPH标记液，混匀后，37.0℃水浴避光孵育30min，弃去残留DPH标记液。用PBS液冲洗细胞2次后，混悬细胞，用荧光分光光度计测定荧光强度，λ_EX＝362nm，λ_EM＝432nm，并计算荧光偏振度值(Polarization，Pr)和膜流动度(Fluidity，LFU)。

Pr＝(I_0,0–G×I_0,90)/(I_0,0+G×I_0,90)

LFU＝(0.5/(1-Pr))/Pr

其中G是校正因子，I_0,0指起偏器与检偏器相互平行时的荧光强度；I_0,90指起偏器为水平方向，检偏器为垂直方向时的荧光强度。

二、结果

1.SNAC-EPO-HSYA细胞毒性考察

Caco-2细胞毒性，在细胞毒性考察中，HSYA对Caco-2细胞表现出较低的细胞毒性和良好的生物相容性，当其浓度为400.0μg/mL时，细胞存活率仍大于85.0％。

2.SNAC-EPO-HSYA细胞摄取考察

研究孵育时间对HSYA的Caco-2细胞摄取的影响。HSYA在1、2、4h内的细胞摄取量分别是(0.8±0.2)μg/mg，(1.1±0.1)μg/mg，(1.1±0.2)μg/mg。其细胞摄取量在开始阶段随着时间增加而增加，2h后摄取增加缓慢，逐渐趋于饱和，因此确定以下实验中药物摄取时间为2h。相较于HSYA，HSYA/SNAC、Physical mixture和SNAC-EPO-HSYA均能增加HSYA的摄取，并且SNAC-EPO-HSYA的摄取更加显著(P<0.05)；使用NaN₃处理Caco-2细胞后对HSYA的摄取几乎没有影响，但显著抑制SNAC-EPO-HSYA的摄取(P<0.05)。

3.SNAC-EPO-HSYA跨膜转运考察

3.1细胞膜完整性考察

Caco-2单层模型TEER在21d到达(464.50±27.86)Ω。细胞膜完整性良好。

3.2跨膜转运

HSYA、HSYA/SNAC、Physical mixture和复合物的表观渗透系数(P_app)分别为(0.8±0.2)×10^-6，(1.8±0.08)×10^-6，(2.4±0.6)×10^-6，(4.3±0.5)×10^-6。经NaN₃处理后，HSYA的转运量没有明显变化，而SNAC-EPO-HSYA转运量显著减小；经Verapami处理后，虽HSYA的转运量仍没有明显变化，但SNAC-EPO-HSYA转运量极显著增加(P<0.01)。

3.3 Caco-2细胞中的TEER评估

经HSYA，HSYA/SNAC，Physical mixture和SNAC-EPO-HSYA孵育2h和除去含药溶液后并且继续培养24h后，Caco-2细胞的TEER均无明显变化。

4.SNAC-EPO-HSYA对细胞膜流动性的影响考察

在HSYA作用下Caco-2细胞膜中DPH探针的Pr和LFU与空白对照组比较无显著性差异(P>0.05)；与空白对照组比较，HSYA/SNAC和Physical mixture的Pr显著减小，而LFU显著增加(P<0.05)；与HSYA和空白对照组比较，复合物的Pr极显著减小，而LFU极显著增加(P<0.01)。

三、分析与讨论

1.SNAC-EPO-HSYA细胞毒性考察

MTT检测结果表明，HSYA浓度在0-400.0mg/L时，细胞存活率均在85.0％以上，无突然下降的情况。SNAC、Physical mixture和复合物质量浓度在0-300.0mg/L时，细胞存活率未出现突然下降的情况，均表现出较低的细胞毒性和良好的生物相容性，细胞存活率均在85.0％以上。EPO带有正电，细胞毒性略大于Physical mixture和复合物，浓度在0-200.0mg/L时，细胞存活率未出现突然下降的情况，细胞存活率均在85.0％以上。

2.SNAC-EPO-HSYA细胞摄取考察

结果表明，在同一浓度下，Physical mixture和HSYA/SNAC组的HSYA摄取量高于HSYA组，这说明Physical mixture和HSYA/SNAC组中的SNAC能够作为肠道促渗透剂，促进HSYA更好地摄取，但其机制仍需进一步考察。而SNAC-EPO-HSYA的HSYA摄取量高于Physicalmixture，其原因可能是：(1)HSYA在形成复合物的过程中，整个分子处于高度分散的状态，其自身的晶体特征被抑制，脂溶性的增加，透膜量提高；(2)SNAC改变了细胞膜流动性；(3)形成复合物后摄取机制发生了改变；(4)SNAC-EPO-HSYA中HSYA和SNAC延长了其在肠道上皮细胞的滞留时间。

加入能量代谢抑制剂NaN₃后对HSYA的摄取几乎没有影响，但在一定程度上抑制了HSYA/SNAC和Physical mixture的摄取；同时，复合物的摄取量显著降低，因此推测SNAC-EPO-HSYA的摄取特性与能量有关。

3.SNAC-EPO-HSYA跨膜转运考察

研究结果表明，HSYA、HSYA/SNAC、Physical mixture、复合物组在相同质量浓度下，随时间延长，HSYA转运量呈增长趋势，具有时间相关性；在同一浓度下，Physicalmixture和HSYA/SNAC组的HSYA转运量高于HSYA组，这表明Physical mixture和HSYA/SNAC组中的SNAC作为肠道促渗透剂在体外细胞层面有较好的效果。

NaN₃的加入对HSYA的摄取几乎没有影响，但可显著抑制SNAC-EPO-HSYA的转运。因此，推测SNAC-EPO-HSYA的跨膜方式主要为主动转运。Caco-2细胞单层顶侧膜上有丰富的外排蛋白P-gp表达，可被Verapami抑制；在使用Verapami处理后，HSYA的P_app与未加抑制剂孵育的对照组比较，并没有显著差异，说明HSYA的转运不受能量代谢和P-gp外排作用的影响，跨膜方式主要为被动转运。而复合物组显著增加，说明复合物的HSYA转运量与P-gp密切相关，但其相关性仍需进一步研究。同时，其跨膜电阻结果表明各组制剂几乎不影响细胞膜的完整性。

4.SNAC-EPO-HSYA对细胞膜流动性的影响考察

DPH作为荧光探针与细胞膜脂质孵育后，当LFU较大时，激发后Pr较弱。实验结果说明使用一定浓度的SNAC可明显增加Caco-2细胞膜流动性，改变膜环境；同时，复合物的作用更加显著，说明复合物也是促进低脂溶性的HSYA穿过上皮细胞完成吸收的可能机制之一。

本部分利用Caco-2细胞单层模型探索了HSYA、Physical mixture和复合物的体外吸收机制，其中，HSYA的吸收过程基本符合被动扩散，其转运且不受能量代谢的影响。同时，本部分通过细胞摄取、转运和膜流动性实验，表明复合物的摄取行为与能量密切相关，主要通过主动转运的方式进行跨膜，与P-gp密切相关。同时，其能在不损伤细胞膜完整性的前提下，显著改善细胞膜流动性。但本部分的体外实验存在一定的局限性，如缺乏粘液环境，且未充分考虑肠道的蠕动等因素的影响，因此需进一步与动物体内实验相结合，验证其促口服吸收效果。

第四部分SNAC-EPO-HSYA的体内评价

第三部分细胞学实验显示SNAC-EPO-HSYA能有效地改善HSYA的摄取与转运，但其在体内的作用仍不明确。因此，本发明以HSYA和Physical mixture为对照，对大鼠口服SNAC-EPO-HSYA后的药动学特性进行考察，以明确SNAC-EPO-HSYA的体内促吸收能力。

一、材料与方法

(一)实验材料

1.药品与试剂

SNAC-EPO-HSYA，由浙江中医药大学中药制剂实验室提供；HSYA(>82.5％，中国，浙江永宁药业股份有限公司)；HSYA对照品(≥98.0％，中国，上海麦克林生化科技有限公司)；羧甲基纤维素钠(Sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)购自北京博奥拓达科技有限公司；维生素B₂对照品(≥99.0％，中国，上海源叶生物科技有限公司)；高氯酸(70.0％，中国，上海杰星生物科技有限公司)；甲醇、乙腈(色谱级，美国，天地有限公司)。

2.动物

动物种属及来源：雄性SD大鼠，清洁级，体重(250.0±20.0)g，购自浙江中医药大学动物实验中心。所有动物实验均按照浙江中医药大学动物饲养和使用指南进行。

(二)实验方法

1.SNAC-EPO-HSYA药动学考察

1.1给药方案

选取体重(250.0±20.0)g的SD大鼠随机分为三组每组5只，禁食不禁水12h后，其中两组分别以20.0mg/kg(以HSYA计)灌胃给予HSYA和复合物。最后一组则静脉注射HSYA原药溶液(20.0mg/kg)。

1.2样品采集

分别于给药后5、15、30、45、60、120、240、360、480、1440min时于眼眶后静脉丛取血0.5mL置于1.5mL肝素化离心管中，离心后取上层血浆于-80.0℃冷冻保存，待测。处理后检测，记录不同时间药物浓度，绘制药动学曲线，记录药动学指标，计算F_rel和绝对生物利用度(Absolute bioavailablity，F_abs)，F_abs的计算公式如下：

F_abs(％)＝(AUC_r×D_r)/(AUC_i×D_i)×100％

式中AUC代表血药浓度一时间曲线下面积，下标r和i分别代表试验制剂和静脉给药的参比制剂，D代表给药剂量。

二、结果

1.SNAC-EPO-HSYA药动学考察

由表10所示，HSYA及其各组制剂均较符合二室模型，使用二室模型，权重为1/C，进行拟合较为合适；而静脉注射则较为符合单室模型，权重为1/C，使用单室模型进行拟合较为合适。

如图5及表11所示，根据HSYA与SNAC-EPO-HSYA的平均血药浓度-时间曲线图和相关药动学参数表明，HSYA对照组的t_1/2(Ka)为(12.1±3.2)min，而SNAC-EPO-HSYA组为(28.0±11.8)min，极显著地延长了其吸收时间(P<0.01)。同时相比于HSYA组，SNAC-EPO-HSYA组的C_max由(0.4±0.05)μg/mL极显著增大到(1.9±0.4)μg/mL，并且AUC_0→t与AUC_0→∞也分别由(46.9±15.2)min·μg/mL和(60.9±22.6)min·μg/mL极显著增大至(98.8±8.3)min·μg/mL和(110.9±16.2)min·μg/mL(P<0.01)。根据计算结果，SNAC-EPO-HSYA相较于HSYA的F_rel为1043.2％，F_abs为12.6％，表明其显著改善了HSYA的口服吸收。

表10 SD大鼠静脉注射HSYA与灌胃HSYA和SNAC-EPO-HSYA后体内药动学拟合程度

表11 SD大鼠静脉注射HSYA与灌胃HSYA和SNAC-EPO-HSYA后的体内药动学参数

*P<0.05vs HSYA；**P<0.01vs HSYA

三、分析与讨论

1.SNAC-EPO-HSYA药动学考察

本部分药动学结果表明将HSYA制成SNAC-EPO-HSYA后，相对生物利用度显著增加，可有效改善因HSYA的固有理化特性所引起的口服生物利用度低等问题。我们推测这是由于SNAC-EPO-HSYA能够极显著延长吸收时间，且克服了SNAC促吸收时间短和稳定性较差的问题，增加了吸收效率，从而改善了HSYA在SD大鼠的口服吸收情况。但是相较于静脉注射，口服SNAC-EPO-HSYA的绝对生物利用度仍有待增强，其原因可能是：(1)“第二部分SNAC-EPO-HSYA不同介质中的稳定性考察”结果表明SNAC-EPO-HSYA在胃酸环境中稳定性较差，需克服其在胃酸环境中的降解问题才能充分发挥复合物的促吸收作用；(2)SNAC-EPO-HSYA的处方可能仍有优化的空间；(3)本部分体内药动学方案未充分考虑病理生理环境差异对SNAC-EPO-HSYA吸收的影响，也可能对最终结果产生了影响。

综上，本发明的SNAC-EPO-HSYA能够有效增加HSYA的口服生物利用度。

而且，本发明的SNAC-EPO-HSYA用于制备抗心肌缺血的药物，具备口服抗心肌缺血的潜力。

以上所述仅是对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。