具体实施方式

以下将结合具体的实施例来进一步阐述本发明的技术方案。本发明所述EK1蛋白为申请号为202010080751.4、发明名称为“多肽、其生产方法和用途”的专利申请记载。除非另有说明，本发明中使用的仪器、试剂、材料、实验动物等均可通过常规商业手段获得。

实施例1：EK1冻干粉注射剂的处方研究

1.剂型及处方组成

1.1剂型

本品为无菌冻干粉，规格：15mg，其单位剂量产品的处方组成分别如下表：

表1.单位剂量EK1产品的处方组成

注：注射用水在冻干工艺过程中几乎全部去除；原料药同期申报为企业自拟标准。

1.2专用溶剂

本品无专用溶剂

1.3所使用的包装材料和容器

西林瓶：中硼硅玻璃管制注射剂瓶。

胶塞：注射用冷冻干燥用氯化丁基橡胶塞。

铝盖：抗生素瓶用铝塑组合盖。

2.赋形剂筛选

2.1选择赋形剂

甘露醇、葡萄糖、木糖醇、乳糖、山梨醇及其组合物。

需要满足特定要求：1.能够作为赋形剂，形成冻干粉末；2.能够调节渗透压，保证等渗或微高渗，以便注射。

用于筛选赋形剂的EK1蛋白冻干粉处方溶液具体情况如表2所示。

表2.筛选赋形剂用处方的具体组成

2.2检测项目及检测方法如表所示：

表3.蛋白冻干粉的检测项目

冻干粉针检测方法：

·外观：取供试品，置明亮处观察。

·水分：取本品，照水分测定法(中国药典2015年版四部通则0832第一法2)测定。

·复溶时间：取本品5支，揭铝盖，用注射器注入1.0ml水，振摇，测定复溶时间。

·溶液澄清度与颜色：取本品，加水制成每1ml中约含EK1 15mg的溶液，照中国药典2015年版四部通则0902第一法与中国药典2015年版四部通则0901第一法，检测溶液澄清度与颜色。

·渗透压摩尔浓度：取本品，精密加入1ml水复溶后，依法测定(中国药典2015年版四部通则0632)毫渗透压摩尔浓度。

·有关物质/纯度：参照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定。色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ZORBAX300SB-C18 3.5μm，4.6×150mm或效能相当的色谱柱)；以30mmol/L磷酸二氢钾溶液(取磷酸二氢钾4.08g，加水1000ml溶解，用42％氢氧化钠溶液调pH值至6.0)为流动相A，以乙腈为流动相B；流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为215nm；进行梯度洗脱。测定方法：取本品，每瓶加水1ml复溶再用流动相稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液20μl，分别注入色谱仪，记录色谱图。扣除溶剂及辅料峰，按面积归一化法计算主峰纯度。

2.3冻干粉针检测结果

表4.冻干粉针考察结果-外观

表5.冻干粉针考察-0天水分结果

表6.冻干粉针考察-0天渗透压摩尔浓度结果

表7.冻干粉针考察-最大复溶时间结果

表8.冻干粉针考察-复溶后溶液澄清度与颜色结果

表9.冻干粉针考察-主峰纯度(％)结果

冻干粉针试验结果表明：

①冻干粉针处方1/2/3/7/9在各条件下外观为白色疏松块状物，其余均有粘稠状；

②冻干粉针处方1/2/3/7/9在0天水分均小于2.0％；

③冻干粉针处方1、2、3渗透压摩尔浓度均在280～310mOsmol/kg，满足注射液等渗要求，而7/9由于低于260，无法满足等渗需求(最低260～320范围)；

④冻干粉针处方1/2/3/7/9的其他各处方在各条件下最大复溶时间均小于15s，满足要求；

⑤冻干粉针处方1/2/3/7/9在各条件下复溶后溶液澄清度均为澄清溶液；

⑥冻干粉针在甘露醇的保护下，能够达到比较稳定，而在木糖醇和山梨醇作为赋形剂下，稳定性稍微降低；

综合上述结果显示，常规的冻干粉末赋形剂中，糖醇类(甘露醇、木糖醇、山梨醇)似乎更能够保护EK1，而糖类(葡萄糖、乳糖)等似乎与EK1产生些许反应，导致冻干粉性状发生变化。同时，为了能够满足注射液的渗透压需求，因此选择甘露醇作为赋形剂。

3.处方筛选

本品原料药碱度(1mg/ml)约为8.7，同时考虑本品理论等电点为4.02，结合制剂常规pH范围为4～9，设计pH考察范围为5.0～10.0，调节值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；处方中加入缓冲盐以增加制剂pH稳定性，缓冲盐选择：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸氢钠、枸橼酸钠，盐浓度选择：20mmol/L；pH调节剂为0.5mol/L盐酸溶液或0.5mol/L氢氧化钠溶液；处方中加入约4.0％甘露醇作为赋形剂。

3.1冻干粉针处方及制备工艺(每个处方制备100ml)

表10.冻干粉针处方

制备工艺：称取处方量甘露醇、磷酸二氢钠(或碳酸氢钠或枸橼酸钠或磷酸氢二钠)和EK1，加处方量80％注射用水，缓慢搅拌使溶解，用0.5mol/L氢氧化钠溶液或0.5mol/L盐酸溶液调pH值至设定值±0.1，加入处方量20％注射用水(扣除调节剂使用量)，混匀，用杭州科百特过滤器材有限公司0.22μm PES膜(双层)滤过，分装于2ml中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，1.0ml/瓶，加注射用冷冻干燥无菌粉末用氯化丁基橡胶塞半压塞，冷冻干燥，全压塞，加抗生素瓶用铝塑组合盖轧盖，即得。

3.2检测项目及检测方法

表11.检测项目安排表

冻干粉针检测方法：

·外观：取供试品，置明亮处观察。

·水分：取本品，照水分测定法(中国药典2015年版四部通则0832第一法2)测定。

·复溶时间：取本品5支，揭铝盖，用注射器注入1.0ml水，振摇，测定复溶时间。

·溶液澄清度与颜色：取本品，加水制成每1ml中约含EK1 15mg的溶液，照中国药典2015年版四部通则0902第一法与中国药典2015年版四部通则0901第一法，检测溶液澄清度与颜色。

·渗透压摩尔浓度：取本品，精密加入1ml水复溶后，依法测定(中国药典2015年版四部通则0632)毫渗透压摩尔浓度。

·有关物质/纯度：参照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定。色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ZORBAX300SB-C18 3.5μm，4.6×150mm或效能相当的色谱柱)；以30mmol/L磷酸二氢钾溶液(取磷酸二氢钾4.08g，加水1000ml溶解，用42％氢氧化钠溶液调pH值至6.0)为流动相A，以乙腈为流动相B；流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为215nm；进行梯度洗脱。测定法：取本品，每瓶加水1ml复溶再用流动相稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液20μl，分别注入色谱仪，记录色谱图。扣除溶剂及辅料峰，按面积归一化法计算主峰纯度。

3.3冻干粉针检测结果

表12.冻干粉针考察结果-外观

表13.冻干粉针考察-0天水分结果

表14.冻干粉针考察-0天渗透压摩尔浓度结果

表15.冻干粉针考察-最大复溶时间结果

表16.冻干粉针考察-复溶后溶液澄清度与颜色结果

表17.冻干粉针考察-主峰纯度(％)结果

冻干粉针试验结果表明：

①冻干粉针各处方在各条件下外观均为白色疏松块状物；

②冻干粉针各处方0天水分均小于2.0％；

③冻干粉针处方1、3、4、5、6、11、12渗透压摩尔浓度均在260～320mOsmol/kg，满足等渗要求；

④冻干粉针除处方1外的其他各处方在各条件下最大复溶时间均小于15s，满足要求；

⑤冻干粉针各处方在各条件下复溶后溶液澄清度均为澄清溶液；

⑥冻干粉针各处方在0天、40度5天、光照5天及13天条件下复溶后溶液颜色均为无色溶液；处方1、2、3在60度5天及13天、40度13天条件下复溶后溶液颜色均为无色溶液；处方4～12在40度13天条件下复溶后溶液颜色均为几乎无色溶液；处方4、5、8、9、11、12在60度13天条件下复溶后溶液颜色均为几乎无色溶液；处方6、7、10在60度13天条件下复溶后溶液颜色均为浅于1号黄色标准比色液；

⑧冻干粉针各处方在40度及光照13天后纯度无明显变化；在60度13天后，纯度有明显降低，其中处方1、2明显差于其余处方，其余处方纯度结果基本一致；

综合上述结果显示，本品较稳定pH范围为7～10；甘露醇用量不影响产品质量稳定性；不同缓冲盐不影响产品质量稳定性；故选择处方4为本品冻干粉针处方。

实施例2：EK1冻干粉注射剂的工艺研究

1.EK1处方溶液的稳定性考察

以实施例1中200504-4处方溶液为研究目标，考察其稳定性。分别于22℃自然光和30℃自然光条件下配制处方溶液并放置20小时，考察处方溶液的性状(溶液澄清度与颜色)、pH值、有关物质的变化。

表18.EK1处方溶液的稳定性考察结果

结果表明：本品处方溶液于22℃自然光与30℃自然光条件下配制并放置20小时，检测结果与0小时一致，表明本品处方溶液配制与放置温度在不高于30℃自然光条件下20小时内稳定，配液及灌装过程中不需要加氮气等措施进行保护。

2.滤材选择(滤膜吸附试验)及小试制剂制备

检验一定温度(22±4℃)条件下，模拟了药物实际过滤生产中最大过滤量的情况下，0.22微米亲水性聚醚砜膜(PES)及0.22微米亲水性聚偏氟乙烯膜(PVDF)对产品EK1的吸附能力，选择合适滤膜。

依据产品的设计大生产的规模(4万瓶)，实验按照47mm膜片的规格等比例缩小过滤工艺的流程工艺参数。配制EK1处方溶液500ml进行考察，按表19设计取样，并分别测定各取样点其相对于过滤前各自的含量。

表19.滤膜吸附取样表

药液配制(500ml)：称取7.5gEK1、20.0g甘露醇和1.38g磷酸二氢钠，加400ml注射用水，缓慢搅拌使溶解，用0.5mol/L氢氧化钠溶液调pH值至8.0±0.1，加入100ml注射用水(扣除0.5mol/L氢氧化钠溶液使用量)，混匀即得；

药液过滤：①取配制的500ml药液，用0.22μm PES膜(两张，科百特)按上表过滤体积过滤。按表19取样点和取样量取样考察滤膜吸附。取样后的剩余滤液混匀分装于2ml中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，1.0ml/瓶，加注射用冷冻干燥无菌粉末用氯化丁基橡胶塞半压塞，按表20冻干曲线进行冷冻干燥，全压塞，加抗生素瓶用铝塑组合盖轧盖，即得小试制剂(批号：200508，小试批理论处方溶液体积为400ml)。②取配制的500ml药液，用0.22μm PVDF膜(两张，科百特)按滤膜吸附取样表过滤，按滤膜吸附取样表取样点和取样量取样考察含量。

表20.小试制剂的冻干曲线

分别精密量取各取样点溶液1ml，分置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度摇匀，即得各供试品溶液。参照实施例1处方筛选中有关物质检测条件，取A₀(连续5针)、A₁～A₁₀各1针、A₀(系统回校)注入液相色谱仪。

滤膜吸附试验结果：

表21.滤膜吸附试验测定结果

结果表明：本品采用0.22μm亲水性聚醚砜膜(PES)及0.22μm亲水性聚偏三氟乙烯膜(PVDF)过滤对产品EK1基本无吸附，可选择0.22μm亲水性聚醚砜膜(PES)为本品过滤材质。

3.共晶点测试

取滤膜吸附试验中PVDF滤后剩余处方溶液适量，作为供试品溶液。采用共晶点测试仪，进行共晶点测试。结果如下：

表22.共晶点测试结果

经测试可知，本品共晶点为-16.7℃。冻干曲线一次升华干燥温度设置合理，小试制备的冻干产品合格。

本品为无菌冻干粉，生产工艺过程主要包括药液配制、除菌过滤、无菌灌装、半压塞、冷冻干燥及轧盖。我们采用冻干粉针基本相同的工艺，同时对处方溶液配制条件及溶液稳定性进行了考察，确定生产过程中处方溶液稳定；对滤膜材质进行了考察，结果表明本品采用亲水性聚醚砜膜(PES)及亲水性聚偏氟乙烯膜(PVDF)过滤对产品均无吸附，选择了亲水性聚醚砜膜(PES)为本品过滤材质；完成了一批小试制剂制备，确定了小试冻干工艺，中试生产冻干根据实际生产，参数略有调整，但基本与小试一致。

实施例3：EK1注射剂的药代动力学实验

1.EK1静脉给予SD大鼠的药代动力学实验

1.1实验方法

选用SD大鼠48只，静脉组给药剂量为2.5mg/kg，单次静脉推注给EK1/EK1冻干粉注射剂(均用生理盐水溶解)，采集血样。

1.2实验结果

单次静脉推注给予EK1制剂后，动物血浆中EK1的主要代谢动力学参数见下表：

结论：对大鼠进行药代动力学分析，EK1/EK1冻干粉注射剂在大鼠体内，各项药代动力学指标接近。

2.EK1静脉给予Beagle犬的药代动力学试验

2.1实验方法

选用Beagle犬24只，静脉组给药剂量为1mg/kg，单次静脉推注给EK1/EK1冻干粉注射剂(均用生理盐水溶解)，采集血样。

2.2实验结果

单次静脉推注给予EK1制剂后，动物血浆中EK1的主要代谢动力学参数见下表：

结论：对Beagle犬进行药代动力学分析，EK1/EK1冻干粉注射剂在Beagle犬体内，各项药代动力学指标接近。