基于离子液体双水相系统从铬鞣革屑中提取蛋白质的方法
阅读说明：本技术 基于离子液体双水相系统从铬鞣革屑中提取蛋白质的方法 (Method for extracting protein from chrome tanned leather scraps based on ionic liquid aqueous two-phase system ) 是由 陈朱琦 罗放 赵钦地 蔡伽怡 王思淇 于 2021-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及基于离子液体双水相系统从铬鞣革屑中提取蛋白质的方法,属于铬鞣革屑资源化利用技术领域。将亲水性离子液体、螯合剂和水加入铬鞣革屑中,充分混匀后,得到两相分层溶液；其中上相为离子液体与蛋白质富集相,下相为铬与螯合剂富集相；将两相分层溶液进行分离,向上相分离物中加入蛋白质沉淀剂,使上相分离物中的蛋白沉淀下来,即从铬鞣革屑中脱铬并提取出蛋白质。本发明能高效且有效的从铬鞣革屑中提取出重金属污染物含量小于10mg/kg的蛋白质产物,且收率大于60％,在不使用挥发性有机物、无需高温加热的绿色条件下,实现铬鞣革屑高值化、无害化、资源化利用。(The invention relates to a method for extracting protein from chrome tanned leather scraps based on an ionic liquid aqueous two-phase system, belonging to the technical field of resource utilization of the chrome tanned leather scraps. Adding hydrophilic ionic liquid, a chelating agent and water into the chrome tanned leather scraps, and fully and uniformly mixing to obtain a two-phase layered solution; wherein the upper phase is an ionic liquid and protein-enriched phase, and the lower phase is a chromium and chelating agent-enriched phase; separating the two-phase layered solution, adding protein precipitant into the upper phase, and precipitating protein from the upper phase, i.e. removing chromium from the chrome tanned leather scraps and extracting protein. The method can efficiently and effectively extract the protein product with the heavy metal pollutant content of less than 10mg/kg from the chrome tanning scraps, has the yield of more than 60 percent, and realizes high-valued, harmless and resource utilization of the chrome tanning scraps under the green conditions of no use of volatile organic matters and no need of high-temperature heating.)
技术领域
本发明属于铬鞣革屑资源化利用技术领域，更具体地，涉及基于离子液体双水相系统从铬鞣革屑中提取蛋白质的方法。
背景技术
我国的皮革年产量在全世界属于前列，目前我国生产皮革主要运用的技术为铬鞣法，即使用大量三价铬盐对生皮进行鞣制处理，使生皮变得具有韧性，并使其变得柔软，成为皮革。这种方法虽快速有效且生产出来的革制品品质优良，但会在鞣制过程产生大量的高含铬量固体废物，即为铬鞣革屑，其铬含量为2％～3％不等，该含量远超相关废物标准中所规定的铬重金属限值。铬鞣革屑已被归属为危险废弃物，中国制革业每年会产生大量铬鞣革屑，对其进行无害化资源化处置、处置过程不会造成二次污染的需求与日俱增。目前处置铬鞣革屑所用的工业化技术为酸/碱水解法，该类方法均为首先使用酸性或碱性溶液对铬鞣革屑进行长时间浸泡预处理，然后在酸/碱性条件下加热对铬鞣革屑进行水解，使得铬鞣革屑中与胶原蛋白交联的铬元素可以分离。但该类方法无法分离出铬含量小于10mg/kg的蛋白质产物，且处理过程中易产生大量酸/碱废水，对环境易造成二次污染。该类方法中的水解过程还需要长时间对水解液进行加热处理，处理过程能耗高，对环境不友好。
发明内容
本发明解决了现有技术中从铬鞣革屑中分离蛋白质的铬含量较大，且处理过程中易产生大量酸/碱废水，从而造成污染的技术问题。针对现有情况的需求以及现有技术的缺点，本发明提供了一种基于离子液体双水相系统的铬盐、蛋白质分离技术，该技术可在室温下一步分离胶原蛋白与铬盐，回收铬含量小于10mg/kg的蛋白质产物。由于该方法不使用挥发性有机溶剂，也不需要高温加热，所以几乎不会产生工业废气；由于该方法不需要加热，所以不需要高昂的高温反应设备；由于该方案创新的使用了基于离子液体的双水相分离技术，相较于传统技术，本技术可达到铬与胶原蛋白快速高效分离的效果。
根据本发明的目的，提供了基于离子液体双水相系统从铬鞣革屑中脱铬提取蛋白质的方法，包括以下步骤：
(1)将亲水性离子液体、螯合剂和水加入铬鞣革屑中，充分混匀后，得到两相分层溶液；其中上相为亲水性离子液体与蛋白质富集相，下相为铬离子与螯合剂富集相；所述螯合剂的质量比上水的质量大于等于5:6，所述铬鞣革屑的质量比上亲水性离子液体的质量小于等于1:4；
(2)将步骤(1)得到的两相分层溶液进行分离，向上相分离物中加入蛋白质沉淀剂，使上相分离物中的蛋白沉淀下来，即从铬鞣革屑中脱铬并提取出蛋白质。
优选地，所述上相分离物中的蛋白沉淀下来后，剩下亲水性离子液体与蛋白质沉淀剂的混合液，将所述混合液进行蒸发分离，使蛋白质沉淀剂与亲水性离子液体分离，分离得到的亲水性离子液体能回用于步骤(1)中。
优选地，所述亲水性离子液体为季铵盐类离子液体或咪唑类离子液体。
优选地，所述季铵盐类离子液体为四丁基氢氧化铵、四丁基氯化铵或四丁基醋酸铵；所述咪唑类离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐或1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸盐。
优选地，所述螯合剂为酒石酸盐或乙二胺四乙酸。
优选地，所述酒石酸盐为L-酒石酸钾或酒石酸钾钠。
优选地，所述蛋白质沉淀剂为丙酮、乙醇、甲醇、乙酸、甲酸和硫酸铵中的至少一种。
优选地，步骤(1)中，还包括向铬鞣革屑中加入水合剂。
优选地，所述水合剂为磷酸盐、氢氧化钠、氢氧化钾或双硫腙。
优选地，步骤(1)中，充分混匀的方式为搅拌，所述搅拌的时间大于2.5h。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)目前处理铬鞣革屑所使用的酸/碱水解法无法获得铬含量小于10mg/kg的蛋白质产物，本发明可以在不产生剧毒六价铬的前提下，得到铬含量小于10mg/kg的蛋白质产物，这在一定程度上填补了铬鞣革屑无害化、资源化领域的空白。并且本技术方案操作流程简便、无需加热处理、试剂理论上可以循环使用，符合绿色化工过程要求，对环境友好，规模化生产潜力大，潜在社会效益巨大。
(2)目前针对铬鞣革屑的传统工艺，酸/碱水解法无法分离出铬含量小于10mg/kg纯度的蛋白质产物，其产物后续应用会大受限制。但本发明可以通过基于离子液体的双水相系统对铬鞣革屑中的胶原蛋白进行溶解，对铬进行螯合，最后通过自然分相分层彻底去除污染物，其蛋白质产物可达到铬含量小于10mg/kg。
(3)当向铬鞣革屑水溶液中加入亲液离子(如磷酸根阴离子、酒石酸根阴离子)时，靠近这些离子的水分子将处于电收缩状态，水的氢键网络在此阶段会得到增强，并导致水的氢键网络无法在庞大的有机阳离子周围形成空腔，例如四丁基铵根、咪唑类阳离子等，所以可以有效形成双水相体系。由于在该体系中，下相优选是酒石酸根富集相，而酒石酸根阴离子对三价铬具有较强的螯合能力，可以有效将三价铬从蛋白质大分子侧链上脱除螯合，并进入下相。
(4)本发明中螯合剂的质量比上水的质量大于等于5:6，铬鞣革屑的质量占离子液体的质量小于等于30％，螯合剂的质量比上水的质量大于等于5:6的原因是：螯合剂浓度越大，分配至下相的螯合剂比率就会越高，当其浓度达到5：6时会使得大于99.9％以上的螯合剂进入下相，因此可以将上相的三价铬浓度维持在极低水平，从而达到将铬元素与蛋白质分离的目的，铬鞣革屑的质量比上离子液体的质量小于等于1:4，是因为仅当该比率低于1:4时，离子液体才能有效快速的溶解铬鞣革屑。
(5)目前针对铬鞣革屑的传统工艺，在水解步骤之后均会产生大量的酸性/碱性废水，该类化工废水易对环境造成二次污染，且后续处理步骤繁琐，不能回收。本发明所使用的离子液体、蛋白沉淀剂均可以经过后续分离、纯化步骤进行回收，循环使用，避免大量化工废水排放。
(6)使用传统碱水解法、酸水解法对铬鞣革屑进行处理时，通常需要长时间加热处理已达到最佳的脱铬效果，但长时间在酸/碱条件下进行高温加热处理，对反应器具有较强的耐腐蚀要求，且会存在能耗过高、产生废气对环境造成二次污染的问题。本发明所使用的离子液体具有低蒸汽压、不挥发的性质，且本技术方案可在室温条件下进行，所以能耗较低，且不会排放废气，对环境友好，符合绿色化学过程要求。
附图说明
图1为基于离子液体双水相系统脱铬提取蛋白质的主要工艺流程示意图。
图2为蛋白质产物铬含量随搅拌时间延长的变化。
图3为蛋白质产物铬含量在水合剂加入前后区别。
图4为实施例2所得蛋白质产物氨基酸分布。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
图1为基于离子液体双水相系统脱铬提取蛋白质的主要工艺流程示意图。本发明中基于离子液体双水相系统脱铬提取蛋白质，具体包括以下步骤：
(1)将离子液体、水、螯合剂与铬鞣革屑投入混合搅拌器中，在一定温度条件下搅拌6至10小时，停止搅拌，使其自然形成两相分层，上层为离子液体与胶原蛋白富集相，下层为铬与螯合剂相；所述的离子液体包括但不限于对蛋白质具有溶解性能的季铵盐类离子液体、咪唑类离子液体；
(2)将上一步得到的两相分层溶液进行分离，在上相分离物中加入蛋白沉淀剂，使蛋白质沉淀，并对其混合物进行分离操作，得到固体为蛋白质产物、液体为离子液体与蛋白质沉淀剂的混合物；所述的蛋白沉淀剂包括但不限于丙酮、乙醇、甲醇、乙酸、甲酸、硫酸铵等试剂中的一种或多种混合物，其特征为能使离子液体中的蛋白质发生沉淀现象；
(3)将上一步得到的离子液体与蛋白质沉淀剂混合液体进行蒸发分离操作，分离蛋白质沉淀剂与离子液体，对试剂进行回用。
优选地，步骤(1)中还包括加入水合剂，包括但不限于磷酸盐、强碱类化合物和双硫腙等试剂中的至少一种构成，能促进与离子液体形成自然分相分层现象。
实施例1
本发明基于离子液体双水相系统从铬鞣革屑中脱铬提取蛋白质的方法，包括以下步骤：
(1)将四丁基氢氧化铵(一种季铵盐离子液体)、铬鞣革屑、L-酒石酸钾(具有螯合剂和水合剂的作用)与超纯水进行混合，其比例为四丁基氢氧化铵：水：L-酒石酸钾：铬鞣革屑＝4：6：5：1；
(2)将上述混合物在30℃条件下充分搅拌8h；
(3)对混合物进行静置，待其自然分相分层为上下两层，上层为淡黄色清液，下层为墨绿色清液，取上层淡黄色清液进行下一步操作；
(4)将上层淡黄色清液，加入丙酮、无水乙醇混合溶液(蛋白质沉淀剂)，得到蛋白质产物沉淀；
(5)对蛋白质产物进行三次滤洗，在60℃条件烘干2h，得到最终产品；
(6)将离子液体与蛋白质沉淀剂的混合液体进行蒸馏分离，在80℃条件下将蛋白质沉淀剂蒸馏为气体，然后冷凝回收，得到纯化后的离子液体、纯化后的蛋白质沉淀剂，并进行回用。
(7)蛋白质产物经ICP-OES检测，Cr含量为3.33mg/kg。
实施例2
本发明基于离子液体双水相系统从铬鞣革屑中脱铬提取蛋白质的方法，包括以下步骤：
(1)将四丁基氢氧化铵(一种季铵盐离子液体)、铬鞣革屑、酒石酸钾钠(螯合剂)、磷酸钾(水合剂)与超纯水进行混合，其比例为四丁基氢氧化铵：水：酒石酸钾钠：磷酸钾：铬鞣革屑＝4：6：2：1：1；
(2)将上述混合物在30℃条件下充分搅拌8h；
(3)对混合物进行静置，待其自然分相分层为上下两层，上层为淡黄色清液，下层为墨绿色清液，取上层淡黄色清液进行下一步操作；
(4)将上层淡黄色清液，加入醋酸、乙醇混合溶液(蛋白质沉淀剂)，得到蛋白质产物沉淀；
(5)对蛋白质产物进行三次滤洗，在60℃条件烘干2h，得到最终产品。
(6)蛋白质产物经ICP-OES检测，Cr含量为1.74mg/kg。
图4为实施例2所得蛋白质产物氨基酸分布，证明了产物主要成分为蛋白质。
实施例3
本发明基于离子液体双水相系统从铬鞣革屑中脱铬提取蛋白质的方法，包括以下步骤：
(1)将四丁基氢氧化铵(一种季铵盐离子液体)、铬鞣革屑、L-酒石酸钾(具有螯合剂和水合剂的作用)与超纯水进行混合，其比例为四丁基氢氧化铵：水：L-酒石酸钾：铬鞣革屑＝4：6：5：1；
(2)将上述混合物在30℃条件下充分搅拌8h；
(3)对混合物进行静置，待其自然分相分层为上下两层，上层为淡黄色清液，下层为墨绿色清液，取上层淡黄色清液进行下一步操作；
(4)将上层淡黄色清液，加入丙酮、无水乙醇混合溶液(蛋白质沉淀剂)，得到蛋白质产物沉淀；
(5)对蛋白质产物进行三次滤洗，在60℃条件烘干2h，得到最终产品；
(6)将离子液体与蛋白质沉淀剂的混合液体进行蒸馏分离，在80℃条件下将蛋白质沉淀剂蒸馏为气体，然后冷凝回收，得到纯化后的离子液体、纯化后的蛋白质沉淀剂，并进行回用。
(7)蛋白质产物经ICP-OES检测，Cr含量为6.11mg/kg。
实施例4
本发明基于离子液体双水相系统从铬鞣革屑中脱铬提取蛋白质的方法，包括以下步骤：
(1)将四丁基氢氧化铵(一种季铵盐离子液体)、铬鞣革屑、酒石酸钾(螯合剂)与超纯水进行混合，其比例为四丁基氢氧化铵：水：酒石酸钾：铬鞣革屑＝6：6：5：1；
(2)将上述混合物在30℃条件下充分搅拌8h；
(3)对混合物进行静置，待其自然分相分层为上下两层，上层为淡黄色清液，下层为墨绿色清液，取上层淡黄色清液进行下一步操作；
(4)将上层淡黄色清液，加入醋酸、乙醇混合溶液(蛋白质沉淀剂)，得到蛋白质产物沉淀；
(5)对蛋白质产物进行三次滤洗，在60℃条件烘干2h，得到最终产品。
(6)蛋白质产物经ICP-OES检测，Cr含量为5.32mg/kg。
对比例1
本实施例为证明搅拌时间对铬脱除的必要性而进行的对比实验，具体实施方案为：
(1)将四丁基氢氧化铵(一种季铵盐离子液体)、铬鞣革屑、酒石酸钾钠(螯合剂)、磷酸钾(水合剂)与超纯水进行混合，其比例为四丁基氢氧化铵：水：酒石酸钾钠：磷酸钾：铬鞣革屑＝4：6：2：1：1；
(2)将上述混合物在30℃条件下充分搅拌1h、2.5h、4h；
(3)对混合物进行静置，待其自然分相分层为上下两层，上层为淡黄色清液，下层为墨绿色清液，取上层淡黄色清液进行下一步操作；
(4)将上层淡黄色清液，加入醋酸、乙醇混合溶液(蛋白质沉淀剂)，得到蛋白质产物沉淀；
(5)对蛋白质产物进行三次滤洗，在60℃条件烘干2h，得到最终产品；
(6)该对比例对比结果见图2，对比实施例1，表明当反应时间不足时，无法完全将与胶原蛋白交联的铬螯合脱除。
对比例2
本实施例为证明水合剂，或使用足量的螯合剂替代水合剂对铬脱除的必要性而进行的对比实验，具体实施方案为：
(1)将四丁基氢氧化铵(一种季铵盐离子液体)、铬鞣革屑、酒石酸钾钠(螯合剂)与超纯水进行混合，其比例为四丁基氢氧化铵：水：酒石酸钾钠：铬鞣革屑＝4：6：2：1将上述混合物在30℃条件下充分搅拌1h、2.5h、4h；
(2)对混合物进行静置，待其自然分相分层为上下两层，上层为淡黄色清液，下层为墨绿色清液，取上层淡黄色清液进行下一步操作；
(3)将上层淡黄色清液，加入醋酸、乙醇混合溶液(蛋白质沉淀剂)，得到蛋白质产物沉淀；
(4)对蛋白质产物进行三次滤洗，在60℃条件烘干2h，得到最终产品；
(5)该对比例对比结果见图3，对比实施例2，表明当不加入水合剂，螯合剂加入剂量不足时，分相分层不完全，会导致铬进入蛋白质产物，导致纯化失败。
重金属测量方法：本技术方案中的蛋白质产物中的铬含量按照《GB5009.123-2014食品安全国家标准食品中铬的测定》中的测定方法进行检测。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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