阅读说明：本技术 一种具有抑菌与缓释硫化氢双功能的纳米硫化铁及其制备方法和应用 (Nano iron sulfide with double functions of bacteriostasis and slow release of hydrogen sulfide, and preparation method and application thereof ) 是由 许卓斌 张唯 高利增 李丹丹 程璐 于 2020-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有抑菌与缓释硫化氢双功能的纳米硫化铁及其制备方法和应用,本发明将铁源、硫源和聚乙烯吡咯烷酮在溶液中混合均匀,然后进行溶剂热反应,结束后冷却、分离、洗涤和干燥,即得所述纳米硫化铁。本发明中所述纳米硫化铁,能够诱导细菌产生活性氧(ROS),破坏细菌的脂质、蛋白质和DNA等结构来影响细菌的功能,并且抑制细菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性,促进细菌细胞壁脱落降解,导致细菌死亡,并且有效抑制细菌生物膜的形成。谷胱甘肽可以诱导纳米硫化铁缓慢释放硫化氢,促进HUVEC细胞迁移、血管形成,对细菌感染以及组织修复有一定价值。(The invention discloses nano iron sulfide with double functions of bacteriostasis and slow release of hydrogen sulfide, and a preparation method and application thereof. The nano iron sulfide can induce bacteria to generate Reactive Oxygen Species (ROS), destroy structures such as lipid, protein and DNA of the bacteria to influence functions of the bacteria, inhibit activity of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) of the bacteria, promote shedding and degradation of cell walls of the bacteria to cause bacterial death, and effectively inhibit formation of bacterial biofilms. Glutathione can induce nano iron sulfide to slowly release hydrogen sulfide, promotes HUVEC cell migration and angiogenesis, and has certain value on bacterial infection and tissue repair.)

一种具有抑菌与缓释硫化氢双功能的纳米硫化铁及其制备方 法和应用

技术领域

本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种具有抑菌与缓释硫化氢双功能的纳米硫化铁及其制备方法和应用。

背景技术

细菌感染是全球高发疾病之一，且呈逐年上升趋势对人类健康的危害也越来越大。广谱抗生素可以治疗绝大多数的细菌感染，但一批耐药性强的细菌生存下来。细菌耐药性和耐药菌感染是21世纪细菌性疾病治疗领域面临的巨大挑战。随着抗菌药应用日益增多，耐药性问题日趋严重，使细菌性疾病治疗失败，导致发病率和病死率上升及用药费用增加。已知有些无机纳米材料能够产生抗菌的作用。其机制是通过产生活性氧(ROS)或诱导产生氧化应激产生抑菌作用。目前纳米材料作为抗菌剂的优点是抗菌效果好，不易产生药物耐受，而且对耐药细菌杀伤效果依然明显，而且制备效果简单，成本低廉，稳定性高。

但是，目前无机纳米材料也存在一些缺陷，如产品不稳定，生物相容性差，仅有单一的抑菌功能等。

发明内容

发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种具有抑菌与缓释硫化氢双功能的纳米硫化铁及其制备方法和应用。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种聚乙烯吡咯烷酮修饰的纳米硫化铁的制备方法，包括将铁源、硫源和聚乙烯吡咯烷酮在溶液中混合均匀，然后进行溶剂热反应，结束后冷却、分离、洗涤和干燥，即得所述纳米硫化铁。

作为优选：

所述铁源选自二价铁和/或三价铁，进一步优选氯化铁、硫酸亚铁、硝酸铁、溴化铁中的一种或多种。

所述硫源选自半胱氨酸、谷胱甘肽、硫脲、Na₂S、NaHS、烯丙基甲基硫醚、二烯丙基硫醚、烯丙基甲基二硫醚、二烯丙基二硫醚、烯丙基甲基三硫醚、二烯丙基三硫醚、烯丙基乙硫醚中的一种或多种。

所述铁源与硫源的摩尔比为1:0.01-10，优选1：0.1-1；所述聚乙烯吡咯烷酮与硫源的摩尔比为1:1-1000，优选1：10-100。

所述铁源、硫源和聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液中，还包括醋酸钠；所述溶剂热反应的温度为180-220℃，反应时间为12-24小时。

本发明还提供了所述制备方法所制得的纳米硫化铁材料。

本发明最后提供了所述的纳米硫化铁材料的相关应用，包括：

所述的纳米硫化铁材料作为抑菌剂的应用，尤其是在杀灭金黄色葡萄球菌或者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用。

本发明制备的纳米硫化铁，能够诱导金黄色葡萄球菌以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)产生活性氧(ROS)，进而诱发氧化应激，破坏细菌的脂质、蛋白质和DNA等结构来影响细菌的功能，并且抑制细菌GAPDH酶活性，阻断细菌代谢以及电子传递，促进细菌细胞壁脱落降解，导致细菌死亡，并且有效抑制细菌生物膜的形成。

所述的纳米硫化铁材料还可以作为硫化氢供体应用。

本发明制备的纳米硫化铁，可以在还原剂存在条件下缓慢可控释放硫化氢，还原剂可以是谷胱甘肽、半胱氨酸、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇等。优选的为谷胱甘肽，浓度应为0.1mM以上，优选为0.2-100mM，进一步优选为0.5-10mM。

进一步实验证实，本发明制备的纳米硫化铁可以被谷胱甘肽可以诱导缓释硫化氢，与Na₂S组相比，谷胱甘肽诱导纳米硫化铁产生硫化氢过程比Na₂S缓慢。

由于所述的纳米硫化铁材料具有抑菌和硫化氢供体双功能，并且通过HUVEC细胞迁移实验证明纳米硫化铁谷胱甘肽存在条件下可以促进人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)迁移，通过HUVEC细胞小管形成实验证明纳米硫化铁谷胱甘肽存在条件下可以促进人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)小管形成。因此，本发明还提供了所述的纳米硫化铁材料在制备促进细菌感染伤口愈合药物中的应用。

本发明通过溶剂热合成法得到的具有双重功能纳米硫化铁，其在水中的分散性好，自然条件下性质稳定，生物相容性好。其通过产生活性氧(ROS)或诱导产生氧化应激，从而破坏细菌的脂质、蛋白质和DNA等结构产生细菌细胞壁脱落与降解，杀灭细菌并且抑制细菌生物膜形成；通过谷胱甘肽可缓控释放出硫化氢，硫化氢是一种参与调控血管功能的新型内源性气体分子，具有促进血管新生、组织修复的用途，进而对细菌感染的伤口愈合有促进作用。

有益效果：本发明中所述纳米硫化铁，能够诱导细菌产生活性氧(ROS)，破坏细菌的脂质、蛋白质和DNA等结构来影响细菌的功能，并且抑制细菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性，促进细菌细胞壁脱落降解，导致细菌死亡，并且有效抑制细菌生物膜的形成。谷胱甘肽可以诱导纳米硫化铁缓慢释放硫化氢，促进HUVEC细胞迁移、血管形成，对细菌感染以及组织修复有一定价值。

附图说明

图1纳米硫化铁的透射电镜图；

图2纳米硫化铁抑制金黄色葡萄球菌(A)，以及MRSA(B)结果；

图3纳米硫化铁抑制金黄色葡萄球菌(A)，以及MRSA(B)扫描电镜结果；

图4纳米硫化铁抑制金黄色葡萄球菌生物膜(4A)，以及MRSA生物膜(4B)结果图；

图5纳米硫化铁释放缓控硫化氢结果(A为纳米硫化铁随GSH浓度变化释放硫化氢速度，B为纳米硫化铁与Na₂S释放硫化氢速率对比)；

图6纳米硫化铁促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移；

图7纳米硫化铁促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)小管形成；

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。

实施例1

纳米硫化铁的制备及表征示例1：将0.5g聚乙烯吡咯烷酮(分子量1万)溶于20mL的乙二醇中，待充分溶解后加入0.2g的FeCl₃.6H₂O，3.6g的醋酸钠溶液(0.1M,pH4.5)，和1g L-半胱氨酸,磁力搅拌均匀。将反应液全部倒入50毫升聚四氟乙烯反应釜中，转移到烘箱内，200℃反应16小时。反应产物自然冷却至室温后，离心分离，利用无水乙醇洗涤三遍，冷冻真空干燥，最终获得纳米硫化铁。扫描电镜(SEM)，透射电镜(TEM)对产物进行表征(见图1)。

实施例2

纳米硫化铁的制备及表征示例2：将:1.0g聚乙烯吡咯烷酮(分子量1万)溶于20mL的乙二醇中，待充分溶解后加入0.2g的FeCl₃.6H₂O，3.6g的醋酸钠溶液(0.1M,pH4.5)，和0.5g L-半胱氨酸,磁力搅拌均匀。将反应液全部倒入50毫升聚四氟乙烯反应釜中，转移到烘箱内，200℃反应24小时。反应产物自然冷却至室温后，离心分离，利用无水乙醇洗涤三遍，冷冻真空干燥，最终获得纳米硫化铁。

实施例3

纳米硫化铁的制备及表征示例3：将0.5g聚乙烯吡咯烷酮(分子量1万)溶于20mL的乙二醇中，待充分溶解后加入0.2g的FeCl₃.6H₂O，3.6g的醋酸钠溶液(0.1M,pH4.5)，和1g硫脲，磁力搅拌均匀。将反应液全部倒入50毫升聚四氟乙烯反应釜中，转移到烘箱内，200℃反应16小时。反应产物自然冷却至室温后，离心分离，利用无水乙醇洗涤三遍，冷冻真空干燥，最终获得纳米硫化铁。

实施例4

纳米硫化铁的制备及表征示例4：将1.0g聚乙烯吡咯烷酮(分子量1万)溶于20mL的乙二醇中，待充分溶解后加入0.2g的FeCl₃.6H₂O，3.6g的醋酸钠溶液(0.1M,pH4.5)，和1mL二烯丙基二硫醚，磁力搅拌均匀。将反应液全部倒入50毫升聚四氟乙烯反应釜中，转移到烘箱内，200℃反应24小时。反应产物自然冷却至室温后，离心分离，利用无水乙醇洗涤三遍，冷冻真空干燥，最终获得纳米硫化铁。

实施例5纳米硫化铁体外抗菌性质检测

将单克隆金黄色葡萄球菌(S.aureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)分别在LB液体培养基中以转速180rpm在37℃培养12小时。然后取菌液用LB培养基按1:100的比例转接，继续培养2.5小时，待OD_600nm达到0.7时，用0.89％的氯化钠溶液将细菌稀释至10⁷CFU/mL。然后将实施例(1)制备的纳米硫化铁酶(100ug/mL)和细菌混合，作用60分钟后，将混合液稀释至一定梯度后取100uL涂布在LB琼脂平板培养基表面，倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜，观察平板上的菌落生长情况并进行计数。纳米硫化铁和细菌，0.89％的氯化钠溶液和细菌作为对照组。(抑菌数据结果分别如图2所示)。将经过以上处理的细菌，用2.5％的戊二醛固定，过夜后，用乙醇/水梯度混合溶液脱水，干燥喷金后，用扫描电镜观察，纳米硫化铁可以显著破坏细菌形态，结果如图3所示。

实施例6纳米硫化铁抑制细菌生物膜的生长

利用24孔板用LB培养基按1:100比例分别转接金黄色葡萄球菌与MRSA，用生物爬片培养过夜后，于第二天上午9点和晚上9点与100ug/ml的纳米作用1小时后，再换取新鲜LB培养液，继续培养，第三天重复上述步骤。于第四天上午9点取出，用2.5％的戊二醛固定，过夜后，用乙醇/水梯度混合溶液脱水，干燥喷金后，用扫描电镜观察生物膜的生长情况(如图4)。纳米硫化铁在能明显抑制生物膜的生长。

实施例7谷胱甘肽GSH可以诱导纳米硫化铁缓释硫化氢

将纳米硫化铁配成50ug/ml的纳米溶液，继而在溶液加入谷胱甘肽浓度为1mM，即可缓慢产生硫化氢。与Na₂S组相比，纳米硫化铁产生硫化氢过程比Na₂S(60uM)缓慢(如图5所示)。

实施例8纳米硫化铁促进HUVEC细胞迁移

收集对数生长期的HUVEC细胞，用含5％FBS的ECM培养基重悬细胞，调整细胞密度为2×10⁵个/mL。将细胞悬液以每孔500μL接种于24孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱孵育。待细胞长满孔底至70％—80％时，将原培养液吸弃，换无血清培养基1mL/孔饥饿12小时左右。吸弃孔中原有的培养基，用100uL无菌枪头在每孔中央画“一”字，PBS清洗两次后，分别加入用5％FBS-ECM完全培养基稀释好的无菌PBS溶液、纳米硫化铁(50ug/mL)、GSH(1mM)、纳米硫化铁溶液(50ug/mL)与GSH(1mM)混合药物，每孔总体积为500μL，每个浓度设3个平行孔。加药后立即拍照，记为0h，置于37℃、5％CO₂培养箱培养。加药后，24小时后进行拍照。结果如图6所示。

实施例9纳米硫化铁促进HUVEC细胞小管形成

用无血清ECM培养基将Matrigel基质胶按1:1体积比稀释，96孔板中每孔加50μL进行铺胶，铺胶后将96孔板置于冰袋上10min，使基质胶均匀铺开。5％FBS-ECM培养基调整细胞密度为3×10⁵个/mL。用无血清ECM培养基将纳米硫化铁分别稀释至2000ug/mL、GSH为20mM。待测药物配制好后，铺胶后的96孔板中每孔加入无菌PBS溶液、纳米硫化铁(50ug/mL)、GSH(1mM)、纳米硫化铁溶液(50ug/mL)与GSH(1mM)混合药物。于37℃、5％CO₂培养箱中孵育6h后，倒置荧光拍照显微镜进行观察和拍照，结果如图7所示。