具体实施方式

使用细胞培养方法制造治疗性生物学药物具有传播病毒污染物的固有风险。这些污染物可以来自多种来源，包括起始材料、在制造期间使用动物来源的试剂和通过由于GMP过程中的故障对制造系统造成的污染。因而，监管机构推荐生物制造过程有专门的病毒灭活和病毒去除步骤，并要求制造商验证所有生物产品中病毒的去除和灭活。

本文提供了用于在已知或怀疑含有至少一种有包膜病毒的流体中灭活有包膜病毒的方法，所述方法包括获得已知或怀疑含有至少一种有包膜病毒的流体；将所述流体暴露于表1中的洗涤剂中；暴露浓度和时间足以导致病毒灭活。

本文提供了用于在纯化目的重组蛋白期间灭活有包膜病毒的方法，所述方法包括获得含有所述目的重组蛋白的已知或怀疑含有至少一种病毒的流体；使所述流体以足以导致在所述流体中的有包膜病毒灭活的浓度和时间经受至少一种洗涤剂，其中所述洗涤剂具有以下CAS登记号：CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5、CAS 85618-20-8、CAS181135-58-0、CAS 181135-57-9、CAS 250692-65-0、CAS 228579-27-9、CAS 349477-49-2、CAS 70504-28-8、CAS 59080-45-4、CAS 69984-73-2、CAS 148616-91-5、CAS 148565-55-3、CAS 69227-93-6、CAS 82494-09-5、CAS 253678-67-0、CAS 106402-05-5或CAS 93911-12-7；并且使经病毒灭活的流体经受至少一个单元操作，所述单元操作包括至少过滤步骤或色谱步骤。

病毒分为有包膜病毒和无包膜病毒。有包膜病毒具有一个被脂蛋白膜或“包膜”封闭的衣壳。这种包膜由宿主细胞蛋白和磷脂以及当病毒从宿主细胞中出芽时覆盖在病毒表面的病毒糖蛋白构成。这种包膜允许病毒识别、结合、进入和感染目标宿主细胞。然而，由于这种膜，有包膜病毒对灭活方法敏感，而无包膜病毒较难在对制造的蛋白质无风险的情况下灭活但它们可以通过过滤方法除去。

有包膜病毒包括如下的病毒科，如疱疹病毒科病毒(herpesviridae virus)、痘病毒科病毒(poxviridae virus)、嗜肝DNA病毒科病毒(hepadnaviridae virus)、黄病毒科病毒(flaviviridae virus)、披膜病毒科病毒(togaviridae virus)、冠状病毒科病毒(coronaviridae virus)、正粘病毒科病毒(orthomyxoviridae virus)、丁型肝炎病毒科病毒(deltavirus virus)、副粘液病毒科病毒(paramyxoviridae virus)、弹状病毒科病毒(rhabdoviridae virus)、布尼亚病毒科病毒(bunyaviridae virus)、丝状病毒科病毒(filoviridae virus)、逆转录病毒科病毒(retroviridae virus)；以及如下病毒，如人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus)、辛德毕斯病毒(sindbis virus)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)、假狂犬病病毒(pseudorabies virus)、仙台病毒(sendaivirus)、水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)、西尼罗河病毒(West Nilevirus)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus)、冠状病毒、马关节炎病毒(equine arthritis virus)、重症急性呼吸系统综合征病毒(severe acute respiratorysyndrome virus)、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)以及牛痘病毒(vaccinia virus)。

为了确保患者安全，在制造蛋白治疗剂时，病毒灭活是纯化过程的必要组成部分。可以使用各种方法来灭活病毒并且这些方法包括热灭活/巴氏消毒法，pH灭活，UV和γ射线照射，使用高强度广谱白光，添加化学灭活剂、表面活性剂、和溶剂/洗涤剂处理。表面活性剂(诸如洗涤剂)能溶解多种膜，并且因此在特异性灭活有包膜病毒方面可能非常有效。

洗涤剂通过用洗涤剂胶束破坏蛋白质层溶解有包膜病毒的外膜(Kragh-Hansen等人,Biophysical Journal[生物物理学杂志]1998,75(6),2932-2946)。有包膜病毒(包括异嗜性鼠白血病病毒(xMuLV)和假狂犬病疱疹病毒(PRV))的外层由脂质膜构成，所述脂质膜可以被超过其临界胶束浓度(CMC)的某些洗涤剂破坏。超过CMC时，洗涤剂形成胶束，所述胶束通过溶解膜脂破坏包膜层(Edwards和Almgren,Journal of Colloid and InterfaceScience[胶体与界面科学杂志]1991,147(1),1-21)。

洗涤剂按其电荷可分为三类：离子型、非离子型和两性离子型。非离子型和两性离子型洗涤剂都是温和的，并且通常不会使正在制造的治疗性蛋白质变性，而更严苛的离子型洗涤剂则会使它们降解。历史上，诸如常用的Triton X-100等的非离子型洗涤剂已经被用来灭活病毒，因为它们不影响治疗性目的蛋白。然而，对某些洗涤剂(诸如Triton X-100)的过度使用的生态担忧已经驱使为鉴定更多可用于生物制造过程中灭活有包膜病毒的“生态友好”的洗涤剂而进行的搜寻。

如本文所用，“病毒灭活”、“病毒的灭活”、“灭活病毒”或类似的此类短语是指对有包膜病毒进行修饰以使其不再感染细胞、不再复制和/或不再增殖的过程。表面活性剂(诸如洗涤剂)在灭活已知含有或怀疑含有一种或多种病毒的流体中的有包膜病毒中非常有效。所述流体可以获得自流出物流、洗脱液、汇集物、贮存或储存容器。在一个实施例中，所述流体获得自汇集物。在一个实施例中，所述汇集物获得自包括微滤的收获单元操作。在一个实施例中，所述流体获得自流出物流。

可以将浓度(w/v)在0.01％和10％之间的或在所述洗涤剂临界胶束浓度(CMC)值的0.01倍至10倍之间的洗涤剂添加到所述流体中。在某些实施例中，所述洗涤剂浓度是所述洗涤剂CMC值的至少2.5倍、至少5倍、至少7.5倍或至少10倍。

在至少2℃至22℃或更高的温度下，可以将所述流体暴露于所述洗涤剂。在某些实施例中，在至少2℃或更高、至少5℃或更高、至少7℃或更高、至少10℃或更高、至少15℃或更高、至少20℃或更高，或至少22℃或更高的温度下，将所述流体暴露于所述洗涤剂。在某些实施例中，所述温度是2℃至22℃、2℃至20℃、2℃至15℃、2℃至10℃、2℃至7℃或2℃至5℃。在另一个实施例中，所述温度是5℃至22℃、5℃至20℃、5℃至15℃、5℃至10℃或5℃至7℃。在另一个实施例中，所述温度是7℃至22℃、7℃至20℃、7℃至15℃或7℃至10℃。在另一个实施例中，所述温度是10℃至22℃、10℃至20℃或10℃至15℃。在另一个实施例中，所述温度是10℃至22℃、10℃至20℃或10℃至15℃。在另一个实施例中，所述温度是15℃至22℃或15℃至20℃。在一个实施例中，所述温度是20℃至22℃。在某些实施例中，所述温度是2℃、5℃、7℃、10℃、15℃、20℃或22℃。可将所述流体暴露于所述洗涤剂少至30秒至48小时或更久。在某些实施例中，将所述流体暴露于所述洗涤剂至少10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟或90分钟。在某些实施例中，将所述流体暴露于所述洗涤剂2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、9小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、30小时、36小时、42小时或48小时。在某些实施例中，将所述流体暴露于所述洗涤剂至少30秒、至少10分钟、至少30分钟、至少60分钟或至少90分钟。在某些实施例中，所述浓度为其CMC的2.5倍且时间为至少10分钟。在某些实施例中，所述浓度为其CMC的2.5倍且时间为至少30分钟。在某些实施例中，所述浓度为其CMC的5倍且时间为至少10分钟。在某些实施例中，所述浓度为其CMC的5倍且时间为至少30分钟。

期望使用本文披露的方法进行任何程度的病毒灭活。然而，优选达到必要的病毒灭活的程度，以满足相关监管机构制定的任何生物制药安全指南或法规。

为了确定诸如本文所述洗涤剂的试剂灭活病毒的程度或效果，一种方法是监测其对致细胞病变效应(CPE)的影响。致细胞病变效应包括由于病毒感染导致的宿主细胞内结构变化，诸如宿主细胞裂解，或由于影响了宿主细胞分裂的病毒改变导致细胞无裂解死亡。如果在暴露于所述试剂后，在宿主细胞中不能检测到这种效应，则认为所述病毒被灭活。这可以使用TCID₅₀测定来测量，所述TCID₅₀测定用于确定在合理的时间段(例如5至20天)，在细胞培养物中可引起致细胞病变效应同时培养物中的细胞依然存活的病毒的感染滴度。如果存在活性病毒，可以使用显微镜观察对细胞的致细胞病变效应。被感染的细胞出现变形，并且与未感染的细胞不同。用斯皮尔曼-卡尔伯(Spearman-Karber)方程分析结果，所述方程提供每个样品中的病毒滴度，然后这些滴度可用于计算病毒的总对数减小。如果在所用检测方法的限度内未检测到，通常约为4log10，则认为灭活已完成。

如本文所述，对具有广泛结构可变性、疏水性和电荷的洗涤剂的灭活有包膜病毒的有效性进行了评估。鉴定了具有强健病毒灭活能力的洗涤剂。这些包括非离子型洗涤剂，如ANAPOE-C12E9；ANAPOE-C12E8；Alfonic TDA-6乙氧基化物(TDA-6)；Alfonic TDA-9乙氧基化物(TDA-9)；正庚基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷；正辛基-β-D-硫代吡喃麦芽糖苷；蔗糖单月桂酸酯；正癸酰基蔗糖；正辛基-β-D-硫代葡萄糖苷；正十三烷基-β-D-麦芽糖苷；六乙二醇单辛基醚；正十一烷基-b-D-麦芽糖苷；正壬基-b-D-硫代麦芽糖苷；ANAPOE-X-405；Thesit；正壬基-b-D-麦芽糖苷；MEGA-8；正壬基-b-D-葡萄糖苷；正辛基-b-D-葡萄糖苷；MEGA-10；正十二烷基-b-D-麦芽糖苷；C8E5；MEGA-9；正己基-b-D-吡喃葡萄糖苷；2,6-二甲基-4-庚基-b-D-吡喃麦芽糖苷；正癸基-b-D-麦芽糖苷；和C8E4。两性离子型洗涤剂，包括NDSB-195；NDSB-201；CHAPS；NDSB-211；CHAPSO；NDSB-221；NDSB-256；Tripao和DDMAB。合成脂质洗涤剂包括LysoFos^TM胆碱12，LysoFos^TM胆碱14，Alfonic TDA-6乙氧基化物(Novel-TDA6，IsoC13E6)和Alfonic TDA-9乙氧基化物(Novel-TDA9，Iso-C13E9)。

根据欧盟关于化学安全的指令67/548/EC，在对几种有包膜病毒的病毒灭活呈阳性的那些洗涤剂中，有一些目前被认为不危险；ANAPOE-C12E9 CAS号：3055-99-0；ANAPOE-C12E8 CAS号：3055-98-9；Alfonic TDA-6乙氧基化物(TDA-6)CAS号：9043-30-5；AlfonicTDA-9乙氧基化物(TDA-9)，CAS号9043-30-5；N-庚基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷CAS号：85618-20-8；CAS号：181135-58-0；CAS号：181135-57-9；CAS号：250692-65-0；CAS号：228579-27-9；CAS号：349477-49-2；FosCAS号：70504-28-8；正己基-b-D-吡喃葡萄糖苷CAS号：59080-45-4；正壬基-b-D-葡萄糖苷CAS号：69984-73-2；正辛基-β-D-硫代吡喃麦芽糖苷CAS号：148616-91-5；正壬基-b-D-硫代麦芽糖苷CAS号：148565-55-3；正十二烷基-b-D-麦芽糖苷CAS号：69227-93-6；正癸基-b-D-麦芽糖苷CAS号：82494-09-5；正十一烷基-b-D-麦芽糖苷CAS号：253678-67-0；正壬基-b-D-硫代麦芽糖苷CAS号：106402-05-5；正十三烷基-β-D-麦芽糖苷CAS号：93911-12-7；和正辛基-b-D-葡萄糖苷CAS号：29836-26-8。

基于相似的分子结构，选择了这些“生态友好”的洗涤剂中的四组并标记为“CYMAL”、“Fos-Choline”、“Anapoe”和“硫代葡萄糖苷”，图1。基于包括温度、时间、浓度、产品形式、和病毒类型以及洗涤剂的毒性和强健清除率在内的参数，进一步分析了这些组中的每组的洗涤剂的病毒灭活情况。

基于大量洗涤剂病毒灭活数据，鉴定了影响灭活的倾向，这些倾向包括烷基和乙氧基化物链长。出乎意料地，烷基链长影响病毒灭活活性。具有一或两个碳的烷基链的对病毒灭活没有影响，而具有3-7个碳的烷基链的可以灭活病毒。对于也得到了类似的观察结果。发现具有8个或9个碳接头链的对病毒灭活没有影响，而具有10个碳接头的使病毒灭活。Anapoe洗涤剂由烷基链和乙氧基化物链构成，其中烷基碳(C)数和乙氧基化物基团(E)数在名称中表示出，例如Anapoe C12E9具有12个烷基碳和9个乙氧基团。虽然发现Anapoe C12E9和Anapoe C12E8、Alfonic TDA-6乙氧基化物(TDA-6)和Alfonic TDA-9乙氧基化物(TDA-9)强健地灭活所述病毒，但是Anapoe C10E9、Anapoe C10E6、Anapoe C12E10和C13E8没有灭活所述病毒。

在存在几种重要的治疗剂形式：单克隆抗体、双特异性T细胞募召剂(bispecificT cell engager)和融合蛋白的情况下，Anapoe C12E8、Anapoe C12E9、AlfonicTDA-6乙氧基化物(TDA-6)和Alfonic TDA-9乙氧基化物(TDA-9)和N-庚基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷在病毒灭活中特别强健。在低至5℃至15℃的温度下，在30秒和30分钟之间，这些洗涤剂显示出完全的病毒灭活。

洗涤剂病毒灭活可以发生在生物制造下游过程的一个或多个步骤中。洗涤剂病毒灭活可以发生在收获澄清液之后和亲和色谱步骤之前；亲和色谱步骤之后和深层过滤和/或精制色谱步骤之前；精制色谱步骤之间；病毒过滤步骤和/或UF/DF步骤之前。

术语“多核苷酸”或“核酸分子”在全文中可互换使用，并且包括单链和双链核酸，并且包括基因组DNA、RNA、mRNA、cDNA或合成来源的或与通常在自然界中发现的序列无关的一些其组合。术语“分离的多核苷酸”或“分离的核酸分子”具体是指合成来源的序列或自然界中通常不存在的序列。包含规定序列的分离的核酸分子除表达目的蛋白的序列以外还可以包括针对高达十种或甚至高达二十种其他蛋白或其部分的编码序列，或可以包括控制所叙述核酸序列的编码区的表达的可操作地连接的调节序列，和/或可以包括载体序列。包含核酸分子的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者任一类型核苷酸的经修饰形式。所述修饰包括碱基修饰，如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修饰，如2',3'-二脱氧核糖；及核苷酸间键修饰，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯氨基硫代磷酸酯、苯氨基磷酸酯及氨基磷酸酯。

如本文所用，术语“分离的”意指(i)不含至少一些通常与其一起被发现的其他蛋白或多核苷酸，(ii)基本上不含来自相同来源的其他蛋白或多核苷酸，例如来自相同物种，(iii)与至少约50％的在自然界与其相关的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其他物质分离，(iv)可操作地与在自然界与其不相关的多肽或多核苷酸相关(通过共价或非共价相互作用)，或(v)在自然界中不存在。

术语“多肽”或“蛋白”在全文中可互换使用，并且是指包含通过肽键彼此连结的两个或更多个氨基酸残基的分子。多肽和蛋白还包括具有天然序列的氨基酸残基的一个或多个缺失、插入和/或取代的大分子，即包括由天然存在细胞和非重组细胞产生的多肽或蛋白；或通过基因工程化细胞或重组细胞产生，并且包括具有天然蛋白的氨基酸序列的氨基酸残基的一个或多个缺失、插入和/或取代的分子。多肽和蛋白还包括如下氨基酸聚合物，其中一种或多种氨基酸为相应天然存在的氨基酸和聚合物的化学类似物。多肽和蛋白还包括修饰，所述修饰包括但不限于糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP核糖基化。术语“分离的蛋白”、“分离的重组蛋白”或“纯化的重组蛋白”可以互换使用，并且是指从会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途的蛋白或多肽或其他污染物中纯化出来的目的多肽或蛋白。特别地，由使用如本文描述的本发明处理的目的重组蛋白制成的药物物质和药物产品可以被称为“重组蛋白药物产品”、“重组生物治疗剂”。

多肽和蛋白可能具有科学意义或商业意义，包括蛋白治疗剂。目的蛋白尤其包括分泌型蛋白、非分泌型蛋白、胞内蛋白或膜结合蛋白。目的蛋白可以使用本文描述的方法通过细胞系生产，并且可以被可互换地称为“重组蛋白”、“目的重组蛋白”或“重组蛋白治疗剂”。所表达的一种或多种蛋白可以在细胞内产生或被分泌到培养基中，从培养基中可以回收和/或收集所述蛋白。目的蛋白可以包括例如通过结合靶、特别是下面列出的那些中的靶而发挥治疗作用的蛋白，包括从其衍生的靶、与其相关的靶及其修饰。

目的蛋白可以包括“抗原结合蛋白”。“抗原结合蛋白”是指包括抗原结合区或抗原结合部分的蛋白或多肽，所述抗原结合区或抗原结合部分对与其结合的另一分子(抗原)具有强亲和力。抗原结合蛋白质包括但不限于抗体、多肽(peptibody)、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物、融合蛋白(包括单链可变片段(scFv)和双链(二价)scFv、突变蛋白、xMAb、双特异性T细胞募召剂及嵌合抗原受体(CAR或CAR-T)和T细胞受体(TCR)。

scFv是单链抗体片段，它具有连接在一起的抗体重链和轻链的可变区。参见美国专利号7,741,465和6,319,494以及Eshhar等人,Cancer Immunol Immunotherapy[癌症免疫学免疫疗法](1997)45：131-136。scFv保留了亲本抗体与靶抗原特异性相互作用的能力。

术语“抗体”包括任何同种型或亚类的糖基化免疫球蛋白和非糖基化免疫球蛋白，或者其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合区。除非另外说明，否则抗体包括人的、人源化的、嵌合的、多特异性的、单克隆的、多克隆的、特异性IgG(heteroIgG)、双特异性的抗体、及其寡聚物或抗原结合片段。抗体包括lgG1型、lgG2型、lgG3型或lgG4型。还包括具有抗原结合片段或抗原结合区的蛋白，如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、双抗体、Fd、dAb、最大抗体(maxibody)、单链抗体分子、单结构域V_HH、互补决定区(CDR)片段、scFv、双抗体、三抗体、四抗体和至少包含足以使特异性抗原与靶多肽结合的免疫球蛋白的一部分的多肽。

还包括人的、人源化的和其他抗原结合蛋白，如人抗体和人源化抗体，所述抗原结合蛋白当施用于人时不会产生明显有害的免疫反应。

还包括经修饰的蛋白，如经非共价键、共价键或者共价键和非共价键两者化学修饰的蛋白质。还包括进一步包含一种或多种译后修饰的蛋白质，其可以通过细胞修饰系统或由酶和/或化学方法离体引入或以其他方式引入的修饰制得。

目的蛋白还可以包括重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包括例如多聚化结构域，如亮氨酸拉链、卷曲螺旋、免疫球蛋白的Fc部分等。还包括包含分化抗原的全部或部分氨基酸序列的蛋白质(称为CD蛋白)或其配体或与这些中的任一个实质上相似的蛋白质。

在一些实施例中，目的蛋白可以包括集落刺激因子，如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。此类G-CSF试剂包括但不限于(非格司亭)和(培非格司亭)。还包括红细胞生成刺激剂(ESA)，如(依伯汀α)、(达贝泊汀α)、(依伯汀δ)、(甲氧基聚乙二醇-依伯汀β)、MRK-2578、INS-22、(依伯汀ζ)、(依伯汀β)、(依伯汀ζ)、(依伯汀α)、依伯汀αHexal、(依伯汀α)、(依伯汀θ)、(依伯汀θ)、(依伯汀θ)、依伯汀α、依伯汀β、依伯汀ζ、依伯汀θ和依伯汀δ、依伯汀ω、依伯汀ι、组织纤溶酶原激活剂、GLP-1受体激动剂、以及前述任何内容的分子或其变体或类似物和生物仿制药。

在一些实施例中，目的蛋白可以包括与一种或多种CD蛋白、HER受体家族蛋白、细胞粘附分子、生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子、骨诱导因子、胰岛素和胰岛素相关蛋白、凝血和凝血相关蛋白、集落刺激因子(CSF)、其他血液和血清蛋白血型抗原特异性结合的蛋白；受体、受体相关蛋白、生长激素、生长激素受体、T细胞受体；神经营养因子、神经营养蛋白、松弛素(relaxin)、干扰素、白介素、病毒抗原、脂蛋白、整合素、类风湿因子、免疫毒素、表面膜蛋白、转运蛋白、归巢受体、地址素、调节蛋白和免疫粘附素。

在一些实施例中，目的蛋白单独或以任何组合结合以下一种或多种蛋白质的蛋白质：CD蛋白(包括但不限于CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD40、CD70、CD123、CD133、CD138、CD171和CD174)、HER受体家族蛋白(包括例如HER2、HER3、HER4和EGF受体)、EGFRvIII、细胞粘附分子(例如LFA-1、Mol、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整合素)、生长因子(包括但不限于例如血管内皮生长因子(“VEGF”))；VEGFR2、生长激素、甲状腺刺激素、卵泡刺激素、黄体生成激素、生长激素释放因子、甲状旁腺激素、米勒管抑制物质(mullerian-inhibiting substance)、人类巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)、促红细胞生成素(EPO)、神经生长因子(诸如NGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(包括例如aFGF和bFGF)、表皮生长因子(EGF)、Cripto、转化生长因子(TGF)(其中包括TGF-α和TGF-β(包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5))、胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II(IGF-I和IGF-II)、des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)和骨诱导因子、胰岛素和胰岛素相关蛋白(包括但不限于胰岛素、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素原和类胰岛素生长因子结合蛋白)；(凝血蛋白和凝血相关蛋白，尤其如，VIII因子、组织因子、维勒布兰德(von Willebrand)因子、蛋白C、α-1-抗胰蛋白酶、纤溶酶原激活剂(如尿激酶和组织纤溶酶原激活剂(“t-PA”))、邦巴辛(bombazine)、凝血酶、血小板生成素和血小板生成素受体、集落刺激因子(CSF)(尤其包括以下物质：M-CSF、GM-CSF和G-CSF)、其他血液和血清蛋白(包括但不限于白蛋白、IgE和血型抗原)、受体和受体相关蛋白(包括例如flk2/flt3受体、肥胖(OB)受体、生长激素受体和T细胞受体)；(x)神经营养因子，包括但不限于骨源性神经营养因子(BDNF)和神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-5或神经营养蛋白-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)；(xi)松弛素A链、松弛素B链和松弛素原、干扰素(包括例如干扰素α、干扰素β和干扰素γ)、白介素(IL)(例如IL-1至IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-23、IL-12/IL-23、IL-2Ra、IL1-R1、IL-6受体、IL-4受体和/或IL-13受体、IL-13RA2或IL-17受体、IL-1RAP；(xiv)病毒抗原，包括但不限于AIDS有包膜病毒抗原、脂蛋白、降钙素、胰高血糖素、心钠素、肺表面活性剂、肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β、脑啡肽酶、BCMA、IgKappa、ROR-1、ERBB2、间皮素、RANTES(受激活调节的正常T细胞表达与分泌因子)、小鼠促性腺激素相关肽、DNA酶、FR-α、抑制素和激活素、整合素、蛋白A或D、类风湿因子、免疫毒素、骨形态发生蛋白(BMP)、超氧化物歧化酶、表面膜蛋白、衰变加速因子(DAF)、AIDS包膜、转运蛋白、归巢受体、MIC(MIC-a、MIC-B)、ULBP 1-6、EPCAM、地址素、调节蛋白、免疫粘附素、抗原结合蛋白、生长激素、CTGF、CTLA4、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)-1、MUC1、CEA、c-MET、密蛋白(Claudin)-18、GPC-3、EPHA2、FPA、LMP1、MG7、NY-ESO-1、PSCA、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GM2、BAFF、OPGL(RANKL)、肌生成抑制素、Dickkopf-1(DKK-1)、Ang2、NGF、IGF-1受体、肝细胞生长因子(HGF)、TRAIL-R2、c-Kit、B7RP-1、PSMA、NKG2D-1、程序性细胞死亡蛋白1和配体、PD1和PDL1、甘露糖受体/hCGβ、丙型肝炎病毒、间皮素dsFv[PE38缀合物、嗜肺军团菌(lly)、IFNγ、γ干扰素诱导蛋白10(IP10)、IFNAR、TALL-1、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)、干细胞因子、Flt-3、降钙素基因相关肽(CGRP)、OX40L、α4β7、血小板特异性(血小板糖蛋白Iib/IIIb(PAC-1)、转化生长因子β(TFGβ)、透明带精子结合蛋白3(ZP-3)、TWEAK、血小板衍生的生长因子受体α(PDGFRα)、硬化蛋白(sclerostin)、以及任何前述内容的生物活性片段或变体。

在另一个实施例中，目的蛋白质包括阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿柏西普(aflibercept)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利库单抗(alirocumab)、阿那白滞素(anakinra)、阿塞西普(atacicept)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、生物素单抗(biosozumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、布罗达单抗(brodalumab)、莫坎妥珠单抗(cantuzumabmertansine)、康纳单抗(canakinumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、可那木单抗(conatumumab)、达利珠单抗(daclizumab)、迪诺舒单抗(denosumab)、依库丽单抗(eculizumab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、依那西普(etanercept)、依伏库单抗(evolocumab)、加利昔单抗(galiximab)、盖尼塔单抗(ganitumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、戈利木单抗(golimumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、英夫利昔单抗(infliximab)、易普利姆玛(ipilimumab)、依克珠单抗(ixekizumab)、乐地单抗(lerdelimumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕木单抗(mapatumumab)、磷酸莫特沙尼(motesanib diphosphate)、莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)、那他珠单抗(natalizumab)、奈西立肽(nesiritide)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、培克珠单抗(pexelizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、利妥木单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、罗米司亭(romiplostim)、洛莫索珠单抗(romosozumab)、沙格司亭(sargamostim)、托珠单抗(tocilizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥单抗(trastuzumab)、优特克单抗(ustekinumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、维西珠单抗(visilizumab)、伏洛昔单抗(volociximab)、扎木单抗(zanolimumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)以及前述任何内容的生物仿制药。

根据本发明所述的目的蛋白涵盖所有前述内容，并且进一步包括包含上述任何抗体的1、2、3、4、5或6个互补决定区(CDR)的抗体。还包括这样的变体，其包括与目的蛋白的参考氨基酸序列具有70％或更高、特别是80％或更高、更特别是90％或更高、再更特别是95％或更高、具体是97％或更高、更具体是98％或更高、再更具体是99％或更高同一性的氨基酸序列的区。在这方面的同一性可以使用多种熟知的且容易获得的氨基酸序列分析软件来确定。优选的软件包括实施史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法的那些软件，所述软件被认为是搜索和比对序列问题的令人满意的解决方案。还可以采用其他算法，特别是在速度是重要考虑因素的情况下。可以用于此方面的用于DNA、RNA和多肽的比对和同源性匹配的常用程序包括FASTA、TFASTA、BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLASTN、PROSRCH、BLAZE和MPSRCH，后者是用于在MasPar制造的大规模并行处理器上执行的史密斯-沃特曼算法的实施方式。

本文中还提供包含如上文所述的至少一种核酸分子的呈质粒、表达载体、转录盒或表达盒形式的表达系统和构建体，和包含此类表达系统或构建体的宿主细胞。如本文所用，“载体”意指适合用于将信息编码蛋白转移和/或转运至宿主细胞和/或特定位置和/或宿主细胞内的区室的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒衣壳、病毒体、裸DNA、复合DNA等)。载体可以包括病毒和非病毒载体、非附加型哺乳动物载体。载体通常被称为表达载体，例如，重组表达载体和克隆载体。可以将载体引入宿主细胞以允许载体自身的复制，并从而扩增其中包含的多核苷酸的拷贝。克隆载体可含有序列组分，所述序列组分通常包括但不限于复制起点、启动子序列、转录起始序列、增强子序列和选择性标记物。这些元件可以由本领域普通技术人员适当选择。

一种或多种“细胞”包括任何原核或真核细胞。细胞可以是离体细胞、体外细胞或体内细胞，可以是单独的或作为高级结构(如组织或器官)的一部分。细胞包括“宿主细胞”，也称为“细胞系”，它们经基因工程化以表达具有商业或科学意义的多肽。宿主细胞典型地源自来自原代培养物的谱系，其可在培养中维持无限时间。基因工程化宿主细胞涉及用重组多核苷酸分子转染、转化或转导细胞，和/或以其他方式改变(例如，通过同源重组和基因激活或重组细胞与非重组细胞的融合)以引起宿主细胞表达所需的重组多肽。用于遗传工程化细胞和/或细胞系以表达目的多肽的方法和载体是本领域技术人员熟知的；例如，各种技术在Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法]，Ausubel等人编辑(Wiley&Sons[约翰威立父子公司],纽约,1990，每季度更新)；Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](Cold SpringLaboratory Press[冷泉实验室出版社],1989)；Kaufman,R.J.，Large Scale MammalianCell Culture[大规模哺乳动物细胞培养],1990,第15-69页。

宿主细胞可以是任何原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母、昆虫或动物细胞(例如CHO细胞))。可经由常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。

在一个实施例中，所述细胞是宿主细胞。宿主细胞当在适当条件下培养时表达目的蛋白，所述目的蛋白随后可以自培养基收集(若宿主细胞将其分泌至培养基中)或直接由产生它的宿主细胞收集(若其并非分泌的)。适当的宿主细胞的选择将取决于各种因素，例如所希望的表达水平、活性所希望的或所需的多肽修饰(例如糖基化或磷酸化)和易于折叠成生物活性分子。

“培养”或“进行培养”是指细胞在多细胞生物体或组织外部的生长和繁殖。哺乳动物细胞的合适培养条件是本领域已知的。细胞培养基和组织培养基可互换地用于指在体外细胞培养期间适合宿主细胞生长的培养基。典型地，细胞培养基含有缓冲液、盐、能量来源、氨基酸、维生素和痕量必需元素。可以使用能够支持适当宿主细胞在培养中生长的任何培养基。可以将细胞培养基进一步补充其他组分以最大化特定培养的宿主细胞中的细胞生长、细胞活力和/或重组蛋白生产，所述细胞培养基是可商购的，并且包括RPMI-1640培养基、RPMI-1641培养基、杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、伊格尔最低必需培养基、F-12K培养基、哈姆F12培养基、伊思考夫改良的杜尔贝科培养基、麦考伊5A培养基、Leibovitz L-15培养基和无血清培养基如EX-CELL^TM300系列等，所述培养基可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)或SAFC生物科学公司(SAFC Biosciences)和其他供应商处获得。细胞培养基可以是无血清、无蛋白质、无生长因子和/或无蛋白质胨的培养基。还可以通过添加营养来富集细胞培养物，并以高于其通常的、推荐的浓度使用。

在培养过程中可以使用各种培养基配制品，例如，以促进从一个阶段(例如，生长阶段或生长期)过渡到另一阶段(例如，生产阶段或生产期)和/或优化细胞培养期间的条件(例如在灌注培养过程中提供的浓缩培养基)。生长培养基配制品可用于促进细胞生长并使蛋白质表达最小化。生产培养基配制品可用于促进目的蛋白质的生产和细胞的维持，同时使新细胞的生长减至最少。饲料培养基，典型地是包含在细胞培养物生产期过程中消耗的较高浓度组分(如营养素和氨基酸)的培养基，可用于补充和维持活性培养物，特别是分批加料、半灌注或灌注模式的培养物。这种浓缩的饲料培养基可以包含大多数细胞培养基组分，例如，其正常量的约5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、20倍、30倍、50倍、100倍、200倍、400倍、600倍、800倍或甚至约1000倍。

生长期可以在比生产期更高的温度下进行。例如，生长期可以在从约35℃至约38℃的第一温度下进行，并且生产期可以在从约29℃至约37℃，任选地从约30℃至约36℃或从约30℃至约34℃的第二温度下进行。此外，可以在温度变化之前和/或之后的同时添加蛋白质产生的化学诱导剂，如像咖啡因、丁酸酯和六亚甲基双乙酰胺(HMBA)。如果在温度变化后添加诱导剂，则可以在温度变化后1小时至5天，任选地在温度变化后1至2天添加诱导剂。

宿主细胞可以悬浮或以附着在固体基质上的粘附形式培养。可以在带有或不带有微载体的流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶、摇瓶或搅拌罐生物反应器中建立细胞培养。

细胞培养能以分批、分批加料、连续、半连续或灌注模式进行。哺乳动物细胞(如CHO细胞)可以在生物反应器中以小于100ml至小于1000ml的小规模培养。可替代地，可以使用含有1000ml至20,000升以上培养基的大规模生物反应器。大规模细胞培养，如用于蛋白治疗剂的临床和/或商业规模生物制造的细胞培养，可维持数周甚至数月，在此期间细胞产生所需的一种或多种蛋白。

本文提供了用于产生分离的、纯化的目的重组蛋白的方法，所述方法包括用表达重组蛋白的宿主细胞在生物反应器中建立细胞培养以及培养表达所述目的重组蛋白的细胞；收获含有所述目的重组蛋白的细胞培养液；使收获的含有所述目的重组蛋白的流体以足以导致有包膜病毒灭活的洗涤剂浓度和时间经受洗涤剂，所述洗涤剂具有以下CAS登记号：CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5、CAS 85618-20-8、CAS 181135-58-0、CAS 181135-57-9、CAS 250692-65-0、CAS 228579-27-9、CAS 349477-49-2、CAS 70504-28-8、CAS 59080-45-4、CAS 69984-73-2、CAS 148616-91-5、CAS 148565-55-3、CAS 69227-93-6、CAS 82494-09-5、CAS 253678-67-0、CAS 106402-05-5或CAS 93911-12-7；通过至少两个额外的单元操作处理含有所述目的重组蛋白的经病毒灭活的流体；以及获得分离的、纯化的目的重组蛋白。

本文提供了用于产生分离的、纯化的目的重组蛋白的方法，所述方法包括用表达重组蛋白的宿主细胞在生物反应器中建立细胞培养以及培养表达所述目的重组蛋白的细胞；收获含有所述目的重组蛋白的细胞培养液；通过至少两个单元操作处理收获的含有所述目的重组蛋白的流体，其中在至少一个单元操作期间存在如下步骤，在所述步骤中含有所述目的重组蛋白的流体与具有以下CAS登记号的洗涤剂以足以导致有包膜病毒灭活的洗涤剂浓度和时间组合：CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5、CAS 85618-20-8、CAS 181135-58-0、CAS 181135-57-9、CAS 250692-65-0、CAS 228579-27-9、CAS 349477-49-2、CAS 70504-28-8、CAS 59080-45-4、CAS 69984-73-2、CAS 148616-91-5、CAS 148565-55-3、CAS 69227-93-6、CAS 82494-09-5、CAS 253678-67-0、CAS 106402-05-5或CAS93911-12-7；以及获得分离的、纯化的目的重组蛋白。

然后可以从生物反应器中的细胞培养物中收获含有表达的重组蛋白的细胞培养液。从悬浮细胞中收获表达的蛋白质的方法是本领域已知的，并且包括但不限于酸沉淀、加速沉降(如絮凝)、使用重力分离、离心、声波分离、过滤(包括使用超滤器、微滤器、切向流过滤器、深度过滤器和冲积过滤器的膜过滤)。通过本领域已知的氧化还原折叠过程的方法，可以从细胞质中的包涵体中回收由原核生物表达的重组蛋白。

然后，可以使用一个或多个单元操作从任何杂质，诸如剩余的细胞培养基、细胞提取物、不需要的组分、宿主细胞蛋白、表达不正确的蛋白、污染物、微生物(诸如细菌和病毒)、聚集物等中纯化出或部分纯化在澄清的收获的细胞培养液中的目的重组蛋白。术语“单元操作”是指纯化重组蛋白(诸如从液体培养基中)的过程中进行的功能步骤。例如，一个单元的操作可以涉及过滤(例如，从包括重组蛋白的流体中去除污染物细菌、酵母、病毒、分枝杆菌、杂质和/或颗粒物质)、捕获、表位标签去除、纯化、收集、贮存、储存、精制、收获、病毒灭活(包括洗涤剂病毒灭活)、病毒过滤、包含重组蛋白的流体的离子浓度和/或pH调节(以及去除不需要的盐)。本文描述的发明可用于从药物物质的收获到配制的下游过程中的一个或多个步骤。

例如，单元操作可以包括，诸如但不限于收获、捕获、纯化、精制、病毒灭活、病毒过滤和/或调节含有所述目的重组蛋白的浓度和配制品的步骤。单元操作还可以包括其中汇集、贮存和/或储存流体(诸如收获、色谱或过滤后的捕获汇集物)以及贮存或储存容器中的流体(诸如收获后)的步骤。可以将单一单元操作设计为在同一操作中完成多个目标，诸如收获和病毒灭活或捕获和病毒灭活。

捕获单元操作包括利用树脂和/或含有与目的重组蛋白结合的试剂的膜进行捕获色谱，例如亲和色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱(HIC)、固相金属亲和色谱(IMAC)等。此类材料是本领域已知的并且可以是可商购的。亲和色谱可以包括，例如底物结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、适配子结合捕获机制、和辅助因子结合捕获机制。示例性亲和色谱包括蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G或蛋白质L。目的重组蛋白可以用聚组氨酸标签标记随后使用咪唑通过IMAC纯化，或者使用表位(诸如)标记随后使用针对所述表位的特异性抗体进行纯化。

一个或多个捕获单元操作可以包括病毒灭活和病毒过滤。除了本文提供的本发明的病毒灭活方法外，还可以使用用于病毒灭活的其他方法，诸如热灭活/巴氏消毒、pH灭活、UV和γ射线照射、使用高强度广谱白光以及添加化学灭活剂(诸如B-丙内酯)。

可以在任何时候对已知或怀疑在流体中含有的病毒进行灭活。在生物药物物质制造期间，在含有目的重组蛋白的流体中的病毒灭活的发生可以是在一个或多个独立的病毒灭活单元操作中；作为收获单元操作的一部分；在一个或多个捕获色谱单元操作之前、或作为其一部分、或在其之后；在一个或多个亲和色谱单元操作之前、或作为其一部分、或在其之后；在一个或多个精制色谱单元操作之前、或作为其一部分、或在其之后；在一个或多个离子交换色谱、疏水相互作用色谱、混合模式或多模式色谱和/或羟基磷灰石色谱单元操作之前、或作为上述的一部分、或在上述之后；在一个或多个病毒过滤单元操作之前、或作为其一部分、或在其之后；和/或在一个或多个超滤/渗滤单元操作之前或在其之后。在一个实施例中，该病毒灭活发生在收获之后。在一个实施例中，该病毒灭活发生在包括微滤的收获单元操作之后。在一个实施例中，该病毒灭活发生在捕获色谱单元操作之前。在一个实施例中，该病毒灭活发生在蛋白质A亲和色谱步骤之前。病毒灭活后可以通过过滤(诸如深层过滤)或色谱(诸如蛋白质A色谱)以去除灭活的病毒、灭活剂(诸如表面活性剂和洗涤剂)、浊度和/或沉淀。

可以使用微滤器和/或纳滤器进行病毒过滤，所述微滤器和/或纳滤器是可商购来源(诸如旭化成株式会社(Asahi Kasei)和EDM密理博公司(Millipore))的。

“精制”在本文用于指进行一个或多个色谱步骤以从包括接近最终所需纯度的重组蛋白的流体中去除残留的污染物和杂质，如DNA、宿主细胞蛋白；产物特异性杂质、变体产物和聚集体和病毒吸附。例如，可以通过使包括重组蛋白的流体流过一种或多种色谱柱或一种或多种膜吸收剂，使其选择性结合目标重组蛋白或存在于包括重组蛋白的流体中的污染物或杂质，以结合和洗脱模式进行精制。在此实例中，一种或多种色谱柱或膜吸收剂的洗脱液/滤液包括重组蛋白。

精制色谱单元操作使用的色谱树脂和/或膜含有能以流通模式(其中目的蛋白包含在流经色谱介质的洗脱液中并且污染物和杂质结合到色谱介质上)或结合并洗脱模式(其中目的蛋白结合到色谱介质上并且在污染物和杂质流经色谱介质或从色谱介质上洗掉后从色谱介质上洗脱)使用的试剂。此类色谱方法的实例包括离子交换色谱(IEX)，诸如阴离子交换色谱(AEX)和阳离子交换色谱(CEX)；疏水相互作用色谱(HIC)；混合模式或多模式色谱(MM)、羟基磷灰石色谱(HA)；反相色谱和凝胶过滤。

尽管在本申请中使用的术语是本领域中的标准术语，但是本文提供了某些术语的定义以确保权利要求的含义的清楚性和确定性。单位、前缀和符号可能会用它们的SI接受形式表示。本文列举的数字范围包括定义范围的数字，并且包括并支持所定义范围内的每个整数。除非另外指示，否则本文所述的方法及技术可根据本领域中熟知的常规方法且如贯穿本说明书所引用及论述的各种通用及更特定参考文献中所描述来进行。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],Cold SpringHarbor,N.Y.[纽约州冷泉港](2001)和Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学实验指南],Greene Publishing Associates[格林出版公司](1992)，以及Harlow和Lane Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册]Cold SpringHarbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],Cold Spring Harbor,N.Y[纽约州冷泉港](1990)。在本申请中所引用的所有文件或文件的部分，包括但不局限于专利、专利申请、论文、书籍、和专著，都通过引用清楚地并入本文。在本发明的一个实施例中描述的内容可以与本发明的其他实施例组合。

本发明在范围上不受本文所述的特定实施例的限制，这些特定实施例旨在作为本发明各个方面的单个说明，并且功能上等效的方法和组分也在本发明的范围内。实际上，除了本文中显示和描述的那些之外，根据前述描述和附图，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。这类改变旨在落入所附权利要求书的范围内。

实例

实例1

病毒储备液

按照先前在Romanowski等人,Bioprocess Int[国际生物工艺]2008,6(2),44-52中的描述产生xMuLV、PRV和MMV的病毒储备液。为了鉴定致细胞病变效应(CPE)，使用了与病毒相容的指示细胞系。对于xMuLV，使用了PG4细胞系(猫星形胶质细胞系)。接种后七天确定CPE。接种后10天后，用324K细胞系确定MMV的CPE，并且对于PRV在3天的测定中使用了Vero细胞系。

洗涤剂筛选

使用xMuLV(一种常用于病毒清除研究的小鼠逆转录病毒)对96种洗涤剂进行了初步筛选。所述筛选是在96深孔板(来自汉普顿研究公司(Hampton Research)(HR2-406)，亚里索维耶荷，加利福尼亚州)上进行的。测试的洗涤剂具有一系列的两性性能，所述两性性能包括非离子、两性离子和离子特性。如汉普顿(Hampton)试剂盒所示，在筛选中评估的所有洗涤剂均为其临界胶束浓度(CMC)值的10倍或10％w/v。15℃下加入5％病毒30分钟后，评估每种洗涤剂的重复运行。还同时运行了加入5％v/v水的对照，以展示稀释液对终止洗涤剂的灭活有效。用培养基以1:300稀释每个重复运行和对照运行，以减少细胞毒性和干扰，并用25％汇合(confluent)的PG4黏附细胞孵育。孵育期后，分析孔中所接种的PG4细胞中的任何CPE。

用从10⁰至10^-7的1:10连续系列稀释液在8个重复中进行TCID50测定。在运行期间保持在蛋白质中加入10％xMuLV的无洗涤剂的同步对照溶液(hold control solution)以及种子培养基的阴性对照。将所有样品用25％汇合的PG4细胞滴定并在37℃下孵育7天。如前所述(Romanowski等人,同上)，在第七天读取平板CPE并用总病毒滴度和对数减小值(LRV)的斯皮尔曼-卡尔伯方程进行评估。

扩展的病毒研究

根据欧盟关于化学安全的指令67/548/EC，目前将19种灭活xMuLV的洗涤剂视为不危险。这些洗涤剂在5倍CMC值下进行针对另外两种病毒(另一种有包膜病毒PRV和一种无包膜病毒MMV)的进一步测试。两种病毒均在5％v/v下测试，否则按照如上述洗涤剂初步筛选所述的使用相同的条件和测定。

浓度研究

评估了Anapoe C12E8(CAS号3055-98-9)、Anapoe C12E9(CAS号3055-99-90)、(CAS号250692-65-0)、(CAS号70504-28-8)(由俄亥俄州莫米市Anatrace提供)和正庚基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷(CAS号85618-20-8)(西格玛/奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里州)仍能灭活病毒的最低浓度。如上所述，在15℃下，使洗涤剂与病毒孵育30分钟时期，针对xMuLV评估了2.5倍、5倍和7.5倍临界胶束浓度的浓度。

温度依赖性研究

针对xMuLV，在5℃至22℃的温度下，在含有三种不同蛋白质形式(单克隆抗体(mAb#1)、双特异性T细胞募召剂(#1)和XmAb融合蛋白(融合蛋白#1))的基质(宿主细胞培养液)中评估了Anapoe C12E8、Anapoe C12E9、 和正庚基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷。如前所述(Romanowski等人,同上)，取30秒、10分钟和30分钟的时间点，并且按1:300稀释(在所述稀释度下使用皮尔曼-卡尔伯法，缓冲基质不会引起毒性和干扰)。在18℃下重复运行Triton X100对照(密理博西格玛公司(Millipore Sigma)，特曼库拉，加利福尼亚州)。

洗涤剂的动力学研究

针对xMuLV，在含有三种不同蛋白质形式(单克隆抗体(mAb#1)、双特异性T细胞募召剂(#1)和XmAb融合蛋白(融合蛋白#1))的基质(宿主细胞培养液)中，在三个时间点评估了Anapoe C12E8、Anapoe C12E9、 和正庚基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷：30秒、10分钟和30分钟。取30秒、10分钟和30分钟的时间点，并且按1:300稀释(在所述稀释度下使用皮尔曼-卡尔伯法，缓冲基质不会引起毒性和干扰)。

洗涤剂清除率

在蛋白质A色谱期间针对含有单克隆抗体的样品评估了洗涤剂Anapoe C12E9的清除率。将蛋白质样品(含有单克隆抗体的宿主细胞培养液)加有0.03％洗涤剂并运行通过蛋白质A柱。在沃特世(Waters)BioResolve^TM多酚(米尔福德(Milford)，马萨诸塞州)2.1x 50mm柱上评估了洗脱峰和加有洗涤剂的缓冲液的清除率。在65℃的流速为0.5mL/min。使用固定相A(含有0.1％TFA/0.1％甲酸的水)和流动相B(90％正丙醇)，以5分钟的梯度运行样品。

扩展范围的研究

扩展本研究的范围以评估另外两种烷基乙氧基化物衍生物。测试了在三个浓度下(其CMC值的2.5倍、5倍和7.5倍)的烷基乙氧基洗涤剂IsoC13E6(CMC:29.91mg/L)和Iso-C13E9(CMC:57.97mg/L)(也可作为Alfonic TDA-6乙氧基化物Novel-TDA6和Alfonic TDA-9乙氧基化物Novel-TDA9(Avantor,拉德诺市,宾夕法尼亚州；Sasol,约翰内斯堡,南非)CAS9043-30-5)获得)。将样品与加有5％XMuLV的含有mAb#1或双特异性T细胞募召剂(#1)的宿主细胞培养液在5℃下孵育。将样品按1:300稀释以减少在三个时间点(30秒、10分钟和30分钟)的细胞毒性和干扰。

用从10⁰至10^-7的1:10连续系列稀释液在8个重复中进行TCID50测定。在运行期间保持在蛋白质中加入5％XMuLV的无洗涤剂的同步对照溶液(hold control solution)以及种子培养基的阴性对照。将所有样品用25％汇合的PG4细胞滴定并在37℃下孵育7天。如前所述(Romanowski等人,同上)，在第七天读取平板CPE并用总病毒滴度和对数减小值(LRV)的斯皮尔曼-卡尔伯方程进行评估。

结果与讨论

洗涤剂筛选

利用具有不同离子、疏水性和结构特征的96种可商购的洗涤剂的选择，针对包膜模型病毒xMuLV进行了初步筛选。如表1所示，在这些洗涤剂中的五十一种中，在重复和洗涤剂对照中均未鉴定出CPE。这个组包括非离子型、两性离子型和合成脂质洗涤剂，而测试的离子型洗涤剂均未显示病毒灭活。

表1.96种样品洗涤剂的初步筛选中显示出对xMuLV病毒灭活的洗涤剂。SL＝合成脂质；Z＝两性离子型；N＝非离子型。

在发现病毒灭活阳性的51种洗涤剂中，有些在结构上相似，只是烷基链接头的长度不同。通过基于洗涤剂结构的评估结果，观察到结构类别内的趋势。根据欧盟关于化学安全的指令67/548/EC，目前将19种鉴定的洗涤剂视为不危险(表2)。基于分子结构将这些“生态友好”的洗涤剂分成四种类型的组并标记为CYMAL、Fos-Choline、Anapoe和硫代葡萄糖苷，图1。

表2.根据欧盟关于化学安全的指令67/548/EC，病毒灭活呈阳性的洗涤剂被视为不危险。

洗涤剂含有麦芽糖苷糖，该麦芽糖苷糖通过不同长度的烷基链与环己烷连接。1-7存在于初步筛选的96种洗涤剂中。出人意料地，具有一或两个碳的烷基链的对灭活xMuLV病毒没有影响，然而具有3-7个碳的烷基链的可以灭活所述病毒。与影响Fos-Choline和Anapoe衍生物的烷基链长相关的类似的出人意料的结果似乎一样。发现具有8个或9个碳接头链的Fos-Choline对病毒灭活没有影响，而具有10个碳接头的Fos-Choline使病毒灭活。Anapoe洗涤剂由烷基链和乙氧基化物链构成，其中烷基碳(C)数和乙氧基化物基团(E)数在名称中表示出，例如Anapoe C12E9具有12个烷基碳和9个乙氧基团。虽然发现Anapoe C12E9和Anapoe C12E8强健地灭活所述病毒，但是AnapoeC10E9、Anapoe C10E6、Anapoe C12E10和C13E8没有灭活所述病毒，表3。烷基链长影响分子的整体疏水性，并可能最终影响病毒包膜的分割。特定范围的亲脂性可能是诱导脂质包膜层破裂所必需的。

表3.影响xMuLV病毒灭活的烷基链长

病毒灭活的扩展的病毒研究范围

用不同的有包膜病毒(PRV)和无包膜病毒(小鼠微小病毒(MMV))对这19种“生态友好”的洗涤剂进行了进一步测试。所有19种洗涤剂都能像灭活xMuLV一样灭活PRV，但对MMV没有影响，这表明洗涤剂对有包膜病毒有影响，但对无包膜的病毒没有影响。Triton X-100也只影响有包膜病毒，表明这些洗涤剂可能以类似的方式破坏脂质包膜。

浓度研究

为确定灭活xMuLV所需的最低浓度；针对xMuLV、PRV和MMV，以一式两份对2.5倍、5倍和7.5倍的CMC值的Anapoe C12E8、Anapoe C12E9、和正庚基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷进行了测试。对于所有测试的病毒，2.5倍CMC显示出致细胞病变效应(CPE)；因此，随后的研究是在5倍CMC值的所述洗涤剂下评估的。

温度依赖性研究

在各种温度，在存在三种蛋白质治疗剂形式(单克隆抗体(mAb)、双特异性T细胞增强子和融合蛋白(XmAb)的情况下，分析了Anapoe C12E8、Anapoe C12E9、正庚基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、和(表2)。Anapoe洗涤剂和正庚基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷在5℃和15℃(这代表了制造环境的“最坏情况情景”温度)下均显示在30分钟内完全灭活。这三种洗涤剂在和mAb形式下的LRV值与Triton X-100相当，甚至对融合蛋白的清除率更好。

在测试的任何温度下，洗涤剂FosCholine-10和都不会对xMuLV产生显著的灭活。因为在初步洗涤剂筛选和其他实验期间观察到了这些洗涤剂对病毒的灭活，所以当不存在产品时，可能存在与样品基质的阴性相互作用。在15℃的过程温度下，和的平均LRV分别为3.8和0.39。为了分析温度对洗涤剂的影响，在更高温度(22℃)下测试了这确实导致LRV增加了约1log。即使采用这样的温度升高，LRV仍然很低。

表4.在两个温度(5℃和15℃)下，针对3种不同的形式测试了五种洗涤剂的对数减小值。将LRV与具有强健的xMuLV清除率的Triton X-100相比较。

*在18℃下测试蛋白质，在2℃下测试mAb并在7℃下测试融合蛋白。

**LRV值基于800个样品的大容量板，这导致自测试替代性洗涤剂的80个孔增加了1个LRV。

洗涤剂的动力学研究

为了评估发生病毒灭活时的比率，测试了三个时间点：30秒、10分钟和30分钟。在30秒内，对Anapoe C12E8和正庚基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷针对测试的所有三种治疗剂形式，观察到xMuLV的完全灭活。Anapoe C12E9在30秒时展示出对mAb#1完全灭活，并且在10分钟内展示出对融合蛋白#1和#1完全灭活，参见表5。Anapoe C12E9在10分钟内对测试的所有三种治疗剂形式显示完全清除。Anapoe C12E9的CMC值是Anapoe C12E8的一半，这意味着要达到相同的LRV，它需要显著更少的洗涤剂。对于扩大到商业制造数量，此属性将具有显著的益处。

在30分钟内，和均没有导致强健的清除率。

表5.取三个时间点(30秒、10分钟和30分钟)针对三种产品测试了洗涤剂的对数减小值(LRV)。

Anapoe C12E8的清除率

为了确保在病毒灭活过程后能完全清除洗涤剂，使用蛋白质A色谱法将加有0.03％Anapoe C12E8洗涤剂的含有mAb的宿主细胞培养液进行亲和纯化。使用液相色谱-质谱法(LC-MS)分析色谱运行后残留的洗涤剂的量。所述结果表明所述洗涤剂在蛋白质A色谱步骤期间被清除，图2。

烷基乙氧基化物洗涤剂的扩展范围

为了进一步理解强健的病毒清除率所需的洗涤剂的特异性，评估了另外两种结合有支链异丙基基团的烷基乙氧基化物。在浓度等于或高于5倍CMC值时，两种洗涤剂都还具有强健的xMuLV清除率。用两种治疗剂形式(mAb#1和#1)观察到高LRV，表6。这些结果表明范围广泛的Anapoe衍生物的强健的病毒灭活能力。

表6.将样品与产品一起在5℃下以3种浓度孵育30分钟。用5倍CMC值的Iso-C13E6(Alfonic TDA-6乙氧基化物，Novel-TDA6)和Iso-C13E9(Alfonic TDA-9乙氧基化物，Novel-TDA9)，观察到XMuLV完全灭活。

实例2浊度

进一步测试了三种洗涤剂以确定他们是否负面影响了四种不同的蛋白质形式的稳定性，如通过浊度、溶解度和高分子量种类(HMW)测量的。此外，对于HMW通过尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)而对于低分子量种类(LMW)通过降低的毛细管电泳-十二烷基硫酸钠法(rCE-SDS)，来测量产品质量。

使用一种单克隆抗体(mAb#2)、两种融合蛋白(融合蛋白#2和融合蛋白#3)、一种双特异性抗体(双特异性抗体#1)和两种双特异性T细胞募召剂(#1和#2)测试了Anapoe C12E8(APO128)、Anapoe C12E9(APO129)和Triton X-100。

用浊度的测定测量加有洗涤剂的样品的稳定性。增加的样品浊度将反映蛋白质分子的沉淀。

使从每种分子的培养物中收集的100mL收获的细胞培养液(HCCF)经受以下四种条件：不含洗涤剂(对照)、含APO128、含APO129和含Triton X-100的HCCF。以所述洗涤剂的临界胶束浓度(CMC)值的五倍加入所述洗涤剂，Triton-X：Triton-X：1.1mM，APO128：0.55mM，APO 129：0.25mM，TDA-9：0.48mM。

每个分子产生两组样品；一组在室温下保持5天。第二组在2℃-8℃下保持7天。在第0、1、2、5和7天，使用浊度计(Hach浊度计2100P 46500-00，洛夫兰，科罗拉多州)测量每个样品的浊度。

图3显示了在室温和2℃-8℃下，洗涤剂和HCCF的混合物在每个时间点的浊度数据。第5天的室温数据点显示了最大可变性，这可能是由于样品的细菌污染导致的。加有APO128和APO129的样品的数据点与加有Triton X-100的样品的数据点趋势非常接近，或者混浊程度低于对照。这表明所测试的洗涤剂均未引起不同蛋白质形式的沉淀。

实验4产品质量

高分子量百分比(％HMW)和低分子量百分比(％LMW)被用于测量加有洗涤剂的样品的稳定性。％HMW测量样品中蛋白质的聚集，而％LMW测量蛋白质的剪切。在亲和柱纯化前后测量这些产品质量属性，以确定洗涤剂的存在是否影响了亲和纯化过程或亲和纯化材料的产品质量。

测试了收获的细胞培养液和来自一种单克隆抗体(mAb#2)、两种融合蛋白(融合蛋白#2和融合蛋白#3)、一种双特异性抗体(双特异性抗体#1)和两种双特异性T细胞募召剂(#1和#2)的亲和色谱后的样品。

将五倍临界胶束浓度(CMC)的Anapoe C12E8(APO128)(0.11mM)、Anapoe C12E9(APO129)(0.05mM)、Alfonic TDA-9乙氧基化物(TDA-9)(0.1mM)和Triton X-100(0.22mM)加入100mL HCCF亲和色谱前上样的材料和亲和色谱后汇集的材料的样品。使用无洗涤剂的样品作为对照。在室温下将样品与去污剂一起搅拌约1小时。然后，在提交产品质量分析之前，将它们保存在2℃-8℃中7天，或者通过亲和柱纯化，然后提交产品质量分析。

通过使收获的细胞培养液经受使用用于BiTE#2的GE CaptoChelating树脂(匹兹堡市，宾夕法尼亚州)和用于所有其他蛋白质形式的GE MabSelect Sure树脂(匹兹堡市，宾夕法尼亚州)进行的蛋白质A亲和色谱产生亲和柱后样品。

将洗涤剂加入额外的100mL来自每种蛋白质形式的HCCF亲和色谱前上样的材料的样品并在2℃-8℃下保持7天。

使用SEC-HPLC测定％HMW并且使用rCE-SDS测定％LMW，对产品质量进行评估。

由于材料可用性的时间限制，进行了两组实验。第一个实验包括四种条件：无洗涤剂对照、Triton X-100、APO128和APO129。第二个实验包括两种条件：无洗涤剂对照和TDA-9。

图4显示了以％HMW和％LMW测量的分子在亲和捕获过程中的稳定性。通过减去无洗涤剂对照的值使数据标准化。对于大多数分子，％HMW和％LMW在亲和捕获步骤前后保持恒定。已知BiTE#2在亲和层析后汇集阶段不稳定，因此％HMW变化很大。

图5显示了亲和后BiTE#1的产品质量数据。在亲和色谱之前，没有提交BiTE#1HCCF(上样的材料)的产品质量。

图6显示了在2℃-8℃下培养7天后，由％HMW和％LMW测量的分子的稳定性保持相对恒定。通过减去无洗涤剂对照的值使数据标准化。

在亲和色谱期间，所述洗涤剂对产品质量没有显著影响。