阅读说明：本技术 Pd-l1外泌体的新用途 (Novel application of PD-L1 exosome ) 是由 程芳 刘晓燕 陈红波 苏丹丹 蔡湘仪 徐占雪 颜福霞 杨欣蕊 贺超 伍颖艺 肖有 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了PD-L1外泌体的新用途,本发明在细胞水平和动物水平上研究PD-L1外泌体的新作用,实验发现PD-L1外泌体应用于损伤皮肤表面的新型温敏性凝胶中,可使得阳性的T细胞活性降低,其IL-6,TNF-a分泌减少,TGF-β,VEGF-A等生长因子的表达增加,显著促进了创面收缩和创面再上皮化,加速伤口愈合,PD-L1外泌体可用来制备通过抑制外周血单核细胞PBMC中的T细胞活化(包括增殖和释放生长因子)对损伤组织的过度免疫反应,进而治疗慢性溃疡和/或炎症性疾病的制剂,具有较大的应用前景。(The invention discloses a new application of PD-L1 exosomes, which researches a new effect of PD-L1 exosomes at a cell level and an animal level, experiments show that the PD-L1 exosomes are applied to novel temperature-sensitive gel on the surface of damaged skin, so that the activity of positive T cells can be reduced, the secretion of IL-6 and TNF-a is reduced, the expression of growth factors such as TGF-beta and VEGF-A is increased, wound contraction and wound re-epithelialization are obviously promoted, wound healing is accelerated, and the PD-L1 exosomes can be used for preparing a preparation for treating excessive immunoreaction of damaged tissues by inhibiting T cell activation (including proliferation and growth factor release) in PBMC (peripheral blood mononuclear cells) to treat chronic ulcer and/or inflammatory diseases, and have a larger application prospect.)

PD-L1外泌体的新用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及PD-L1外泌体在制备治疗慢性溃疡和炎症性疾病的制剂的应用。

背景技术

伤口愈合是一个需要多种细胞参与并发挥不同作用的复杂过程，按照时间分期可分为止血期，炎症期，增生期与组织重塑期。主要依赖于表皮组织自然再生的过程。在许多情况下，其所涉及再生的进展情况不足以挽救受到严重创伤的病人。在创伤发生后的最初几天内，炎症细胞和免疫细胞从邻近区域或循环中通过补体、凝血分子和细胞因子聚集到创口部位，以清除创口的细胞碎片和细菌。过度和持续的炎症抑制受损组织愈合，因此抑制损伤组织过度活跃的免疫细胞是治疗慢性溃疡和炎症性疾病的有效方法。

Chen G等(2018)(Chen G,Huang AC,Zhang W,et al.Exosomal PD-L1contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1response.Nature.2018Aug 8.doi:10.1038/s41586-018-0392-8.)发现黑色素瘤细胞会分泌PD-L1阳性的外泌体到循环血液中，与CD8⁺T细胞表面的PD-1结合，抑制T细胞的增殖和细胞毒性能力，削弱机体的抗肿瘤免疫，促进肿瘤的生长，而PD-1抗体疗法有可能抑制这种PD-L1/PD-1结合方式。循环中的外泌体PD-L1水平与IFN-γ水平成正相关，而且在PD-1抗体治疗过程中，对抗体反应好的患者，其外泌体PD-L1水平有明显的上调，可能是肿瘤细胞应对T细胞“复苏”的反馈机制，可用于临床上预测临床预后和区分抗体治疗响应好的患者，以指导临床用药。

但是目前，关于外泌体PD-L1在慢性溃疡和炎症性疾病中的用途还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供外泌体PD-L1在制备治疗致慢性溃疡和炎症性疾病的制剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种嵌有外泌体PD-L1的温敏性凝胶。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明在细胞水平和动物实验水平上发现，PD-L1外泌体可使得CD4、CD8和CD3标记的T细胞活性降低并且抑制外周血单核细胞的成熟与增殖，从而调控机体的免疫反应，抑制其对损伤组织的过度的免疫反应进而对治疗慢性溃疡和炎症性疾病起到良好的治疗作用。

因此本发明首先提供PD-L1外泌体的如下新用途：

PD-L1外泌体在制备治疗慢性溃疡和/或炎症性疾病的制剂的应用。

PD-L1外泌体在制备治疗由于过度免疫而致慢性溃疡和/或炎症性疾病的制剂的应用。

PD-L1外泌体在制备通过抑制免疫与炎症反应、增加生长因子表达从而促进组织修复和再生的制剂中的应用。

PD-L1外泌体在制备促进伤口愈合的药剂中的应用。

PD-L1外泌体在制备免疫抑制剂中的应用。

PD-L1外泌体在制备抑制T细胞活性的制剂中的应用。

PD-L1外泌体在制备抑制外周血单核细胞增殖与成熟的制剂中的应用。

PD-L1外泌体在制备促进细胞生长因子表达的制剂中的应用。所述细胞生长因子为α-SMA、TGF-β，VEGF-A等，从而促进组织修复和再生，例如：促进皮肤修复，促进伤口愈合。

本发明还提供一种制剂，所述制剂包含PD-L1外泌体及其药学上可接受的辅料。

优选地，所述制剂为经皮肤给药的制剂。例如溶液剂，粉剂，洗剂，酊剂，软膏剂、油剂，乳膏剂、凝胶剂、气雾剂、喷雾剂等。通过将上述制剂涂覆、喷洒或喷涂等方式在创伤口，可促进伤口愈合。

优选地，所述制剂为温敏性凝胶。

本发明提供一种嵌有PD-L1外泌体的温敏性凝胶，为将PD-L1外泌体与温敏型水凝胶在35～38℃共孵育10～20min，将外泌体包裹进水凝胶中，即得。

优选地，所述水凝胶为20％PF-127温敏性凝胶。

具体地，本发明是通过在小鼠皮肤损伤模型使用嵌有PD-L1外泌体温敏性凝胶，在体温条件下使其凝胶化并保持PD-L1外泌体覆盖整个伤口。发现PD-L1外泌体可使得CD4、CD8和CD3标记的T细胞活性降低。在PD-L1外泌体存在的情况下，生长因子的表达增加，显著促进了创面收缩和创面再上皮化。结果表明，将PD-L1外泌体应用于损伤皮肤表面的新型温敏性凝胶中，可以加速伤口愈合，这为利用免疫疗法促进组织修复和再生提供了一个新的视角。

因此，所述嵌有PD-L1外泌体温敏性凝胶的下述新用途也在本发明保护范围内：

嵌有PD-L1外泌体温敏性凝胶在制备治疗慢性溃疡和/或炎症性疾病的制剂的应用。

嵌有PD-L1外泌体温敏性凝胶在制备治疗由于过度免疫而致慢性溃疡和/或炎症性疾病的制剂的应用。

嵌有PD-L1外泌体温敏性凝胶在制备促进皮肤修复/伤口愈合的药剂中的应用。

优选地，本发明所述PD-L1外泌体为由经过IFN-γ刺激的黑色素瘤细胞或感染后稳定表达PD-L1的黑色素瘤细胞所得，上述方法获得的外泌体中PD-L1蛋白含量更高。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了PD-L1外泌体的新用途，本发明在细胞水平和动物实验水平上研究PD-L1外泌体的新作用。结果发现PD-L1外泌体应用于损伤皮肤表面的新型温敏性凝胶中，可使得CD4、CD8和CD3标记的T细胞活性降低，TGF-β，VEGF-A等生长因子的表达增加，显著促进了创面收缩和创面再上皮化，加速伤口愈合。所述嵌有PD-L1外泌体的温敏性凝胶可用来制备抑制外周血单核细胞增殖成熟、抑制T细胞活性或抑制对损伤组织的过度免疫反应进而治疗慢性溃疡和炎症性疾病的制剂，具有较大的应用前景；也为利用免疫疗法促进组织修复和再生提供了一个新的视角。

附图说明

图1A为利用qPCR技术检测SK-MEL细胞、IFN-γ刺激的SK-MEL细胞和感染后稳定表达PD-L1的SK-MEL细胞中的PD-L1mRNA水平。

图1B为利用蛋白定量法测定从SK-MEL细胞、IFN-γ刺激的SK-MEL细胞和感染后稳定表达PD-L1的SK-MEL细胞中提取外泌体的含量。

图1C为使用透射电镜所测得的由SK-MEL细胞、IFN-γ刺激的SK-MEL细胞和感染后稳定表达PD-L1的SK-MEL细胞所提取的外泌体形态结构，比例尺为50nm。

图1D为由SK-MEL细胞、IFN-γ刺激的SK-MEL细胞和感染后稳定表达PD-L1的SK-MEL细胞所提取的外泌体的粒径分布情况。

图1E为由SK-MEL细胞、IFN-γ刺激的SK-MEL细胞和感染后稳定表达PD-L1的SK-MEL细胞所提取的外泌体的ZETA电位。

图1F为利用Western blot方法检测由SK-MEL细胞、IFN-γ刺激的SK-MEL细胞和感染后稳定表达PD-L1的SK-MEL细胞所提取的外泌体的PD-L1，外泌体标志物ALIX，CD63，CD81以及内参GAPDH的表达情况。

图2A为利用激光共聚焦显微检测，从左到右分别是，SK-MEL细胞所提取的PD-L1外泌体(红色)；细胞膜染绿光定位感染后稳定表达PD-L1的SK-MEL细胞(红光)；稳定表达PD-1的293T(绿光)摄取PD-L1外泌体(红光)；JURKAT细胞(绿光)摄取PD-L1外泌体(红光)，比例尺为10μm。

图2B为细胞划痕实验，检测由SK-MEL细胞、IFN-γ刺激的SK-MEL细胞和感染后稳定表达PD-L1的SK-MEL细胞所提取的外泌体对于促进HDF细胞和HACAT细胞的愈合情况，并与阴性对照组(无血清培养基培养组)和阳性对照组(bFGF组)比较。

图2C为细胞划痕实验中，24小时后各组细胞迁移率情况表。

图2D为外泌体对外周血单核细胞增殖能力的影响。外泌体，PD-L1外泌体，IFN-γ外泌体，免疫抑制剂他克莫司FK506与外周血单核细胞混合孵育3天；阴性对照组(Negativecontrol)为未加外泌体，PD-L1外泌体，IFN-γ外泌体，免疫抑制剂他克莫司FK506的外周血单核细胞孵育3天；阳性对照组(Positive control)为未经孵育的外周血单核细胞。利用流式细胞仪进行检测。

图3A为温敏性凝胶PF-127的特征。Ⅰ为温敏性凝胶PF-127在室温下的类固态状态，Ⅱ为温敏性凝胶PF-127在4℃的流动状态。

图3B为20％PF-127经过旋转流变仪检测的随温度而变化的流变学粘弹性特征。

图3C为利用扫描电镜检测到的20％PF-127温敏型水凝胶的内部孔径特征。

图3D为利用激光共聚焦显微镜检测HACAT细胞与嵌入温敏型水凝胶的PD-L1外泌体共孵育1,4,8,24小时后的摄取情况。蓝色代表HACAT细胞，绿色代表PD-L1外泌体。比例尺为10μm。图3E为不同时间点HACAT细胞摄取外泌体后的相对荧光强度比较图。

图4A为小鼠伤口愈合图。分为五组，对照组(ctrl)，bFGF组，外泌体组(EV)，IFN-γ外泌体组(EV IFN-γ)，PD-L1外泌体组(EV PD-L1)。选取不同组在造模后第0天，第3天，第7天和第10天的伤口代表性图。

图4B为比较不同实验组与第0天相比的伤口面积变化率。

图4C为对照组(ctrl)，bFGF组，外泌体组(EV)，IFN-γ外泌体组(EV IFN-γ)，PD-L1外泌体组(EV PD-L1)在第7天取样后的皮肤HE图以及检查Ki67的IHC图。

图4D为利用流式分析仪检测对照组(ctrl)，bFGF组，外泌体组(EV)，IFN-γ外泌体组(EV IFN-γ)，PD-L1外泌体组(EV PD-L1)在第7天取样后提取脾脏中的CD8+细胞和CD8+细胞含量。

图4E为利用qPCR检测对照组(ctrl)，bFGF组，外泌体组(EV)，IFN-γ外泌体组(EVIFN-γ)，PD-L1外泌体组(EV PD-L1)在第7天取样后皮肤的mmp9，α-SMA，TGF-β，IL-6，TNF-a，Grazyme B的mRNA水平。

图5为本发明的试验内容。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 PD-L1外泌体提取及检测表征

1、提取SK-MEL细胞、IFN-γ刺激的SK-MEL细胞和感染后稳定表达PD-L1的SK-MEL细胞中的总RNA，用PrimeScript RT-PCR Kit(TaKaRa)进行反转录实验得到cDNA。用荧光定量的方法检测PD-L1的转录水平，即PD-L1的mRNA水平的变化。其中，荧光定量PCR检测以β-actin为内参基因；

荧光定量PCR检测β-actin内参基因的PCR引物序列为：

正向引物F：5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’；

反向引物R：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’；

荧光定量PCR检测PD-L1的转录水平的引物为：

正向引物F：5’-TCCACTCAATGCCTCAAT-3’；

反向引物R：5’-GAAGACCTCACAGACTCAA-3’。

荧光定量PCR结果如图1A所示，IFN-γ刺激的SK-MEL细胞和感染后稳定表达PD-L1的SK-MEL细胞中的PD-L1的mRNA水平是SK-MEL细胞的11.2倍、54.4倍。表明SK-MEL细胞经过IFN-γ刺激和感染PD-L1后能够提升PD-L1的mRNA水平。

2、利用超速离心法提取外泌体。细胞在长到70％左右后，换0.5％无外泌体FBS培养基培养48小时后，收集细胞培养基，离心500xg，10min；2000xg，20min；10000xg，40min，去掉沉淀，上清液再经过离心100000xg，70min，收集外泌体沉淀，加入RIPA裂解液，利用BCA法测定外泌体的蛋白浓度。从SK-MEL细胞、IFN-γ刺激的SK-MEL细胞和感染后稳定表达PD-L1的SK-MEL细胞中提取的外泌体含量无显著差异，每10⁶个细胞能收集到的外泌体总蛋白量为5μg左右，如图1B。

将从SK-MEL细胞、IFN-γ刺激的SK-MEL细胞和感染后稳定表达PD-L1的SK-MEL细胞中提取的外泌体滴加在铜网上，利用醋酸铀负染后，用水洗两遍的铜网在室温下晾干，利用透射电镜检测外泌体的形态特征；结果如图1C所示，所提取的外泌体呈现为圆形的双层膜结构。

利用动态光散射仪检测外泌体的粒径分布和ZETA电位，结果如图1D、1E所示，从SK-MEL细胞、IFN-γ刺激的SK-MEL细胞和感染后稳定表达PD-L1的SK-MEL细胞中提取的外泌体的粒径在100nm左右，ZETA电位为-27mV左右，无显著性差异。

在外泌体中加入5X loading buffer，100℃煮20min，然后在10％SDS-PAGE凝胶中以同样的蛋白总量上样，电泳，80mv，2h，用PEVF膜进行转膜，330mA，90min，用封闭液封闭1h，加入按照说明书的稀释比例配置的一抗ALIX，CD63，PD-L1，CD81和GAPDH，在4℃中慢慢摇动过夜。用相应的二抗孵育2h后，在膜上加入化学发光液，在化学发光仪上曝光。结果如图1F，能够检测到外泌体的特异性蛋白ALIX,CD63,CD81，同时相比于SK-MEL细胞及其分泌的外泌体，IFN-γ刺激的SK-MEL细胞和感染后稳定表达PD-L1的SK-MEL细胞及其外泌体中的PD-L1蛋白含量较多，这说明利用IFN-γ刺激以及感染过表达PD-L1能够提高细胞以及细胞分泌的外泌体中的PD-L1蛋白水平。

实施例2 PD-L1外泌体在细胞水平上的功能检测

用染料CY5.5对悬浮在PBS中的外泌体染色，用50KD超滤管离心去掉多余的染料，在细胞甩片器上固定玻片，随后加外泌体液。利用甩片机进行甩片，1500xg，15min，让细胞贴附于载玻片上，取出后用滤纸吸掉多余的液体，封片，并于激光共聚焦显微镜下进行拍照观察。将带有OFP的PD-L1质粒感染SK-MEL细胞，筛选出稳定表达PD-L1的SK-MEL细胞后，利用染料WGA488将该细胞膜染色，15min后，细胞用4％多聚甲醛固定后进行封片，并于激光共聚焦显微镜下进行拍照观察，证实已成功制备高表达PD-L1的SK-MEL细胞。将带有GFP的PD-1质粒感染293T细胞，筛选出稳定表达PD-1的293T细胞后，将已用CY5.5染色的外泌体加入到细胞中共孵育15min后，细胞用4％多聚甲醛固定后进行封片，并于激光共聚焦显微镜下进行拍照观察其摄取情况，证实PD-L1外泌体可以能够与高表达PD-1水平的293T细胞结合。用染料WGA488染JURKAT细胞的细胞膜15min，离心，再用PBS洗掉多余的染料，将已用CY5.5染色的外泌体加入到细胞中共孵育15min后，利用甩片机进行甩片，1500xg，15min，让细胞贴附于载玻片上，取出后用滤纸吸掉多余的液体，封片，并于激光共聚焦显微镜下进行拍照观察，证实PD-L1外泌体能够与表达PD-1的T细胞结合。以上结果如图2A所示。

将人成纤维细胞HDF细胞和人类永生化表皮细胞HACAT细胞铺在24孔板中，长到60％左右，利用200μL的枪头比着直尺，枪头垂直划痕，用PBS洗三次，去掉划下的细胞，加入无血清培养基以及培养过PBMC细胞的培养基(带有大量的免疫因子)，模拟免疫环境。然后在实验组中加入从SK-MEL细胞、IFN-γ刺激的SK-MEL细胞和感染后稳定表达PD-L1的SK-MEL细胞中提取的外泌体(100ug/ml)，bFGF(2.5ng/ml)作为阳性对照，经过24h后显微镜下拍照观察其细胞愈合情况，如图2B所示。计算细胞迁徙率＝(0h划痕面积-24划痕面积)/0h划痕面积x 100％。如图2C所示，PD-L1外泌体能够有效抑制免疫因子对于细胞愈合的影响。

为了证实PD-L1外泌体能够抑制免疫细胞的增殖，实施PBM细胞的CFSE增殖实验。将健康的人体血液，置于含EDTA的抗凝血离心管中；Ficoll分离液离心提取外周血单个核细胞PBMC细胞，最后加入R10培养基(RPMI 1640，10％FBS，L-glutamine,penicillin/streptomycin)，打散细胞，并计算其细胞数目。在PBMC细胞中加入CFSE染色液(5μM)，在37℃下，避光孵育20min后，加入10％FBS的培养基终止标记，离心洗涤后，加入培养基。不做任何处理的为阴性对照组，在细胞中加入不同类型的外泌体(100ug/ml)和免疫抑制剂他克莫司FK506(100nM)作为实验组，阴性组和实验组需要孵育三天。用CFSE染料染色后未用外泌体和FK506孵育的PBMC细胞，立即做流式检测作为阳性对照组。利用流式细胞仪检测PBMC细胞中CFSE荧光强度，结果如图2D所示，纵坐标代表荧光信号强度，横坐标代表具有CFSE荧光信号的细胞的数量，峰越往右，说明具有CFSE荧光信号的细胞的数量越多，抑制PBMC细胞增殖越强。从图中可看出，PD-L1外泌体能够抑制PBMC细胞的增殖。

实施例3嵌有PD-L1外泌体的温敏性凝胶的制备和表征

称取PF-127(Sigma-Aldrich)粉末，加水溶解，在4℃搅拌1h，配制成20％的温敏型水凝胶，在室温下能够成为凝胶状态(类固态)，在4℃下能够成为流动状态，如图3A所示，I中的水凝胶在室温中已经凝固，不能流动，II为从4℃冰箱中刚取出的水凝胶仍具有流动性质。

利用旋转流变仪测定在0～40℃范围内的20％PF-127温敏型水凝胶的粘性和弹性。升温速度是5℃/min，应变振幅1％，频率为0.159Hz。结果如图3B所示，当温度低于17℃左右时，G＇(弹性模量)＜G〞(粘性模量)，体系近似于粘性液体，当温度高于17℃是，G＇＞G〞，体系近似于类固体胶体。

将20％PF-127温敏型水凝胶先在-80℃冰箱中预冷12h，放置在冷冻干燥箱中15h后取出，常温放置，利用扫描电镜观察水凝胶的内部孔径，如图3C所示，水凝胶呈现多孔结构，表明其具备包被外泌体的功能。

将细胞爬片放在12孔板中，铺HACAT细胞，待细胞长到40％时做外泌体摄取实验。用WGA488染料将外泌体染色，用50KD超滤管离心去除多余的染料后，与20％PF-127温敏型水凝胶在37℃共孵育15min，将外泌体包裹进水凝胶中，然后将嵌有外泌体的水凝胶加入到已去掉培养基的HACAT中，在水凝胶在细胞层凝胶化15min后，加入等量的DMEM培养基，HACAT细胞和外泌体共孵育1h，4h，8h，24h后，用4％多聚甲醛固定HACAT细胞，用DAPI(0.5μg/ml)染细胞核，然后封片，利用激光共聚焦显微镜拍照观察，如图3D所示。比较细胞和外泌体共孵育不同时间的相对荧光强度，如图3E所示，表明水凝胶能够保持外泌体的活性，并且缓缓释放外泌体，并且随着时间的增加，到24h时，相对荧光强度最大表明外泌体释放量最大。

实施例4体内实验验证嵌入PD-L1外泌体的温敏型水凝胶能够促进皮肤修复

(1)小鼠皮肤切割伤模型的建立

实验室用6～8周龄BALB/c小鼠购买广东省中山大学东校区实验动物中心，无菌环境中饲养。BALB/c小鼠先经10％戊巴比妥钠，麻醉后，用脱毛膏进行脱毛，先用75％的乙醇对小鼠的背部皮肤进行消毒，在小鼠背部中脊线处画直径为10mm的圆，用手术剪刀沿着圆圈剪下皮肤。

(2)实验分组及给药方法

将小鼠随机分为5组，每组6只。在伤口敷20％PF-127温敏型水凝胶为对照组，在伤口处敷包裹有bFGF(0.5ng/μL)的20％PF-127温敏型水凝胶为bFGF组，在伤口处敷嵌有从SK-MEL细胞、IFN-γ刺激的SK-MEL细胞和感染后稳定表达PD-L1的SK-MEL细胞中提取的外泌体(1μg/μL)的20％PF-127温敏型水凝胶为EV组、EV IFN-γ组，EV PD-L1组。给药方式是从第3天开始给药到第7天，每次在伤口处敷50μL水凝胶，在第7天取样。每日称量小鼠体重，并对小鼠伤口进行拍照观察，如图4A所示，比较各组小鼠的伤口面积变化情况，如图4B所示，EV IFN-γ组，EV PD-L1组可显著促进了创面收缩和创面再上皮化，加速伤口愈合。

(3)CD4⁺和CD8⁺细胞比例分析

第七天，迅速脱颈椎牺牲小鼠，将小鼠用75％的乙醇浸泡消毒(2～3min)。随后在超净工作台中以无菌操作打开腹腔，取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，并用PBS溶液清洗1～2次，转入放于含预冷PBS溶液的无菌培养皿中；将脾脏置于0.75um筛网上用剪刀剪碎后；倒入PBS溶液清洗，得到脾脏细胞悬液；将细胞悬液4℃离心5min，1500rpm；随后弃上清，在冰上再加入2mL裂红液(ACKlysis buffer)裂解红细胞3～5min，4℃离心5min，1500rpm，去上清。用PBS洗涤离心两次，去上清，加入100μL细胞染色液，向待测样品中分别加入1μL PE-CD4抗体、1μL APC-CD8抗体、1μL FITC-CD3抗体。混匀后，放在冰中避光孵育15min，离心5min，1500rpm；随后弃上清，加入200μL固定液，室温孵育20min，离心5min，1500rpm，随后弃上清，加入300μL PBS重悬，用流式细胞仪对CD4⁺和CD8⁺细胞数进行测定。结果如图4D所示，经过治疗后，相比于对照组的小鼠，经过含PD-L1外泌体的水凝胶治疗的小鼠的脾脏中的CD4+和CD8+细胞数相对较少，表明PD-L1外泌体对于小鼠体内的T细胞有抑制作用。

(4)病理组织学检查

取样时，将小鼠受伤的皮肤剪下，一半的皮肤浸泡在4％多聚甲醛中固定，石蜡包埋、切片、HE染色以及做IHC进行病理切片观察。结果如图4C所示，EV IFN-γ组，EV PD-L1组能够有效地减少皮肤处的炎症反应，促进伤口修复。

(5)检测皮肤中的炎症因子和生长因子水平

提取另一半皮肤中的RNA，检测各组的mmp9，α-SMA，TGF-β，IL-6，TNF-a，Grazyme B的mRNA水平。

其中，荧光定量PCR检测以β-actin为内参基因；

荧光定量PCR检测β-actin内参基因的PCR引物序列为：

正向引物F：5’-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3’；

反向引物R：5’-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3’；

荧光定量PCR检测IL-6的转录水平的引物为：

正向引物F：5’-CCTCTGGTCTTCTGGAGTACC-3’；

反向引物R：5’-ACTCCTTCTGTGACTCCAGC-3’。

荧光定量PCR检测TNF-a的转录水平的引物为：

正向引物F：5’-CATCCTTGCGAGTGTCAGTGA-3’；

反向引物R：5’-CCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3’。

荧光定量PCR检测Granzyme B的转录水平的引物为：

正向引物F：5’-TCTCGACCCTACATGGCCTTA-3’；

反向引物R：5’-TCCTGTTCTTTGATGTTGTGGG-3’。

荧光定量PCR检测MMP9的转录水平的引物为：

正向引物F：5’-GCAGAGGCATACTTGTACCG-3’；

反向引物R：5’-TGATGTTATGATGGTCCCACTTG-3’。

荧光定量PCR检测TGF-β的转录水平的引物为：

正向引物F：5’-CCACCTGCAAGACCATCGAC-3’；

反向引物R：5’-CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC-3’。

荧光定量PCR检测α-SMA的转录水平的引物为：

正向引物F：5’-CCCAGACATCAGGGAGTAATGG-3’；

反向引物R：5’-TCTATCGGATACTTCAGCGTCA-3’。

荧光定量PCR结果如图4E所示，EV IFN-γ组，EV PD-L1组能够减少免疫因子IL-6，TNF-a，Grazyme B的水平，提高mmp9，α-SMA，TGF-β的水平，控制伤口过度的炎症反应，促进伤口修复。

本发明的试验内容如图5所示，综上所述，PD-L1外泌体能够抑制免疫细胞的增殖和成熟，使得阳性的T细胞活性降低，其IL-6，TNF-a，Grazyme B分泌减少，TGF-β，VEGF-A等生长因子的表达增加，结合温敏型水凝胶能够加快伤口修复的速度。所述嵌有PD-L1外泌体的温敏性凝胶可用来制备抑制外周血单核细胞PBMC中的T细胞活化(包括增殖和释放免疫因子)对损伤组织的过度免疫反应，进而治疗慢性溃疡和炎症性疾病的制剂，具有较大的应用前景。