阅读说明：本技术 一种美登木素衍生物及其合成方法和应用 (Maytansinoid derivative and synthetic method and application thereof ) 是由 沈月毛 鲁春华 李小曼 于 2020-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种美登木素衍生物及其合成方法和应用。本发明构建了包含丙氨酰化酶基因astC的整合型表达载体pSBT11-astC,并实现了丙氨酰化酶基因在珍贵橙色束丝放线菌突变株中的异源表达。从表达有丙氨酰化酶的珍贵橙色束丝放线菌突变株的粗提物分离纯化一个丙氨酰化后修饰的美登木素衍生物。体外抗肿瘤活性试验表明,该化合物对人宫颈癌细胞(HeLa)、人结肠癌细胞(HCT116)和人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的IC<Sub>50</Sub>值分别为3.1、9.4和10.4nM,因此可用于制备抗肿瘤药物,可与不同的抗体和连接子组成制抗体偶联物。(The invention relates to a maytansinoid derivative, a synthetic method and application thereof. The invention constructs an integrated expression vector pSBT11-astC containing an alanylase gene astC and realizes the heterologous expression of the alanylase gene in a precious orange actinosynnema mutant strain. Isolation from crude extract of rare Actinobacillus aurantiaca mutant strain expressing alanylasePurifying a post-alanoylation modified maytansinoid derivative. In vitro antitumor activity test shows that the compound has IC of human cervical cancer cell (HeLa), human colon cancer cell (HCT116) and human breast cancer cell (MDA-MB-231) 50 The values are 3.1, 9.4 and 10.4nM respectively, so the antibody conjugate can be used for preparing anti-tumor drugs and can be combined with different antibodies and linkers to prepare antibody conjugates.)

一种美登木素衍生物及其合成方法和应用

技术领域

本发明提供一种具有肿瘤抑制活性的美登木素衍生物，具体涉及美登木素衍生物及其制备方法和应用，属于天然药物化学与医药应用技术领域。

背景技术

美登木素属于安莎类大环内酰胺，根据其来源可分为植物美登木素和细菌美登木素两大类，都有极强的抗菌和抗肿瘤活性。研究发现美登木素衍生物可以结合微管蛋白β亚基，阻止微管束聚集形成，破坏有丝***过程，从而抑制肿瘤细胞生长。由于存在神经毒性，美登木素衍生物不能直接用于临床，但可以作为“弹头”与特异免疫蛋白偶联发挥抗癌作用。2013年，首个针对实体瘤的抗体偶联物药物ado-trastuzumab entansine(商品名Kadcyla)被FDA批准用于治疗HER2阳性乳腺癌，美登木素抗体偶联物药物的研发再次引起了广泛关注。

与植物美登木素相比，细菌美登木素的产量高、制备流程简单，可以为美登木素抗体偶联物药物的生产提供价格低廉的原料。然而，细菌美登木素(即安丝菌素)原始结构中并没有合适的、与连接子进行偶联的位点，需要通过还原反应脱去C-3位酯基，然后再选择性丙氨酰化。该方法不但成本高、产率低，还有不易分离除去的副产物，严重阻碍美登木素抗体偶联物药物的研究、生产和临床应用。

本发明的目标是通过生物合成高效制备具有偶联位点的丙氨酰化美登木素衍生物，将可能极大加快美登木素抗体偶联物药物的研发进程，因此对于发现广谱高效且具有自主知识产权的新型抗肿瘤药物具有重要意义。

发明内容

对美登木素衍生物抗肿瘤构效关系的研究发现，C-3位酯基侧链对其抗肿瘤活性起关键作用(Chem Pharm Bull 2004,52,1-26)，用于制备美登木素抗体偶联物的是C-3位含有二硫键或巯基的丙氨酰美登醇衍生物。虽然放线菌中美登木素衍生物的产量较高，但无法产生C-3位为丙氨酰基的化合物。

针对现有技术的不足，本发明提供一种美登木素衍生物，该化合物由放线菌产生、在结构中具有C-3位丙氨酰基。本发明还提供美登木素衍生物的合成方法和应用。

一、美登木素衍生物

一种美登木素衍生物，其化学结构如下所示：

二、美登木素衍生物的合成方法

本发明所述美登木素衍生物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用YMG培养基对表达有丙氨酰化酶的珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnemapretiosum ssp.autantium ATCC 31565)的突变株HGF052+pJTU824-asm18+pSBT11-astC进行15L固体发酵，28-30℃培养7-10天；

(2)将培养物切成小块，室温下用体积比80:20的乙酸乙酯/甲醇浸泡提取三次，合并提取液，减压及38-40℃的温度下浓缩至干，得粗提物；

(3)用水溶解粗提物，使用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相减压及38-40℃的温度下浓缩至干得EA提取物；

(4)EA提取物溶于甲醇，再经石油醚多次萃取，甲醇相减压及38-40℃的温度下浓缩至干得甲醇提取物；

(5)甲醇提取物依次经反相硅胶柱层析分离，凝胶柱层析分离，薄层层析和制备型HPLC分离将组分相同的洗脱液进行合并得到美登木素衍生物。

根据本发明优选的，

上述制备方法步骤(1)中，对表达有丙氨酰化酶的珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum ssp.autantium ATCC 31565)的突变株HGF052+pJTU824-asm18+pSBT11-astC进行固体发酵，28℃培养10天。

上述制备方法步骤(4)中，所述提取采用的甲醇为95％甲醇。

上述制备方法步骤(5)中，所述反相硅胶柱、制备型HPLC柱填料为C-18、凝胶柱型号为Sephadex LH-20。

上述制备方法步骤(5)中，对甲醇提取物进行分离的步骤为：

甲醇提取物首先经反相硅胶柱层析分离，分别用水，30％，50％，70％，100％甲醇依次洗脱，每个组分洗脱1L，200mL/份接收，TLC检测，用CH₂Cl₂：MeOH＝10:1v/v展开，碘化铋钾显色，合并70％洗脱组分；继续用凝胶柱层析分离，甲醇洗脱，5mL/管,合并25-29管；继续用制备型HPLC分离，流动相为体积百分比38％乙腈，收集目标峰，得到美登木素衍生物1。

上述制备方法步骤(1)中，所述表达有丙氨酰化酶的珍贵橙色束丝放线菌突变株HGF052+pJTU824-asm18+pSBT11-astC的制备方法按如下步骤所述：

(a)将丙氨酰化酶基因astC的开放阅读框***到质粒pSBT11上的Ned I和EcoR I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于ermE*启动子的下游并受其调控；

(b)用整合型表达载体pSBT11-astC转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002，获得大肠杆菌-放线菌接合转移供体菌ET12567/pUZ8002/pSBT11-astC；

(c)将ET12567/pUZ8002/pSBT11-astC与HGF052+pJTU824-asm18的菌丝体进行接合转移，获得表达有丙氨酰化酶的突变株HGF052+pJTU824-asm18+pSBT11-astC。

步骤(a)所述的丙氨酰化酶基因astC基因库登记号KF813023.1。

步骤(b)所述的HGF052+pJTU824-asm18菌株来自文献(Appl MicrobiolBiotechnol 2016，100，2641-2649)。

三、美登木素衍生物的应用

经药理试验研究表明，该化合物对人***细胞(HeLa)、人结肠癌细胞(HCT116)和人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)显示了明显的细胞毒活性，IC₅₀值分别为3.1、9.4和10.4nM，本发明还提供美登木素衍生物的制药用途，可用于制备抗肿瘤药物。优选的，所述的肿瘤为***、结肠癌或乳腺癌。

一种抗肿瘤的药物组合物，包括本发明的美登木素衍生物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

有益效果：

本发明通过生物合成方法得到的肿瘤抑制活性的美登木素衍生物，避免了传统的化学合成方法带来的原料浪费和难以去除的副产物。本发明构建了包含丙氨酰化酶基因astC的整合型表达载体pSBT11-astC，并实现了丙氨酰化酶基因在珍贵橙色束丝放线菌突变株中的异源表达。从表达有丙氨酰化酶的珍贵橙色束丝放线菌突变株的粗提物分离纯化一个丙氨酰化后修饰的美登木素衍生物。体外抗肿瘤活性试验表明，该化合物对人***细胞(HeLa))、人结肠癌细胞(HCT116)和人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的IC50值分别为3.1、

9.4和10.4nM，因此可用于制备抗肿瘤药物，可与不同的抗体和连接子组成制抗体偶联物。

具体实施方式

以下实验例仅用于说明本发明的技术效果，但所述的实验例不用于限制本发明。

在如下的实施例中所指的美登木素衍生物1的化学结构式(结构式中的***数字是化学结构中碳原子的标位)：

实施例1：所述化合物1的生物合成和制备

1.构建表达有丙氨酰化酶的突变株

1)构建表达载体

扩增丙氨酰化酶基因astC(Genbank accession No.KF813023.1)的DNA片段，***到质粒pSBT11的Ned I和EcoR I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于ermE*启动子的下游并受其调控，得到整合型表达载体pSBT11-astC。

2)构建突变株

用pSBT11-astC转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002，获得大肠杆菌-放线菌接合转移供体菌ET12567/pUZ8002/pSBT11-astC。将ET12567/pUZ8002/pSBT11-astC与珍贵橙色束丝放线菌ATCC 31565的突变株HGF052+pJTU824-asm18的菌丝体进行接合转移，获得表达有丙氨酰化酶的突变株HGF052+pJTU824-asm18+pSBT11-astC。

2.化合物1的制备

1)用YMG培养基对珍贵橙色束丝放线菌突变株HGF052+pJTU824-asm18+pSBT11-astC进行固体发酵(15L)，28℃培养10天。

2)培养物切成小块后室温用乙酸乙酯/甲醇(80:20)混合溶剂浸泡提取三次，合并提取液，减压及38-40℃的温度下浓缩至干，得粗提物。

3)粗提物溶于水，用乙酸乙酯多次萃取，乙酸乙酯相减压及38-40℃的温度下浓缩至干得EA提取物(3.3g)。

4)EA提取物溶于95％甲醇，再经石油醚多次萃取，甲醇相减压及38-40℃的温度下浓缩至干得甲醇提取物(2.9g)。

5)甲醇提取物首先经反相硅胶柱层析(RP-18，180g柱)分离，分别用水，30％，50％，70％，100％甲醇依次洗脱，每个组分洗脱1L，200mL/份接收，TLC检测，用CH₂Cl₂：MeOH＝10:1展开，碘化铋钾显色，合并70％洗脱组分；继续用凝胶(Sephadex LH-20)柱层析分离，甲醇洗脱，5mL/管,合并25-29管(39.7mg)。继续用制备型HPLC分离，流动相为38％乙腈，收集目标峰，得到化合物1(5.5mg)。

3.化合物的结构鉴定

ESI-MS测得化合物1的准分子离子峰为m/z 648.27[M+H]⁺。¹H和¹³C NMR显示，化合物1共含有32个碳原子(表1)，包括5个甲基，2个甲氧基，3个亚甲基，11个次甲基和11个季碳。根据HMQC和HMBC的信号，确定了该化合物为美登木素衍生物。根据C-3位质子与C-1’的远程相关关系，确定了丙氨酰基的取代位置是在C-3位的O上，对全部的NMR光谱数据进行指定，确定为一新化合物。

表1、化合物1的核磁共振数据

实施例2：所述化合物1的体外抗肿瘤活性试验

安丝菌素AP-3*：购自MCE(MedChemExpress)。

细胞株：人***细胞(HeLa))、人结肠癌细胞(HCT116)和人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)购自中科院上海细胞库。

试验方法：采用硫酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)蛋白染色法测定细胞生长抑制率。具体为：

1)将肿瘤细胞培养至对数生长期，胰酶消化，用DMEM培养基调整细胞密度至3-7万个/mL。在96孔板中，每孔加入100μL细胞，置于37℃、5.0％CO₂培养过夜。用DMEM培养基将化合物浓度稀释至2倍检测浓度，取100μL加入96孔板，继续培养72h。

2)小心吸干培养基，缓慢加入预冷的10％TCA溶液100μL，4℃静置1h以上。弃去TCA固定液，用流水冲洗五次，用吸水纸吸干水分。

3)加入100μL SRB染色液，孵育30min。弃去SRB染色液，用1％的冰醋酸冲洗五遍，去除游离的SRB染料。室温空干，加入100μL Tris溶液(10mM，pH 10.0)，过夜溶解SRB染料。

4)使用酶标仪在波长570nm下测定给药孔和空白孔OD值。细胞生长抑制率＝(1－用药组平均OD值/对照组孔OD值)×100％。

试验结果的评判与解释：细胞半数生长抑制时的药物浓度IC₅₀按照量效数据进行换算。每个实验重复三次，吸收值差异小于5％，IC₅₀差异小于30％。以IC₅₀≤100nM为有效标准。

试验结果：结果如表2所示，本发明美登木素衍生物1对人***细胞(HeLa))、人结肠癌细胞(HCT116)和人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)显示了明显的细胞毒活性，其IC₅₀值分别为3.1、9.4和10.4nM。

试验结论：通过药理学试验，可以看出化合物1对人***细胞(HeLa)、人结肠癌细胞(HCT116)和人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)显示了明显的细胞毒活性。因此，本发明的化合物可用于制备抗肿瘤药物，可与其他药物制成抗肿瘤药物组合物，还可以与不同的抗体和连接子偶联制成抗体偶联物。

表2、化合物1对3株肿瘤细胞的细胞毒试验结果(IC₅₀,nM)

*阳性对照药