阅读说明：本技术 一种新生物碱及其在制备抗幽门螺杆菌药物中的用途 (Novel alkaloid and application thereof in preparation of anti-helicobacter pylori medicines ) 是由 王川海 于 2020-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种新生物碱及其在制备抗幽门螺杆菌药物中的用途,所述化合物的结构式为：<Image he="761" wi="700" file="DDA0002554653690000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>所述化合物具有明显的抑制幽门螺杆菌的作用,可以用于制备抑制幽门螺杆菌的药物。(The invention discloses a new alkaloid and application thereof in preparing anti-helicobacter pylori medicaments, wherein the structural formula of the compound is as follows: the compound has obvious effect of inhibiting helicobacter pylori, and can be used for preparing a medicament for inhibiting the helicobacter pylori.)

一种新生物碱及其在制备抗幽门螺杆菌药物中的用途

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及一种新生物碱及其在制备抗幽门螺杆菌药物中的用途。

背景技术

幽门螺杆菌简称为Hp，属于临床常见革兰氏阴性微需氧细菌，多生存于个体患者胃、十二指肠等区域，感染幽门螺旋杆菌可诱发生慢性感染性疾病，胃溃疡、胃炎以及十二指肠疾病的发生与幽门螺旋杆菌具有密切的关系。目前临床根除幽门螺旋杆菌感染对促进个体患者胃肠功能的恢复，促进胃肠溃疡面愈合，降低胃癌发生率具有重要的意义。临床应用最广泛的手段为使用含质子泵抑制剂和2种抗生素的三联疗法，其中常用抗生素包括甲硝唑、阿奇霉素、克拉霉素、阿莫西林、四环素、呋喃唑酮以及左氧氟沙星，但随着抗生素的广泛使用，幽门螺旋杆菌对抗生素产生耐药性明显增高，幽门螺旋杆菌根除率日趋下降。因此，从中药中寻找新的抑制幽门螺杆菌的有效物质具有十分重要的意义。

黄连汤始载于《伤寒论》(汉·张仲景)，由黄连、甘草、干姜、桂枝、人参、半夏及大枣组成，具有平调寒热，和胃降逆的功效，主治胸中有热，胃中有邪气，腹中痛，欲呕吐者。临床上主要用于治疗急慢性胃肠炎、消化性溃疡等病症。作为经典名方收载于国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录(第一批)》中。

黄连汤作为历代医家临床上用于治疗胃肠炎等消化系统疾病的常用方剂，在临床使用过程中疗效确切，但存在药效成分不明确、作用机制不明确，无效成分过多，一次服用剂量过大，患者依从性差等一系列制约其临床应用及开发的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是从黄连汤中筛选出一种新生物碱，并将其开发为抑制幽门螺杆菌的药物制剂。

本发明所述的新生物碱的制备方法，包括如下步骤：

(1)取如下重量份的原料：黄连三份、炙甘草三份、干姜三份、桂枝三份、人参二份，半夏半份，大枣二份，加水煎煮，滤过；

(2)所得滤液浓缩至相对密度为1.1g/cm³，加盐酸调节pH值为2～3，再用等体积二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷液，回收二氯甲烷，得浸膏；

(3)所得浸膏用水分散，通过HPD200A大孔吸附树脂纯化，先用水洗脱，弃去水液，继用40％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇后，经硅胶柱柱色谱进行进一步分离，先用二氯甲烷洗脱，弃去洗脱液，再用二氯甲烷-甲醇(体积比5:1)洗脱，收集洗脱液，回收有机溶剂，获得目标化合物粗品；

(4)所得目标化合物粗品，再经制备液相分离，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为体积比50:50的甲醇:水，紫外检测器，检测波长为245nm，收集保留时间为98-102分钟的色谱峰洗脱液，回收溶剂，即得目标化合物。

本发明所述新生物碱的应用为用于制备抑制幽门螺杆菌的药物。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但其并不限制本发明的实施。

实施例1

新生物碱对幽门螺杆菌的抑制作用

1材料和方法

1.1菌株：幽门螺杆菌菌株ATCC 43504购自美国American Type culturecollection。

1.2试剂：哥伦比亚琼脂(OXOID)

脑心浸液琼脂(BHI-agar，美国BD公司)

二甲基亚砜(天津市富宇精细化工有限公司)

1.3试药：

(1)甲硝唑(100191-201808，中国食品药品检定研究院)

(2)黄连汤：取黄连300g、炙甘草300g、干姜300g、桂枝300g、人参200g，半夏50g，大枣200g，加药材重量8倍量水煎煮2小时，滤过，药渣继续加药材重量6倍量水煎煮1小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至浸膏，70℃减压干燥至固体，粉碎，即得。

(3)本发明所述新生物碱。

1.4检测方法

用琼脂稀释法检测不同试药对幽门螺杆菌菌株ATCC 43504的最小抑菌浓度(MIC)。

(1)培养基的配置：选择哥伦比亚琼脂培养基，应用二甲基亚砜溶解试药，按照倍比稀释的方法分别配制含不同药物浓度的培养基，使培养基中的药物浓度分别为512，256，128……0.008μg/ml。

(2)菌株接种和培养：在菌株复苏传代至第三代后，取新鲜培养的幽门螺杆菌菌株，用脑心浸液(BHI)稀释至3×10⁸cfu/ml，用微量加样枪分别吸取2μl的菌悬液点样接种于含药琼脂，以无试药且含二甲基亚砜琼脂作为空白对照，接种后将平皿置于37℃微需氧(5％O₂、10％CO₂、85％N₂)条件下培养72小时。

(3)结果：以不出现菌落的琼脂平板上的最低药物浓度为该试药的MIC。

试药	MIC(μg/ml)
		甲硝唑	16
黄连汤	16
		本发明所述新生物碱	0.016

由以上结果可知，黄连汤对幽门螺杆菌有很强的抑制作用，MIC与甲硝唑相当，本发明所述新化合物的最小抑制浓度是甲硝唑的1/1000，其抑菌作用远强于甲硝唑，为感染幽门螺杆菌的患者，提供了一种新的治疗办法，尤其对于已经产生耐药性的患者，对其进行进一步开发具有十分重要的意义。

实施例2

(1)取黄连3kg、炙甘草3kg、干姜3kg、桂枝3kg、人参2kg，半夏0.5kg，大枣2kg，加药材重量8倍量水煎煮2小时，滤过，药渣继续加药材重量6倍量水煎煮1小时，滤过，合并滤液；

(2)所得滤液浓缩至相对密度为1.1g/cm³，加盐酸调节pH值为2，再用等体积二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷液，回收二氯甲烷，得浸膏；

(3)所得浸膏用水分散，加在HPD200A型大孔吸附树脂柱(柱高50cm，内径10cm)上，用水20L洗脱，弃去水液，继用40％乙醇10L洗脱，弃去洗脱液，再用70％乙醇20L洗脱，收集洗脱液，回收乙醇后，经硅胶柱色谱(柱层析硅胶200-300目1kg，干法上样)进行进一步分离，先用二氯甲烷5L洗脱，弃去洗脱液，再用二氯甲烷-甲醇(5:1)10L洗脱，收集洗脱液，回收有机溶剂，获得目标化合物粗品；

(4)所得目标化合物粗品，再经制备液相分离，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，填充剂粒径为10μm，色谱柱规格(内径×长度为20mm×250mm)，以甲醇:水(50:50)为流动相，紫外检测器，检测波长为245nm，收集保留时间为98-102分钟的色谱峰洗脱液，回收溶剂，即得目标化合物。

实施例3

本发明中所述的化合物的结构确证

白色无定型粉末，微溶于甲醇。高分辨质谱得到m/z 458.2656[M+H]⁺(计算值458.2655)的分子离子峰，再结合¹HNMR谱图和¹³C NMR谱图数据推测化合物的分子式为C₂₅H₃₅N₃O₅。通过HSQC及HMBC谱，结合¹H NMR和¹³C NMR谱所给出的信息，对本发明所述新化合物的碳氢信息进行了归属，如表1所示。在HMBC谱图中，δH 5.63(H-3)和δC 157.8(C-1)、δC68.4(C-4)、δC 169.5(C-5)、δC 32.2(C-17)、δC 46.4(C-18)相关，δH 4.14(H-7)和δC169.5(C-5)、δC 169.2(C-8)、δC23.6(C-27)相关，δH 7.54(H-9)和δC 52.5(C-7)、δC 47.3(C-10)、δC 70.7(C-11)相关，δH 6.85(H-13)和δC 157.8(C-1)、δC 70.7(C-11)、δC 134.5(C-12)、δC 126.7(C-14)、δC 113.7(C-15)相关，δH 4.35(H-4)和δC 165.8(C-20)相关，δH6.35(H-22)和δC 165.8(C-20)、δC 119.0(C-21)、δC 30.7(C-23)、δC 21.2(C-24)、δC21.1(C-25)相关，确定了各结构片段的连接方式。综上信息，确定本发明所述的新化合物的化学结构为：

表1 ¹H(600MHz)and ¹³C(150MHz)NMR Spectroscopic Data in DMSO-d₆(δinppm,Jin Hz).