回收方法
阅读说明：本技术 回收方法 (Recovery method ) 是由 S.格兰维尔 P.F.平德 S.雅格布森 L.约翰森 C.雅格布森 K.B.安德森 S. 于 2018-04-03 设计创作，主要内容包括：披露了一种用于从发酵液中回收所需发酵产物的方法,其中该所需产物已在发酵期间发生沉淀。(A kind of method for tunning needed for recycling from fermentation liquid is disclosed, wherein the required product precipitates during fermentation.)
对序列表的引用
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技术领域
本发明涉及一种用于溶解发酵液中的蛋白质晶体和/或蛋白质沉淀的改进方法。
背景技术
工业蛋白质(例如酶，如蛋白酶)的发酵产率近年来已经大幅提高。在许多工业过程中，发酵液中蛋白质的浓度非常高，以至于在发酵过程结束时发现一大部分蛋白质以晶体或固体沉淀的形式存在。
WO 93/13125披露了一种用于生产蛋白酶的方法，其中蛋白酶在发酵期间通过向生产培养基添加沉淀剂而发生沉淀。据发现，在发酵期间使蛋白酶沉淀避免蛋白酶发生蛋白质水解。
对于许多发酵产物而言，期望从产物中除去发酵中使用的微生物。产物回收过程的首要步骤之一通常是从产物中除去细胞生物质，例如通过过滤或离心从包含所需产物的液体中除去固体细胞生物质。该步骤通常称为初级分离步骤，其中将微生物与液体级分分离，随后可以将该液体级分用一个或多个下游步骤处理，如超滤、稳定化、喷雾干燥、造粒，最终将所需产物转变成该特定产物预期的形式和浓度。
然而，如果在发酵后一部分所需产物以固体形式存在，则必须采取适当的措施以在从包含该产物的液体级分中除去生物质之前溶解该产物。
US 6,316,240披露了一种用于溶解在发酵工艺期间发生沉淀的酶的方法，其中将培养液的pH调节到9.5与13.0之间的pH。该方法以淀粉酶发酵为例。
EP 2 125 865披露了一种用于溶解发酵液中的蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀的方法，该方法包括：将发酵液稀释100％-2000％(w/w)；添加二价盐；以及将发酵液的pH值调节至低于5.5的pH值。
EP 1 456 613披露了一种用于从发酵液中收获结晶颗粒，特别是结晶α-淀粉酶或蛋白酶的方法，其中将发酵液分离成生物质级分、结晶α-淀粉酶或蛋白酶级分和上清液级分。
发明内容
本发明提供了一种用于从发酵液中回收所需产物的方法，其中所需产物以沉淀形式存在于发酵液中，该方法包括：
a)在第一相和第二相中分离发酵液的第一分离步骤，其中第一相包含来自发酵液的上清液并且其可包含来自发酵液的一部分细胞及细胞碎片，并且第二相包含沉淀形式的所需产物、细胞及细胞碎片；以及
b)溶解步骤，其中使沉淀形式的所需产物溶解。
在一个优选的实施例中，该方法进一步包括第二分离步骤，其中将来自步骤b)的溶解的所需产物与细胞和/或细胞碎片分离。
序列的详细描述
SEQ ID NO:1：缓慢芽孢杆菌(B.lentus)蛋白酶(Savinase)的氨基酸序列
SEQ ID NO:2：解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)蛋白酶(BPN’)的氨基酸序列
SEQ ID NO:3：枯草杆菌蛋白酶Carlsberg
SEQ ID NO:4：来自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)的蛋白酶TY145，在WO 92/17577中披露
SEQ ID NO:5：来自拟诺卡氏菌属物种(Nocardiopsis sp.)NRRL 18262的蛋白酶，在WO 88/03947中披露
SEQ ID NO:6：强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)蛋白酶，在US 6,358,726中披露。
SEQ ID NO:7：来自芽孢杆菌属物种的α-淀粉酶，在WO 2000/060060中披露。
SEQ ID NO:8：来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的α-淀粉酶SEQ ID NO:9：来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的α-淀粉酶
附图说明
图1显示了来自培养液(CB)或来自根据本发明的第二相的胞壁质酶的溶解，反映了实例5中的实验结果。
具体实施方式
本发明涉及发酵液的初级分离，其中一部分所需发酵产物以固体形式存在，如以结晶或无定形形式存在。对于本发明而言，所需的发酵产物是呈结晶还是无定形形式或者甚至呈这些形式的混合物并不重要，重要的是一大部分所需产物呈固体形式，因此初级分离步骤可能不像简单的固/液分离过程那样容易地进行。初级分离步骤的目的是从所需产物中除去细胞及细胞碎片。
本发明涉及从发酵液中回收所需发酵产物的方法，其中发酵产物以至少部分不溶形式存在于发酵液中，如以结晶或无定形形式存在；该方法包括：
·在第一相和第二相中分离发酵液的第一分离步骤，其中第一相包含来自发酵液的液体和可溶形式的所需发酵产物；并且第二相包含不溶形式的所需发酵产物、细胞和/或细胞碎片；以及
·溶解步骤，其中使第二相中的所需发酵产物溶解。
在一些实施例中，本发明涉及一种方法，该方法进一步包括第二分离步骤，该第二分离步骤将包含溶解的所需发酵产物的液相与固体生物质分离，任选地在将溶解的第一相与来自第一分离步骤的第一相的一部分或全部混合之后。
本发明基于以下观察：发酵液看起来含有一些对溶解过程有害的组分。数据似乎表明蛋白质(如酶)的高溶解度的最佳条件是具有高酶浓度和低离子浓度的条件。然而，应该理解，本发明不受任何特定理论的限制。已经发现，如果所需产物的溶解可以在不存在发酵液的含有大部分这些不利组分的液体部分的至少一部分的情况下发生，则是有益的。
根据本发明，发酵意指这样一个过程：一种或多种微生物在发酵罐的包含该一种或多种微生物生长所需的所有组分的发酵培养基中生长，从而产生包含该一种或多种微生物、用过的底物组分和一种或多种所需发酵产物的发酵液。如果所需发酵产物的产率足够高，则一部分发酵产物可能在发酵液中发生沉淀，从而形成晶体或无定形沉淀。这在本领域中是公知的，并且本领域已经披露了许多发酵方法、微生物、培养基组分。本发明不受特定发酵方法的限制，只要该发酵方法提供在发酵液中包含至少部分不溶形式(如结晶或无定形形式)的所需发酵产物的发酵液即可。
本领域已经描述了用于发酵微生物以产生所需产物的方法，其中所需产物在发酵期间发生沉淀，例如US 6,316,240、WO 03/050274、WO 93/13125和EP2125865，并且用于发酵微生物的任何这些方法均可以与本发明的方法一起使用。
发酵方法可以是提供包含至少部分不溶形式的所需发酵产物的发酵液的任何合适的发酵方法，如分批发酵、补料分批发酵或连续发酵。
本发明可用于工业规模的任何发酵，例如，用于具有至少50升，如至少500升、如至少5,000升、如至少50,000升的培养基的任何发酵。
发酵产物可以是在发酵液中蓄积的由微生物产生的任何产物。发酵产物可以是初级代谢物、次级代谢物、蛋白质、维生素、激素和碳水化合物。发酵产物优选地选自蛋白质(如酶)。发酵产物甚至可以是两种或更多种所需酶的混合物，例如包含将纤维素降解成低分子量糖(如葡萄糖和纤维二糖)所必需的所有酶的混合物。
在一个实施例中，发酵产物包含选自由氧化还原酶(EC 1)、转移酶(EC2)、水解酶(EC 3)、裂解酶(EC 4)、异构酶(EC 5)和连接酶(EC 6)组成的酶类的组的酶。
在另一个实施例中，酶是具有选自由以下项组成的酶活性的组的活性的酶：氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、甘露聚糖酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、植酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶、溶菌酶、胞壁质酶或木聚糖酶。
优选地，发酵产物是蛋白酶或α-淀粉酶。
适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选的是微生物来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族的(如胰蛋白酶)或S8家族的(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如M4家族的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，如来自M5、M7或M8家族的那些。
术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人，Protein Engng.[蛋白质工程]4(1991)719-737和Siezen等人，Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶的亚组。丝氨酸蛋白酶是特征在于在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的亚组。枯草杆菌酶可以被划分为6个亚类，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是源自芽孢杆菌属的那些，如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)和吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)；以及描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶lentus、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO02/026024和WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢属(Fusarium)蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及来源于纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。
另外优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如描述于例如WO95/23221中)及其变体(描述于WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中)。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际有限公司(GenencorInt.))中的中性金属蛋白酶，如来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的那些。
在一些实施例中，根据本发明的发酵产物包括蛋白酶，如Savinase、BPN'、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、TY145、10R以及这些中的一种的变体，这些变体在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸位置中具有改变，如氨基酸的取代、***或缺失。
在一些实施例中，根据本发明的发酵产物是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的序列具有至少60％序列同一性、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的蛋白酶。
发酵产物可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是细菌或真菌来源的。包括蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。
合适的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:3具有90％序列同一性的变体。优选的变体描述于WO94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424中以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444。
不同的合适的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
其他合适的淀粉酶是包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体。此杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或***的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209和Q264。包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
另外的合适的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或***的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182、或位置H183和G184中具有缺失的那些。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或***的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304和476，使用WO 96/023873的SEQ ID 2用于编号。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置(如181和182、182和183、或位置183和184)中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个中具有取代的那些。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ ID NO:2、WO01/66712中的SEQID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列同一性或与WO 01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列同一性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或***的那些：176、177、178、179、190、201、207、211和264。
另外的合适的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:2具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有C-末端截短和/或取代、缺失或***的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO:2的更优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E和G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183中具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的，并且任选地进一步包含在位置243处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 13184577的SEQ ID NO:1的淀粉酶或其与SEQ IDNO:1具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或***的那些：K176、R178、G179、T180、G181、E187、N192、M199、I203、S241、R458、T459、D460、G476和G477。SEQ ID NO:1的更优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代：K176L、E187P、N192FYH、M199L、I203YF、S241QADN、R458N、T459S、D460T、G476K和G477K，和/或在位置R178和/或S179或T180和/或G181中具有缺失的那些。SEQ IDNO:1的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
E187P+I203Y+G476K
E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K
其中这些变体任选地进一步包含在位置241处的取代和/或在位置178和/或位置179处的缺失。
另外的适合的淀粉酶是具有WO10104675的SEQ ID NO:1的淀粉酶或其与SEQ IDNO:1具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或***的那些：N21、D97、V128、K177、R179、S180、I181、G182、M200、L204、E242、G477和G478。SEQ ID NO:1的更优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代：N21D、D97N、V128I、K177L、M200L、L204YF、E242QA、G477K和G478K，和/或在位置R179和/或S180或I181和/或G182中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N21D+D97N+V128I
其中这些变体任选地进一步包含在位置200处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。
其他合适的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12中的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或***的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K和R458K的变体，以及另外在一个或多个选自下组的位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345和A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。
其他实例是淀粉酶变体，如在WO 2011/098531、WO 2013/001078和WO 2013/001087中描述的那些。
在一些实施例中，根据本发明的发酵产物是与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQID NO:9的序列具有至少60％序列同一性、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的淀粉酶。
发酵产物可以从微生物获得。微生物可以是天然产生发酵产物的生物，或者它可以使用重组DNA技术产生，其中使编码所需发酵产物的基因与适于在预期宿主生物中表达该基因的合适控制序列(如启动子、终止子等)可操作地连接，并***合适的宿主生物中。
微生物可以是原核生物或真核生物。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。***包括但不限于：芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单孢菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、植物解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciensplantarum)亚种、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、***链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus)细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen，1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques[生物技术]6:742-751)或接合(参见例如，Koehler和Thorne，1987，J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人，1988，Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人，2004，Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人，1989，J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下方式来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人，2006，J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下方式来实现：天然感受态(natural competence)(参见例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick，1991，Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝***孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[Ainsworth和Bisby氏真菌字典]，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，英国剑桥大学出版社(UniversityPress,Cambridge,UK))。
真菌宿主细胞可以为酵母细胞。如本文所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner、Passmore和Davenport编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9]，1980)中所描述的那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁弗酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人，1995(见上文)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
真菌细胞可以通过以下过程转化，该过程涉及原生质体形成、原生质体转化以及以本身已知的方式再生细胞壁。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适程序描述于以下文献中：EP 238023，Yelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人，1988，Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的合适方法由Malardier等人，1989，Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente，Abelson、J.N.和Simon,M.I.编辑，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南]，Methods in Enzymology[酶学方法]，第194卷，第182-187页，纽约学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.,New York)；Ito等人，1983，J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
预处理
在根据本发明的分离方法之前，可以对发酵液进行一个或多个预处理步骤，如稀释、调节pH和/或温度，添加能够防止微生物进一步生长的稳定剂，添加能够降低蛋白酶活性并因而限制由蛋白质水解活性引起的降解的抑制剂。
预处理还可以包括裂解步骤，例如，用化学裂解剂(如一种或多种细胞壁降解酶(例如一种或多种溶菌酶))处理发酵液。优选的裂解方法包括添加溶菌酶和/或水解酶以溶解作为细胞或残留的发酵原料的悬浮物质。
第一分离步骤
根据本发明，将包含至少部分呈固体形式的所需发酵产物的发酵液在第一分离步骤中分离成至少以下两个级分：第一级分，该第一级分包含发酵液的液体部分，该液体部分包含可溶形式的所需产物以及其他可溶物，如盐和剩余的可溶性营养物，并且它可能包含细胞及细胞碎片；以及第二级分，该第二级分包含呈固体形式的所需产物、细胞、细胞碎片和其它不溶性物质。在第一分离步骤中产生的第一相也可称为初级浓缩物或滤液。第二相也可称为浆液或淤渣相。
第一级分和第二级分均可包含发酵液的液体部分、细胞及细胞碎片以及呈固体形式的所需产物，但比率完全不同。
第一级分包含发酵液的液体部分的至少60％，例如发酵液的至少70％，例如至少80％，而第二级分包含其余部分。
第二级分包含呈固体形式的所需产物的至少60％，优选至少65％、优选至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％且最优选至少90％。
细胞及细胞碎片在第一相与第二相之间分配，并且比率取决于第一分离步骤中使用的特定分离技术。
第一分离步骤基本上是将固体完全或部分地与液体分离的分离步骤，因此第一分离步骤可以使用本领域已知的用于从液相中分离固体的任何技术进行。第一分离步骤可以使用过滤、倾析或离心或这些技术的任何组合进行，并且分离可以分批或连续进行。
取决于在第一分离步骤中使用的所选分离技术，在分离之前添加一种或多种化学品以帮助分离可能是有益的。例如，如本领域已知的，可以在第一分离过程之前添加一种或多种絮凝剂。絮凝剂的类型和量基于特定的所选发酵液的性质来选择，并且将典型地使用简单的常规实验来确定。这是本领域已知的，并且选择一种或多种絮凝剂的类型和量以促进分离完全在技术人员的技能范围内。例如，可以根据本发明使用WO 2004/001054中披露的方法。
溶解步骤。
使第二相中的所需产物溶解的溶解步骤可以在任何已知的溶解固体产物的方法中进行，典型地涉及用水或含水介质稀释、添加增强溶解的化学品和/或调节pH。
现有技术在例如EP 2125865、US 3,316,240和WO 93/13125中披露了用于溶解蛋白质、尤其是呈固体形式的蛋白质的方法，这些方法也可根据本发明使用。
在一个实施例中，通过用水或含水介质稀释第二相，任选地添加促进溶解的化学品以及降低pH来进行溶解步骤。
在该实施例中，溶解可以通过以下方式进行：基于包含呈固体形式的所需产物的第二相的量将第二相稀释100％-2000％(w/w)；将pH调节至低于6.0的pH值，如低于5.5、如低于5.0、如低于4.5；添加促进溶解的化学品并混合，由此使所需产物溶解。将包含呈固体形式的所需产物的第二相稀释100％-2000％(w/w)，优选100％-1500％(w/w)，更优选100％-1000％(w/w)，且最优选200％-700％(w/w)。
促进溶解的化学品可以是促进溶解过程的任何化学品，例如二价盐，即含有二价金属离子且可溶于淤渣相的任何盐；典型地是包含选自磷酸根、硫酸根、硝酸根、乙酸根、氯离子的阴离子的钙盐、镁盐、铁盐、锌盐。钙盐或镁盐是优选的。基于稀释的第二相，可以以0.01％-5％(w/w)的浓度添加促进溶解的化学品，优选0.01％-1％(w/w)，更优选在0.1％-0.5％(w/w)的范围内。
稀释介质典型地是水或含水介质，如超滤液渗透物或来自蒸发步骤的冷凝物，其从在相同场所进行的另一过程再循环，如在产物回收过程的后续步骤中。
在该实施例中，将发酵液的pH调节至低于pH 6.0、优选低于pH 5.5的pH值，特别是调节至低于5.0的pH值。可以在添加该二价盐之前、同时或之后进行该pH调节。可以将该pH调节至2.0与5.5之间的pH值；优选地调节至2.0与5.0之间的pH值；更优选地调节至3.0与5.0之间的pH值，特别是调节至4.0与5.0之间的pH值。应注意，稀释和添加二价盐以及调节pH这些溶解工艺步骤可以同时或按任何顺序进行。添加二价盐并调节pH后，将发生混合。混合时间将取决于所选温度和所讨论的蛋白质的晶体形态和/或结构。根据本发明，可以溶解超过80％的与细胞团块/不溶物结合的晶体和/或沉淀和/或所需产物；优选地超过85％；更优选地超过90％，特别是可以溶解超过95％的与细胞团块/不溶物结合的晶体和/或沉淀和/或所需产物。
在另一个实施例中，所需产物在第二相中的溶解可以通过以下方式进行：用水或水溶液稀释第二相，以及将pH调节至高pH值，优选地调节至9.5至13范围内，如10至13范围内的pH值。
在又一个实施例中，所需产物在第二相中的溶解通过添加增强所需产物的溶解的化学品来完成。增强溶解的化学品优选地为多元醇，如低分子量聚乙二醇，以及具有至少两个OH基团、优选仅有两个OH基团的C2至C8醇；特别优选的是两个OH基团存在于链中的相邻碳原子上的多元醇，并且该C2-C8醇是脂族的且具有直链碳链。优选的多元醇包括乙二醇、丙二醇、单丙二醇、甘油、低分子量(约900或更低)的聚乙二醇以及它们的混合物。
在一些实施例中，在添加所有成分和调节之后***延长的停留时间，以便允许发生所需产物的溶解。与其他化学方法一样，所需产物的溶解需要时间，并且停留时间可能有利于使更多的产物溶解。原则上，停留时间可延长至所有的所需产物均溶解，但通常而言，可溶性产物与沉淀的产物相比更易于发生降解，例如，被来自发酵液的蛋白酶降解，因此在实践中，技术人员通常会选择相对短的停留时间，以便在溶液中获得尽可能多的所需产物，但避免可溶性产物的过多降解。
该停留典型地可长达12小时，如在0-500分钟的范围内，优选地在15-300分钟的范围内，更优选地在30-90分钟的范围内。
在溶解步骤后，可以使用本领域已知的方法回收所需产物，如从混合物中除去细胞及细胞碎片和其他固体的进一步分离步骤、浓缩、配制、干燥如喷雾干燥、造粒等。
在一些应用中，在溶解步骤之后对混合物进行裂解步骤，如用化学裂解剂(如细胞壁降解酶，例如溶菌酶)处理。优选的裂解方法包括添加溶菌酶或水解酶以溶解作为细胞或残留的发酵原料的悬浮物质。
特定的所选方法将由若干不同的因素决定，如所需产物的预期用途、可用的设备以及第二相中细胞及细胞碎片的量。
第二分离步骤
在优选的实施例中，本发明的方法还包括第二分离步骤，该第二分离步骤从包含溶解的所需产物的混合物中除去细胞及细胞碎片。
在溶解步骤之后，对混合物进行第二分离步骤，该步骤基本上是从包含溶解的所需产物的液体级分中除去固体(如细胞、细胞碎片和源自底物的固体)的固/液分离过程。第二分离可以使用本领域已知用于固/液分离的任何此类设备和方法进行，如离心机、滗析器、过滤等。
取决于在第一分离步骤中使用的所选分离技术，在分离之前添加一种或多种化学品以帮助分离可能是有益的。例如，如本领域已知的，可以在第一分离过程之前添加一种或多种絮凝剂。絮凝剂的类型和量基于特定的所选发酵液的性质来选择，并且将典型地使用简单的常规实验来确定。这是本领域已知的，并且选择一种或多种絮凝剂的类型和量以促进分离完全在技术人员的技能范围内。在一个优选的实施例中，将来自第一分离的第一相的一部分或全部与来自溶解步骤的混合物混合。以这种方式，将两个料流合并，并且所需产物，即在发酵液中呈溶液并因此包含在第一分离步骤的第一相中的部分，以及在发酵液中发生沉淀并因此在第一分离步骤的第二相中结束的部分，可以在随后的下游操作中一起进一步纯化和处理。
这对于第一相包含显著量的呈溶液形式的所需产物的发酵是尤其有益的。通过在第二分离步骤之前或之后将第一相与溶解的第二相混合，将使技术人员能够在下游过程中一起回收所有的所需产物，即第二相中以固体形式存在的部分和第一相中以溶液形式存在的部分两者。
第一分离步骤的第一相和来自溶解步骤的包含溶解的所需产物的料流的混合可以在第二分离步骤之前或之后进行。如果以第一相包含显著量的细胞及细胞碎片的方式进行第一分离，则优选的是，在第二分离步骤之前将第一相加入溶解的第二相中，以便可以在第二分离步骤除去所有细胞及细胞碎片。如果以某种方式进行第一分离步骤，使得第一相不包含细胞及细胞碎片或仅含非常少量的细胞及细胞碎片，例如不到总量的1％；则第一相可以在第二分离步骤之前或之后加入溶解的第二相中。
技术人员将理解，温度可能以各种方式影响该过程；温度可影响溶解动力学，例如溶解在较高温度下进行得更快；温度也可影响所需产物的稳定性，例如当温度升高时，所需产物的稳定性可能降低。这意味着对于给定的回收过程，技术人员将不得不优化温度以获得可能最佳的回收过程，并且进一步意味着对于一种发酵产物而言最佳的温度对于另一种发酵产物可能不是最佳的。这对于技术人员来说都是已知的，并且可以使用典型的常规实验来完成。本发明的方法典型地在0℃-70℃范围内，例如10℃-50℃范围内，通常15℃-45℃范围内的温度下进行。
与现有技术方法(如EP 2 125 865中披露的方法)相比，根据本发明的方法具有以下益处：溶解所需产物所需的体积显著更低。不希望受任何理论的限制，据信，这是因为在发生沉淀的发酵期间存在的大部分盐已经随第一相除去，因此在溶解过程中不存在。这具有以下益处：水消耗和/或增强溶解的化学品显著降低，这除了水和增强溶解的化学品的成本之外还在工业生产规模操作中具有许多显著的额外益处；例如，需要处理的废水的体积减小，并且进一步地，用于处理大体积的容量成本降低，由于需要处理的体积明显更低，因此用于下游处理的设备减少。
此外，根据本发明来溶解沉淀的产物也可以比使用根据现有技术的方法来溶解相同产物更快地进行，使用根据本发明的方法提供通量更高的优点并因此对容量的要求较低。
后续下游操作
可以通过本领域已知的方法进一步分离所得的所需产物。例如，可以通过常规程序回收所需产物，这些程序包括但不限于：例如用于除去任何细菌的进一步过滤；超滤和微滤、离心、萃取、喷雾干燥、蒸发、沉淀或结晶、水解(例如溶菌酶或其他)或其他机械悬浮降解。
优选的实施例
本发明还可通过以下实施例来描述：
实施例1：一种从发酵液中回收所需产物的方法，其中该所需产物以沉淀形式存在于该发酵液中，该方法包括以下步骤：
a)在第一相和第二相中分离该发酵液的第一分离步骤，其中该第一相包含上清液、呈可溶形式的所需产物和任选的细胞及细胞碎片，并且该第二相包含呈沉淀形式的所需产物、细胞及细胞碎片；以及
b)溶解步骤，其中使该第二相中的呈沉淀形式的所需产物溶解。
实施例2.根据实施例1所述的方法，该方法进一步包括第二分离步骤，其中将来自步骤b)的该溶解的所需产物与这些细胞和/或细胞碎片分离。
实施例3.根据实施例1或2所述的方法，其中该第一相包含该发酵液的液体部分的至少60％，例如该发酵液的至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％。
实施例4.根据实施例1-3中任一项所述的方法，其中该第二级分包含呈固体形式的该所需产物的至少60％，优选至少65％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、以及例如至少99％。
实施例5.根据实施例1至4中任一项所述的方法，其中该所需产物选自初级代谢物、次级代谢物、蛋白质、维生素、激素和碳水化合物。
实施例6.根据实施例5所述的方法，其中该所需产物包含一种或多种酶。
实施例7.根据实施例6所述的方法，其中该一种或多种酶选自由氧化还原酶(EC1)、转移酶(EC 2)、水解酶(EC 3)、裂解酶(EC 4)、异构酶(EC5)和连接酶(EC 6)组成的酶类的组。
实施例8.根据实施例7所述的方法，其中该一种或多种酶选自由以下项组成的酶活性的组：氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、甘露聚糖酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、植酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶、溶菌酶、胞壁质酶或木聚糖酶。
实施例9.根据实施例8所述的方法，其中该一种或多种酶选自蛋白酶。
实施例10.根据实施例9所述的方法，其中这些蛋白酶选自枯草杆菌蛋白酶。
实施例11.根据实施例10所述的方法，其中这些蛋白酶选自与SEQ ID NO:1-6之一具有至少80％序列同一性，如至少85％序列同一性、如至少95％序列同一性、如至少96％序列同一性、如至少97％序列同一性、如至少98％序列同一性、如至少99％序列同一性的蛋白酶。
实施例12.根据实施例11所述的方法，其中该蛋白酶是具有SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列的蛋白酶之一的变体，并且这些之一的变体在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸位置中具有改变，如氨基酸的取代、***或缺失。
实施例13.根据实施例8所述的方法，其中该一种或多种酶选自淀粉酶。
实施例14.根据实施例13所述的方法，其中这些淀粉酶选自与SEQ ID NO:7-9之一具有至少80％序列同一性，如至少85％序列同一性、如至少95％序列同一性、如至少96％序列同一性、如至少97％序列同一性、如至少98％序列同一性、如至少99％序列同一性的α-淀粉酶。
实施例15.根据实施例14所述的方法，其中该α-淀粉酶是具有SEQ ID NO:7-9的氨基酸序列的多肽之一的变体，并且这些之一的变体在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸位置中具有改变，如氨基酸的取代、***或缺失。
实施例16.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该所需产物获自微生物。
实施例17.根据实施例16所述的方法，其中该微生物是原核生物或真核生物。
实施例18.根据实施例17所述的方法，其中该微生物是选自以下的原核生物：芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、弯曲菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)。
实施例19.根据实施例18所述的方法，其中该微生物是选自以下的芽孢杆菌属细胞：嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、植物解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens plantarum)亚种、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。
实施例20.根据实施例17所述的方法，其中该微生物是选自以下的真核生物：假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
实施例21.根据实施例20所述的方法，其中该微生物选自：乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
实施例22.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该发酵液在发酵罐中发酵，该发酵罐的体积为至少50升，如至少500升、如至少5,000升、如至少50,000升。
实施例23.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该第一分离步骤使用离心或过滤进行。
实施例24.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该溶解步骤包括：
i.在水或含水介质中将该第二相稀释100％-2000％(w/w)；
ii.添加二价盐；以及
iii.将pH调节至低于6.0的pH值。
实施例25.根据实施例24所述的方法，其中将该第二相稀释100％-2000％(w/w)，优选100％-1500％(w/w)，优选100％-1000％(w/w)，且最优选200％-700％(w/w)。
实施例26.根据实施例24或25所述的方法，其中将该第二相用水、自来水、超滤液渗透物或来自蒸发步骤的冷凝物稀释。
实施例27.根据实施例24-26中任一项所述的方法，其中该二价盐选自包含选自磷酸根、硫酸根、硝酸根、乙酸根和氯离子的阴离子的钙盐、镁盐、亚铁盐和锌盐。
实施例28.根据实施例24-27中任一项所述的方法，其中该二价盐基于该稀释的第二相以0.01％-5％(w/w)，优选0.01％-1％(w/w)，更优选0.1％-0.5％(w/w)范围内的量添加。
实施例29.根据实施例24-28中任一项所述的方法，其中将该pH调节至低于pH6.0，优选低于pH 5.5的pH值，特别是调节至低于5.0的pH值。可以在添加该二价盐之前、同时或之后进行该pH调节。可以将该pH调节至2.0与5.5之间的pH值；优选地调节至2.0与5.0之间的pH值；更优选地调节至3.0与5.0之间的pH值，特别是调节至4.0与5.0之间的pH值。
实施例30.根据实施例1-23中任一项所述的方法，其中该溶解步骤通过以下方式进行：用水或水溶液稀释该第二相，以及将该pH调节至高于9.5的pH值，如调节至9.5至13范围内的pH值，例如调节至10至13范围内的pH值。
实施例31.根据实施例1-23中任一项所述的方法，其中该溶解步骤通过添加增强该所需产物的溶解的化学品来完成。
实施例32.根据实施例31所述的方法，其中该增强所需产物的溶解的化学品是多元醇，如低分子量聚乙二醇或具有至少两个OH基团、优选仅有两个OH基团的C2至C8醇；特别优选的是两个OH基团存在于链中的相邻碳原子上的多元醇，并且该C2-C8醇是脂族的且具有直链碳链。
实施例33.根据实施例32所述的方法，其中该增强所需产物的溶解的化学品选自乙二醇、丙二醇、单丙烯、甘油、分子量低于900Da的聚乙二醇以及它们的混合物。
实施例34.根据实施例1-33中任一项所述的方法，其中该第一分离步骤通过离心或过滤而进行。
实施例35.根据实施例34所述的方法，其中该分离步骤通过使用鼓式过滤器过滤而进行。
实施例36.根据实施例34所述的方法，其中该分离通过使用连续离心机、滗析离心机等离心而进行。
实施例37.根据实施例34-36中任一项所述的方法，其中在该分离之前添加絮凝剂。
实施例38.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中将来自该第一分离步骤的该第一相部分或完全添加到该溶解的第二相中。
实施例39.根据实施例38所述的方法，其中在该第二分离步骤之前，将来自该第一分离步骤的该第一相部分或完全添加到来自步骤b)的溶解料流中。
实施例40.根据前述实施例中任一项所述的方法，该方法包括在该第一分离步骤之前的预处理步骤，该预处理步骤选自：稀释；调节pH和/或温度、添加一种或多种稳定剂、添加一种或多种蛋白酶抑制剂。
实施例41.根据前述实施例中任一项所述的方法，该方法包括在该第二分离步骤之后的一个或多个下游操作，该一个或多个下游操作选自：超滤、蒸发、浓缩、稳定、结晶、喷雾干燥和造粒。
实例
材料与方法
以下实例的发酵液由丹麦凯隆堡的诺维信公司(Novozymes A/S,Kalundborg,Denmark)提供。通过以下方式制备发酵液：在补料分批发酵过程的工业发酵罐中，接种用编码所需蛋白酶的基因转化的地衣芽孢杆菌菌株，该基因与用于表达所述基因的启动子和调控序列可操作地连接。发酵过程终止于所需的产物浓度，此时所需的产物以沉淀形式存在。通过使用显微镜的目视检查，可以清楚地看到，发酵液除了包括细胞及细胞碎片在内的其他固体之外还包含结晶材料。
在下面的实例中，溶解产物的量定义为在经历2333的相对离心力5分钟的样品的上清液中检测到的产物与未离心的样品中检测到的产物的量的比率。
完全溶解定义为当上清液产物浓度处于未离心的样品中测得的浓度的测量不确定度内时发生。该值可以直接测量或通过由多次测量的外推而计算。
在给定的实例中，发酵液的稀释水平用于降低对溶解度有害的组分的浓度。在这些实例中使用的稀释水平的标准是：它足够高以溶解所有产物，但不过量，以最小化用水量和处理体积。
在这些实例中给出的溶解停留时间按照方法或实验方便性来定义，并不一定确保完全溶解。
实例1-Savinase的回收
在该实例中使用来自工业发酵的发酵液，该工业发酵产生具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白酶(Savinase)。
A-根据现有技术的回收
将保持结晶产物酶的发酵液用水稀释10倍(每kg发酵液添加9L水)。添加聚氯化铝和34％(w/w)CaCl2(分别为每kg发酵液25ml和70ml)，并使用乙酸将溶液的pH调节至pH4.2-4.6。使混合物在41℃下停留90分钟，从而使80％以上的产物晶体溶解。总体积略高于发酵液初始体积的10倍。
然后通过标准初级分离方法处理该溶液：通过阳离子和阴离子聚合物絮凝，并离心以将固体与保持溶解产物的液体分离。
然后根据公司规范，在一系列步骤中进一步向下游处理液体部分，以进行最终产物纯化。
B-根据本发明的回收
将保持结晶产物酶的发酵液用水稀释3倍(每kg发酵液添加2kg水)并根据本发明通过离心分离成保持一些细胞及碎片的第一相(液相)以及保持几乎所有的结晶酶和一些细胞及碎片的第二相(浆液)。使用定制设计的离心机进行分离，如US 8889395B2中进一步描述的。第一相和第二相均单独收集。每kg发酵液约产生0.75kg第二相和2.25kg第一相。
然后将保持几乎所有的结晶产物的第二相稀释12-13倍(每kg第二相11-12kg水)。添加聚氯化铝和34％(w/w)CaCl2(分别为每kg第二相2.3ml和23ml)，并使用乙酸将溶液的pH调节至pH 4.2-4.6。使混合物在41℃下停留90分钟，从而使80％以上的晶体溶解。
然后将来自第一分离的第一相添加到经稀释和溶解的第二相中，最终总体积仅略高于培养液初始体积的8倍。这清楚地表明使用根据本发明的方法减少了水消耗和处理体积。
然后通过标准初级分离方法处理该溶液：通过阳离子和阴离子聚合物絮凝，并离心以将固体与保持溶解产物的液体分离。
然后根据公司规范，在一系列步骤中进一步向下游处理液体部分，以进行最终产物纯化。
实例2-Savinase变体
在该实例中使用来自工业发酵的发酵液，该工业发酵产生具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的变体，该变体具有以下取代：Y176A+R170S+A194P。产物发生沉淀，发酵液中富含晶体。
A-根据现有技术的回收。
将保持结晶酶的发酵液用水稀释14倍(每kg发酵液添加13kg水)。添加聚氯化铝和34％(w/w)CaCl2(分别为每kg发酵液25ml和80ml)，并使用乙酸将溶液的pH调节至pH 4.2-4.6。使混合物在42℃下停留90分钟，从而使70％以上的产物晶体溶解。总体积略高于发酵液初始体积的14倍。
然后通过标准初级分离方法处理该溶液：通过阳离子和阴离子聚合物絮凝，并离心以将固体与保持溶解产物的液体分离。
然后根据公司规范，在一系列步骤中进一步向下游处理液体部分，以进行最终产物纯化。
B-根据本发明的回收。
将保持结晶产物酶的发酵液用水稀释3倍(每kg发酵液添加2kg水)并根据本发明通过离心分离成保持一些细胞及碎片的第一相(液相)以及保持几乎所有的结晶酶和一些细胞及碎片的第二相(浆液)。使用定制设计的离心机进行分离，如US 8889395B2中进一步描述的。每kg发酵液约产生0.5kg第二相和2kg第一相。
然后将保持几乎所有的结晶产物的第二相稀释14倍(每kg第二相13kg水)。添加聚氯化铝和34％(w/w)CaCl2(每kg第二相11.4ml和11ml)，并使用乙酸将溶液的pH调节至pH4.2-4.6。使混合物在42℃下停留90分钟，从而使70％以上的晶体溶解。
总体积仅略高于培养液初始体积的7倍，并清楚地表明使用根据本发明的方法减少了水消耗和处理体积。
然后通过标准初级分离方法处理该溶液：通过阳离子和阴离子聚合物絮凝，并离心以将固体与保持溶解产物的液体分离。
然后根据公司规范，在一系列步骤中进一步向下游处理液体部分，以进行最终产物纯化。
实例3-通过鼓式过滤回收Savinase。
在该实例中使用来自工业发酵的发酵液，该工业发酵产生具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白酶(Savinase)。
A-根据现有技术的回收
在该实例中，将保持结晶产物酶的发酵液用自来水稀释10倍(每kg发酵液添加9kg水)，然后每kg发酵液用60ml 34％(w/w)CaCl2溶液和50ml聚氯化铝调节。使用乙酸将pH调节至pH 4.5。使混合物在42℃下停留90分钟，从而使80％以上的晶体溶解。总体积略高于发酵液初始体积的10倍。
B-根据本发明的回收
将保持结晶产物酶的发酵液用自来水稀释3倍(每kg发酵液添加2kg水)，然后每kg发酵液用20.0ml聚氯化铝调节，并使用乙酸将pH调节至pH 4.5。每kg发酵液添加200ml聚阳离子聚合物，以帮助通过鼓式过滤而分离成含有溶解物质的第一相以及保留所有结晶酶、细胞和碎片的第二相。第一相和第二相均收集在单独的储罐中。每kg发酵液约产生1kg第二相和2kg第一相。
然后将保持几乎所有结晶产物、细胞及细胞碎片的第二相用自来水稀释3倍(每kg第二相2kg水)。添加CaCl2(34％(w/w))溶液(每kg第二相18ml)并使用乙酸将pH调节至pH4.5。将混合物静置60分钟，从而使80％以上的晶体溶解。
然后将来自第一分离的第一相添加到经稀释和溶解的第二相中，最终总体积略高于发酵液初始体积的5倍，并清楚地表明使用根据本发明的方法减少了水消耗和处理体积。
实例4-通过离心回收淀粉酶。
在该实例中使用来自工业发酵的发酵液，该工业发酵产生在WO2001/066721的实例8中制备的淀粉酶变体。
A-根据现有技术的回收
在该实例中，将保持结晶产物酶的发酵液用自来水稀释20倍(每kg发酵液添加19kg水)，然后每kg发酵液用95ml 34％(w/w)CaCl2溶液和30ml聚氯化铝调节。使用乙酸将pH调节至pH 5.0。使混合物在50℃下停留20分钟，从而使85％以上的晶体溶解。总体积略高于发酵液初始体积的20倍。
B-根据本发明的回收
将保持结晶产物酶的发酵液在2666RCF下离心5分钟。除去包含生物质和低于5％产物酶的上半部分体积并丢弃。将含有超过95％产物酶的剩余下部级分用自来水稀释30倍(相当于每kg下部级分添加29kg水)，然后每kg发酵液用70ml 34％(w/w)CaCl2溶液和30.0ml聚氯化铝调节，并使用乙酸将pH调节至pH 5.0。使混合物在50℃下停留20分钟，从而使90％以上的晶体溶解。总体积略高于发酵液初始体积的15倍，清楚地表明使用根据本发明的方法减少了水消耗和处理体积。
实例5-基于真菌基的胞壁质酶的回收
该实例的发酵液由丹麦鲍斯韦的诺维信公司(Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)的中试工厂提供。通过以下方式制备发酵液：在补料分批发酵过程的大型中试级发酵罐中，接种用编码胞壁质酶(WO 2013/076253中的SEQ ID NO:4)的基因转化的真菌(里氏木霉)菌株接种，该基因与用于表达所述基因的启动子和调控序列可操作地连接。通过使用显微镜的目视检查，可以清楚地看到，发酵液除了包括细胞及细胞碎片在内的其他固体之外还包含结晶材料。
溶解产物的量在该实例中定义为在经历2333的相对离心力5分钟的样品的上清液中检测到的产物与未离心的样品中检测到的产物的量的比率。
完全溶解定义为当上清液产物浓度处于未离心的样品中测得的浓度的测量不确定度内时发生。该值可以直接测量或通过由多次测量的外推而计算。
在给定的实例中，发酵液的稀释水平用于降低对溶解度有害的组分的浓度。在这些实例中使用的稀释水平的标准是：它足够高以溶解所有产物，但不过量，以最小化用水量和处理体积。
在这些实例中给出的溶解停留时间按照方法或实验方便性来定义，并不一定确保完全溶解。
A-根据现有技术的回收
将保持结晶酶的发酵液用工艺用水(每kg发酵液添加6kg水)稀释7倍。添加聚氯化铝(每kg发酵液15ml)，并用磷酸调节溶液的pH。使混合物在25℃下停留120分钟，从而使75％以上的产物晶体溶解。总体积略高于发酵液初始体积的7倍。
然后通过标准初级分离方法处理该溶液：通过阳离子和阴离子聚合物絮凝，并离心以将固体与保持溶解产物的液体分离。
然后根据公司规范，在一系列步骤中进一步向下游处理液体部分，以进行最终产物纯化。
B-根据本发明的回收
将保持结晶产物酶的发酵液用工艺用水稀释2.5倍(每kg发酵液添加1.5kg水)并根据本发明通过离心分离成保持一些细胞及碎片的第一相(液相)以及保持几乎所有的结晶酶和一些细胞及碎片的第二相(浆液)。使用SB7(韦斯伐里公司(Westfalia))卸料离心机进行分离。第一相和第二相均单独收集。每kg发酵液约产生0.55kg第二相和1.95kg第一相。
然后将保持几乎所有结晶产物的第二相用与常规培养液完全相同的方法处理；稀释7倍(每kg第二相6kg工艺用水)。添加聚氯化铝(每kg第二相15ml)并用磷酸调节溶液的pH。使该混合物在25℃下恰好停留60分钟，从而使85％以上的晶体溶解。
然后将来自第一分离的第一相添加到经稀释和溶解的第二相中，最终总体积约为培养液初始体积的6倍。这表明使用根据本发明的方法减少了水消耗和处理体积并且缩短了溶解时间(更高的溶解产物产率)。
然后通过标准初级分离方法处理该溶液：通过阳离子和阴离子聚合物絮凝，并离心以将固体与保持溶解产物的液体分离。
然后根据公司规范，在一系列步骤中进一步向下游处理液体部分，以进行最终产物纯化。
根据A部分的培养液(CB)和根据B部分的存在于第二相中的浆液的溶解曲线显示在图1中，并且清楚地显示使用根据本发明的方法与传统方法相比溶解进行得更快。该图还显示，与使用现有技术的程序在120分钟后相比，根据本发明在60分钟后即获得了更高的溶解。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 回收方法
<130> 14385-WO-PCT
<160> 9
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 269
<212> PRT
<213> 迟缓芽孢杆菌（Bacillus lentus）
<400> 1
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210> 2
<211> 275
<212> PRT
<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）
<400> 2
Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu
1 5 10 15
His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp
20 25 30
Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His
50 55 60
Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly
65 70 75 80
Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu
85 90 95
Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu
100 105 110
Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly
115 120 125
Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala
130 135 140
Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly
145 150 155 160
Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala
165 170 175
Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val
180 185 190
Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr
195 200 205
Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser
210 215 220
Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn
225 230 235 240
Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys
245 250 255
Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala
260 265 270
Ala Ala Gln
275
<210> 3
<211> 274
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属物种（Bacillus sp.）
<400> 3
Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val
1 5 10 15
Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly
50 55 60
Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val
65 70 75 80
Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn
85 90 95
Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp
100 105 110
Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala
115 120 125
Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg
130 135 140
Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn
145 150 155 160
Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val
165 170 175
Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly
180 185 190
Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr
195 200 205
Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro
210 215 220
His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu
225 230 235 240
Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu
245 250 255
Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala
260 265 270
Ala Gln
<210> 4
<211> 311
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属物种（Bacillus sp.）
<400> 4
Ala Val Pro Ser Thr Gln Thr Pro Trp Gly Ile Lys Ser Ile Tyr Asn
1 5 10 15
Asp Gln Ser Ile Thr Lys Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ile Lys Val Ala
20 25 30
Val Leu Asp Thr Gly Val Tyr Thr Ser His Leu Asp Leu Ala Gly Ser
35 40 45
Ala Glu Gln Cys Lys Asp Phe Thr Gln Ser Asn Pro Leu Val Asp Gly
50 55 60
Ser Cys Thr Asp Arg Gln Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val
65 70 75 80
Leu Ala His Gly Gly Ser Asn Gly Gln Gly Val Tyr Gly Val Ala Pro
85 90 95
Gln Ala Lys Leu Trp Ala Tyr Lys Val Leu Gly Asp Asn Gly Ser Gly
100 105 110
Tyr Ser Asp Asp Ile Ala Ala Ala Ile Arg His Val Ala Asp Glu Ala
115 120 125
Ser Arg Thr Gly Ser Lys Val Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Ser Ser
130 135 140
Ala Lys Asp Ser Leu Ile Ala Ser Ala Val Asp Tyr Ala Tyr Gly Lys
145 150 155 160
Gly Val Leu Ile Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Gly Ser Asn
165 170 175
Thr Ile Gly Phe Pro Gly Gly Leu Val Asn Ala Val Ala Val Ala Ala
180 185 190
Leu Glu Asn Val Gln Gln Asn Gly Thr Tyr Arg Val Ala Asp Phe Ser
195 200 205
Ser Arg Gly Asn Pro Ala Thr Ala Gly Asp Tyr Ile Ile Gln Glu Arg
210 215 220
Asp Ile Glu Val Ser Ala Pro Gly Ala Ser Val Glu Ser Thr Trp Tyr
225 230 235 240
Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His
245 250 255
Val Ala Gly Leu Ala Ala Lys Ile Trp Ser Ala Asn Thr Ser Leu Ser
260 265 270
His Ser Gln Leu Arg Thr Glu Leu Gln Asn Arg Ala Lys Val Tyr Asp
275 280 285
Ile Lys Gly Gly Ile Gly Ala Gly Thr Gly Asp Asp Tyr Ala Ser Gly
290 295 300
Phe Gly Tyr Pro Arg Val Lys
305 310
<210> 5
<211> 188
<212> PRT
<213> 拟诺卡氏菌属物种（Nocardiopsis sp.）
<400> 5
Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser
1 5 10 15
Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr
20 25 30
Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly
35 40 45
Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe
50 55 60
Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr
65 70 75 80
Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile
85 90 95
Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly
100 105 110
Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val
115 120 125
Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly
130 135 140
Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr
165 170 175
Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr
180 185
<210> 6
<211> 412
<212> PRT
<213> 强烈火球菌（Pyrococcus furiosus）
<400> 6
Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gln Val Met Ala Thr
1 5 10 15
Tyr Val Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Ile Thr Ile Gly Ile
20 25 30
Ile Asp Thr Gly Ile Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gln Gly Lys Val
35 40 45
Ile Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr Pro Tyr Asp Asp
50 55 60
His Gly His Gly Thr His Val Ala Ser Ile Ala Ala Gly Thr Gly Ala
65 70 75 80
Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala Pro Gly Ala Lys Leu Ala
85 90 95
Gly Ile Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser Ile Ser Thr Ile
100 105 110
Ile Lys Gly Val Glu Trp Ala Val Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly Ile
115 120 125
Lys Val Ile Asn Leu Ser Leu Gly Ser Ser Gln Ser Ser Asp Gly Thr
130 135 140
Asp Ala Leu Ser Gln Ala Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val
145 150 155 160
Val Val Val Ala Ala Gly Asn Ser Gly Pro Asn Lys Tyr Thr Ile Gly
165 170 175
Ser Pro Ala Ala Ala Ser Lys Val Ile Thr Val Gly Ala Val Asp Lys
180 185 190
Tyr Asp Val Ile Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly
195 200 205
Arg Leu Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Asn Trp Ile Ile Ala Ala
210 215 220
Arg Ala Ser Gly Thr Ser Met Gly Gln Pro Ile Asn Asp Tyr Tyr Thr
225 230 235 240
Ala Ala Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ile Ala
245 250 255
Ala Leu Leu Leu Gln Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys Val Lys
260 265 270
Thr Ala Leu Ile Glu Thr Ala Asp Ile Val Lys Pro Asp Glu Ile Ala
275 280 285
Asp Ile Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr Lys Ala Ile Asn
290 295 300
Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly Tyr Val Ala Asn Lys
305 310 315 320
Gly Ser Gln Thr His Gln Phe Val Ile Ser Gly Ala Ser Phe Val Thr
325 330 335
Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu
340 345 350
Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gln Val Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr
355 360 365
Gly Phe Glu Lys Val Gly Tyr Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr
370 375 380
Ile Lys Val Val Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gln Val Asp Val
385 390 395 400
Val Ser Asp Gly Ser Leu Ser Gln Pro Gly Ser Ser
405 410
<210> 7
<211> 485
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属物种（Bacillus sp.）
<400> 7
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala
245 250 255
Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg
305 310 315 320
His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg
385 390 395 400
Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Ala Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly
435 440 445
Gln Val Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Trp Val Asn Lys
485
<210> 8
<211> 514
<212> PRT
<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）
<400> 8
Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Pro
1 5 10 15
Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn Leu
20 25 30
Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
35 40 45
Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met Gln
85 90 95
Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly Thr
100 105 110
Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln Glu
115 120 125
Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe
145 150 155 160
Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr Lys
165 170 175
Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Asn
180 185 190
Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His Pro
195 200 205
Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn Thr
210 215 220
Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe
225 230 235 240
Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly Lys
245 250 255
Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys Leu
260 265 270
His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp Ala
275 280 285
Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala Phe
290 295 300
Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro Thr
305 310 315 320
Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln Ala
325 330 335
Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe
340 345 350
Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp Tyr
355 360 365
Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile Asp
370 375 380
Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp
385 390 395 400
Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val Thr
405 410 415
Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly
420 425 430
Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val Phe
435 440 445
Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser Asp
450 455 460
Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp Val
465 470 475 480
Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Arg Pro Ile Thr Thr Arg
485 490 495
Pro Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val Ala
500 505 510
Trp Pro
<210> 9
<211> 483
<212> PRT
<213> 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）
<400> 9
Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro
1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln His Trp Arg Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu
20 25 30
Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
35 40 45
Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn
85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr
100 105 110
Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val
115 120 125
Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe
145 150 155 160
Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys
165 170 175
Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn
180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val
195 200 205
Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln
210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240
Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255
Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285
His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
290 295 300
Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser
305 310 315 320
Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly
355 360 365
Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile
370 375 380
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445
Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser
450 455 460
Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr
465 470 475 480
Val Gln Arg
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