阅读说明：本技术 一种肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子及制备方法和应用 (Tumor microenvironment response type nuclear targeting platinum nanoparticles and preparation method and application thereof ) 是由 凌代舜 李方园 廖红卫 任家凤 李锐清 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子,包括铂纳米粒子和修饰在铂纳米粒子上的核靶向肽和两亲性聚合物。本发明还公开了一种肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子的制备方法：将铂盐前体、封端剂溶于水中形成前体溶液,加入强还原剂进行还原反应,得到超小型铂纳米粒子；将两亲性高分子溶于良溶剂中,加入修饰剂,搅拌反应,得到两亲性聚合物；将超小型铂纳米粒子与核靶向多肽溶于水中,搅拌反应,制备核靶向型铂纳米粒子；将核靶向型铂纳米粒子和两亲性聚合物溶于水中搅拌反应,得到肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子。该肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子能够特异性靶向肿瘤细胞,并进入细胞核损伤DNA,杀伤肿瘤细胞。(The invention discloses a tumor microenvironment response type nuclear targeting platinum nanoparticle, which comprises a platinum nanoparticle, and a nuclear targeting peptide and an amphiphilic polymer which are modified on the platinum nanoparticle. The invention also discloses a preparation method of the tumor microenvironment responsive nuclear targeting platinum nanoparticles, which comprises the following steps: dissolving a platinum salt precursor and an end-capping reagent in water to form a precursor solution, and adding a strong reducing agent to carry out a reduction reaction to obtain ultra-small platinum nanoparticles; dissolving amphiphilic polymer in a good solvent, adding a modifier, and stirring for reaction to obtain amphiphilic polymer; dissolving the subminiature platinum nanoparticles and the nuclear targeting polypeptide in water, and stirring for reaction to prepare nuclear targeting platinum nanoparticles; dissolving the nuclear targeting platinum nanoparticles and the amphiphilic polymer in water, and stirring for reaction to obtain the tumor microenvironment response type nuclear targeting platinum nanoparticles. The tumor microenvironment response type nuclear targeting platinum nanoparticles can specifically target tumor cells, enter cell nuclei to damage DNA and kill the tumor cells.)

一种肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子的制备领域，具体涉及一种pH响应型核靶向超小铂纳米粒子的制备方法及产物和应用。

背景技术

肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是全球肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一。根据2017年中国肿瘤登记中心的数据显示，我国肝癌发病人数约为36.5万人，排在癌症发病人数第四位；而死亡人数约为31.9万人，排名第二。肝癌作为癌症相关死亡的第二大原因，严重威胁着全世界的人类生命健康，尤其是在不发达国家地区。

肝癌早期患者可以通过手术方法切除肝肿瘤组织，但早期诊断的困难以及病程发展的迅速致使大部分病人确诊时往往已是存在肿瘤肝外转移的中晚期，因此化疗成为主要治疗手段。然而传统化疗对晚期HCC的疗效极为有限，因为许多小分子药物靶向性较差，难以富集于肿瘤部位发挥药效。同时，大多数HCC肿瘤对常规化疗药物具有抗药性，如顺铂(由于细胞内的氯离子浓度较低，顺铂进入细胞后，其配体氯会被水分子取代，形成的正电铂离子能够与细胞内DNA、RNA和蛋白质等亲核分子作用。其中，DNA为顺铂的主要作用靶点，顺铂多与DNA中的嘌呤碱基的N7位点结合，形成Pt-DNA加合物)。

顺铂的耐药性主要是由于它们的核累积不足和DNA修复机制。由顺铂引起的DNA损伤也可以被多种蛋白质抑制，导致Pt离子的量不足以与DNA相互作用。例如，铜转运蛋白-1的下调和外排相关蛋白的上调将极大地保护HCC细胞免受顺铂的DNA损伤作用。

因此，进一步开发能够克服抗药性、减小副作用的基于Pt的药物，具有重要研究意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子，该肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子能够特异性靶向肿瘤细胞，并进入细胞核损伤DNA，从而杀伤肿瘤细胞。

本发明所提供的技术方案如下：

一种肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子，所述肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子包括铂纳米粒子和修饰在铂纳米粒子上的核靶向肽和两亲性聚合物。

所述铂纳米粒子的粒径为1～10nm，所述肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子的粒径为1～50nm。上述的粒径范围，便于肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子的形貌与性能更加优异，能够更好的发挥抗肿瘤作用。

本发明提供的肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子，包含了具备核靶向作用的多肽，同时通过化学作用连接肿瘤微环境响应的两亲性聚合物，以此提高肿瘤细胞细胞核特异性靶向聚集，提高肿瘤治疗的效果。

本发明提供的肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子(以下简称抑制剂)借助其独特的纳米级尺寸(具有渗透与保留效应)，更有利于在肝脏肿瘤部位富集，且具备肿瘤微环境响应型电荷翻转能力，借助其微环境响应型对肿瘤微环境做出响应，即，在肿瘤微环境中两亲性高分子配体脱落，暴露表面核靶向肽，利用pH响应型实现入胞后电位的增强导致细胞核靶向，与核内DNA相互作用，发挥肿瘤治疗的效果。首先，静脉注射该纳米粒子后，借助渗透与保留效应能够更加良好地在肝脏部位聚集；其次，铂纳米粒子的表面配体-两亲性聚合物在肿瘤微环境下响应型脱落，实现电荷翻转，带正电荷的铂纳米粒子能更有效地穿透细胞核，有利于与核内DNA相互作用。

本发明还提供了一种肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

1)将铂盐前体、封端剂溶于水中形成前体溶液，加入强还原剂进行还原反应，得到超小型铂纳米粒子；

2)将两亲性高分子溶于良溶剂中，加入具有肿瘤微环境响应型的修饰剂，搅拌反应，透析后冻干，得到肿瘤微环境响应型的两亲性聚合物；

3)将步骤1)中的超小型铂纳米粒子与核靶向多肽溶于水中，搅拌反应，制备核靶向型铂纳米粒子；

4)将步骤3)中的核靶向型铂纳米粒子和步骤2)中的肿瘤微环境响应型的两亲性聚合物溶于水中搅拌反应，得到肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子。

所述步骤1)中铂盐前体为氯铂酸，还原剂为硼氢化钠，封端剂选自柠檬酸或聚丙烯酸、聚乙烯醇。

所述步骤2)中两亲性高分子选自市售两亲性辅料或合成高分子聚合物，所述市售两亲性辅料选自泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、吐温、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯、司盘、磷脂、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、白蛋白、脂蛋白、蓖麻油聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯、脂肪酸聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚和多元醇酯中的一种或多种。所述合成高分子聚合物是以聚乙二醇、壳聚糖、聚天冬氨酸苄酯、聚醚酰亚胺或聚多巴胺等高分子为骨架进行修饰的聚合物。

作为优选，所述步骤2)中两亲性高分子选自乙二醇丙烯酸酯共聚物、乙二醇

所述步骤2)中具有微环境响应型的修饰剂为pH响应型基团的修饰剂。作为优选，所述步骤2)中具有微环境响应型的修饰剂选自带有咪唑、哌啶或β-硫基基团的小分子化合物。

作为优选，所述步骤2)中修饰剂选自1-(3-氨丙基)咪唑或1-(3-氨丙基)哌啶、巯基乙胺。两亲性高分子与修饰剂的摩尔投料比为1:5～10。

作为优选，所述步骤2)中两亲性高分子选自天冬氨酸苄酯共聚物、乙二醇丙烯酸酯共聚物、乙二醇谷氨酸共聚物、泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、吐温、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、白蛋白和脂蛋白中的一种或几种。

所述步骤2)中良溶剂选自二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基乙酰胺和甲醇中的一种或几种。

在本发明中，肿瘤微环境敏感的两亲性高分子需要有效地连接上具有肿瘤微环境响应型的基团，使得具备肿瘤微环境响应型的核靶向铂纳米粒子性能得到保证。

作为优选，所述步骤3)中核靶向肽选自TAT peptide、SV40 T抗原或腺病毒核定位序列。

所述步骤4)中核靶向多肽、肿瘤微环境响应的两亲性聚合物和铂纳米粒子的质量投料比为1:2～8:30-50。

作为优选，所述步骤4)中核靶向多肽、肿瘤微环境响应的两亲性聚合物和铂纳米粒子的质量投料比为1:2～4:30-50。为了能使敏感性高分子将核靶向型铂纳米粒子更好的包覆在内，在肿瘤微环境下逐步脱落而在正常生理环境中稳定，需要控制肿瘤微环境敏感的两亲性聚合物和铂纳米粒子以及核靶向肽的比例。核靶向肽投量较低时不足以产生良好的入核效果；而微环境敏感性高分子投量过低会导致核靶向肽过早暴露，投量过高则导致高分子脱落缓慢，核靶向肽难以暴露。

本发明还提供一种如上述的肿瘤微环境敏感的核靶向铂纳米粒子在用于制备治疗肝癌药物中的应用。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明所涉及的制备方法体系温和，条件可控，所制备的材料均具有良好的生物相容性，具有良好的临床转化可能性。

(2)本发明所得的肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子能够有效靶向肿瘤细胞核，杀伤肿瘤细胞，铂纳米粒子与DNA结合直接造成DNA损伤，从而克服抗药性。

附图说明

图1为实施例1-3中的β-巯基修饰的乙二醇丙烯酸酯共聚物的核磁共振氢谱图；

图2为实施例1-3中的超小型铂纳米粒子的HRTEM照片；

图3为实施例1-3中的超小型铂纳米粒子的XRD图谱；

图4为应用例中肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子在不同pH条件下，细胞摄取结果分析图；

图5为应用例中肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子在不同pH条件下，入核结果分析图；

图6为应用例中肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子在不同pH条件下，CCK8结果分析图；

图7为应用例中经不同肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子处理后，共聚焦激光扫描显微镜下显示的DNA损伤。

具体实施方式

下面结合具体的实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1

1)pH敏感的两亲性聚合物的合成：将0.5g的乙二醇丙烯酸酯共聚物和0.05g巯基乙胺溶于5ml的二甲基亚砜中，在氩气的保护状态下，滴入460μl的三乙胺，室温搅拌24小时。反应结束后，将溶液在水中透析，冻干，得到β-巯基修饰的乙二醇丙烯酸酯共聚物(pH敏感的两亲性聚合物)。对制备得到的pH敏感的两亲性聚合物进行NMR结构表征，如图1所示。

2)超小型铂纳米粒子的合成：将72mg的氯铂酸和0.8g的聚丙烯酸溶于38ml水中，室温下搅拌30分钟。加入5mg硼氢化钠继续搅拌1小时，将反应液在水中透析，得到超小型铂纳米粒子。对制备得到的超小型铂纳米粒子进行TEM和XRD表征，分别如图2和图3所示。

3)肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子：将1.08mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到含有3mg超小型铂纳米粒子的10ml水溶液中，室温下搅拌15分钟活化羧基。随后，加入TAT肽60μg，室温下搅拌4小时。然后加入240μg pH敏感的两亲性高分子聚合物继续反应24小时。反应液超滤出去多余的原料，得到肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子。

实施例2

1)pH敏感的两亲性聚合物的合成：将0.5g的乙二醇丙烯酸酯共聚物和0.05g巯基乙胺溶于5ml的二甲基亚砜中，在氩气的保护状态下，滴入460μl的三乙胺，室温搅拌24小时。反应结束后，将溶液在水中透析，冻干，得到β-巯基修饰的乙二醇丙烯酸酯共聚物。对制备得到的pH敏感的两亲性聚合物进行NMR结构表征，如图1所示。

2)超小型铂纳米粒子的合成：将72mg的氯铂酸和0.8g的聚丙烯酸溶于38ml水中，室温下搅拌30分钟。加入5mg硼氢化钠继续搅拌1小时，将反应液在水中透析，得到超小型铂纳米粒子。对制备得到的超小型铂纳米粒子进行TEM和XRD表征，分别如图2和图3所示。

3)肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子：将1.08mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到含有3mg超小型铂纳米粒子的10ml水溶液中，室温下搅拌15分钟活化羧基。随后，加入TAT肽100μg，室温下搅拌4小时。然后加入200μg pH敏感的两亲性高分子聚合物继续反应24小时。反应液超滤去除多余的原料，得到肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子。

实施例3

1)pH敏感的两亲性聚合物的合成：将0.5g的乙二醇丙烯酸酯共聚物和0.05g巯基乙胺溶于5ml的二甲基亚砜中，在氩气的保护状态下，滴入460μl的三乙胺，室温搅拌24小时。反应结束后，将溶液在水中透析，冻干，得到β-巯基修饰的乙二醇丙烯酸酯共聚物。对制备得到的pH敏感的两亲性聚合物进行NMR结构表征，如图1所示。

2)超小型铂纳米粒子的合成：将72mg的氯铂酸和0.8g的聚丙烯酸溶于38ml水中，室温下搅拌30分钟。加入5mg硼氢化钠继续搅拌1小时，将反应液在水中透析，得到超小型铂纳米粒子。对制备得到的超小型铂纳米粒子进行TEM表征和XRD表征，分别如图2和图3所示。

3)肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子：将1.08mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到含有3mg超小型铂纳米粒子的10ml水溶液中，室温下搅拌15分钟活化羧基。随后，加入TAT肽100μg，室温下搅拌4小时。然后加入240μg pH敏感的两亲性高分子聚合物继续反应24小时。反应液超滤出去多余的原料，得到肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子。

应用例：肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子用于肝癌的治疗。

(1)细胞摄取和入核能力

不同浓度药物的制备：选用实施例1、3制备得到的肿瘤微环境响应型核靶向铂纳米粒子([email protected]/sPEG)和核靶向纳米粒子([email protected])分散在水溶液中得到一定浓度的样品(20μgmL-1)。将肝癌细胞接种于平板，并在含有10％胎牛血清的DMEM中于37℃在潮湿和5％CO₂培养箱中培养。附着24小时后，在不同pH条件(pH＝7.4和6.0)下用[email protected]/sPEG和[email protected](20μgmL^-1)与细胞共孵育24小时。收集细胞并用PBS洗涤，将细胞硝化并定量浓度。对于细胞核摄取定量，按照试剂盒进行操作。将细胞悬浮于200μl冷却裂解缓冲液中并使用移液管吹扫15次。然后加入10μl试剂A，将细胞在冰浴中冷却以进一步破碎并每3分钟进行一次吹扫。通过以不同速度离心获得细胞核。对细胞核进行硝化，并通过电感耦合等离子体原子发射光谱法定量细胞核中Pt离子的浓度。定量分析结果如图4所示，酸性条件下细胞摄取[email protected]/sPEG的浓度明显高于中性条件。此外，在中性pH下细胞摄取较少，是材料具有良好的正常组织安全性。入核结果如图5所示(从左到右依次为采用实施例1和实施例3中的[email protected]/sPEG)，酸性环境中[email protected]/sPEG的浓度明显高于中性条件，表明sPEG具有良好的pH响应型，不同比例的TAT靶向肽展现出不同的靶向能力。

(2)肿瘤细胞杀伤能力：在不同pH条件下(pH＝7.4，pH＝6.0)，用不同浓度(2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml和40μg/ml)纳米颗粒处理细胞24h。然后，将细胞与CCK-8溶液共孵育3小时后，在酶标仪上读取每个孔的吸光度。如图6所示，结果表明，相比于[email protected]，[email protected]/sPEG在酸性条件下具有更强的肿瘤细胞杀伤能力。说明材料具有良好的肿瘤微环境响应型及治疗作用。

(3)DNA损伤能力：通过CLSM研究了与[email protected]/sPEG和[email protected]温育后LM3细胞的DNA损伤。如图7所示，在中性条件下，用[email protected]和[email protected]/sPEG孵育的LM3细胞中可观察到极轻微的DNA损伤，这是由于中性条件下纳米颗入核较少，无法与DNA相互作用。相反，在酸性条件下，经[email protected]/sPEG处理后，可以观察到荧光信号显著增强，表明由[email protected]/sPEG的直接入核造成严重的DNA损伤。

以上所述实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改，补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。