一种受损细胞提取物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种受损细胞提取物及其制备方法和应用 (Damaged cell extract and preparation method and application thereof ) 是由 齐锦生 董福光 栗彦宁 蒋狄 刘佳佳 于 2020-03-20 设计创作，主要内容包括：本发明属于肿瘤细胞诱导分化技术领域,具体涉及一种受损细胞提取物及其制备方法和应用。本发明通过在细胞培养过程中对其进行损伤,使细胞产生应激而激发其修复机制,启动其原始的分化基因表达,从而对恶性程度不同的肿瘤细胞诱导再分化,促使肿瘤细胞继续发育,分化为正常细胞。该受损细胞提取物还能用于促进组织修复。(The invention belongs to the technical field of tumor cell induced differentiation, and particularly relates to an extract of damaged cells, and a preparation method and application thereof. The invention damages the cells in the process of cell culture, so that the cells generate stress to excite the repair mechanism of the cells, and the original differentiation gene expression of the cells is started, thereby inducing and redifferentiating the tumor cells with different degrees of malignancy, promoting the tumor cells to continue to develop and differentiate into normal cells. The damaged cell extract can also be used for promoting tissue repair.)
技术领域
本发明涉及肿瘤细胞诱导分化
技术领域
，特别是涉及一种受损细胞提取物及其制备方法和应用。背景技术
经过多年的努力，肿瘤死亡率却没有明显的下降。目前的治疗方法虽然能够有效杀死肿瘤细胞，但是却不能治愈肿瘤，也不能抑制复发，而且由于严重的副反应，病人的生活质量很差。另一方面，尽管致癌物多种多样，但是肿瘤细胞的生物学特性却是相同的，而且去除致癌物后，肿瘤细胞仍然存活，因此针对病因学的治疗是没有本质意义的。因此，寻找有效治疗在医学领域仍是一个难题。
目前的研究已经发现，肿瘤细胞与胚胎干细胞有很多共同的特征，例如可塑性、免疫逃逸、永生化和表达胚胎特异性蛋白，例如，肝癌细胞与胚胎肝细胞都表达AFP，结肠癌细胞和胚胎肠上皮细胞表达CEA。一些研究也已经表明，干细胞收到异常的增殖信号，从而产生肿瘤细胞。由于肿瘤细胞和胚胎干细胞之间的有很强的相似性，导致目前的放疗、化疗等方法对于肿瘤细胞和正常体细胞、正常组织干细胞、胚胎干细胞产生无区别化杀伤。然而肿瘤细胞最终导致生命死亡，而干细胞却是组织再生所必需的，因此，在肿瘤治疗的过程中给患者带来极大的副作用，严重影响了患者的生存周期和生活质量。
发明内容
针对目前放疗、化疗对于肿瘤细胞和正常体细胞、正常组织干细胞、胚胎干细胞无差别化杀伤的技术问题，本发明提供一种受损细胞提取物。
以及，本发明还提供一种受损细胞提取物的制备方法。
以及，本发明还提供上述受损细胞提取物在制备诱导肿瘤细胞分化产品中的应用。
以及，本发明还提供上述受损细胞提取物在制备促进细胞修复产品中的应用。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种受损细胞提取物，通过在细胞培养过程中给予损害干预因素，在细胞凋亡前从细胞培养介质中提取而得；所述损害干预因素包括化疗药物、放射线照射、磁场、电场、超声、升高培养温度、冷冻、升高或降低所述细胞培养介质渗透压、升高或降低pH中的至少一种；所述细胞包括非肿瘤细胞和/或肿瘤细胞。
发明人通过多年研究发现，肿瘤发生率与组织细胞的再生能力有关：一方面，组织细胞的再生越快则肿瘤发病率越高。例如肠上皮细胞每三天更新一次，食管上皮细胞每周更新一次，因此这些部位的肿瘤发病率很高；胶质细胞经常更新，其来源的肿瘤也很常见；肌肉细胞更新率较低，来自肌肉组织的肿瘤也很罕见；神经细胞更是被认为不更新，几乎不发生肿瘤。另一方面，组织细胞再生能力越强，则越易受到外界环境的刺激而使细胞的基因序列发生变异，肿瘤的发病率越高。从而得出推测：细胞再生是肿瘤发生的内在因素，组织细胞的再生能力与其肿瘤的发生率基本一致。
因此，发明人根据多年研究提出不同于其他研究者的新观点：肿瘤细胞是停留在某一发育阶段的未成熟的细胞，因而呈现为无限增殖的“正常干细胞”或出现细胞“返祖”现象。发育停留在原始阶段，就表现为恶性；停留在较晚发育阶段则表现为良性；停留在中间阶段则表现为间质瘤。尽管肿瘤细胞拥有很多特性，例如血管发生、免疫逃逸、转移等，但仍与组织干细胞之间有惊人的相似之处，目前仍未发现二者之间的截然不同的差别，所以现有技术仍无法将肿瘤细胞与胚胎或组织的干细胞清晰、准确地区分开，从而造成目前化疗、放疗对于肿瘤细胞和正常体细胞、正常组织干细胞、胚胎干细胞的无差别杀伤。
本发明通过对细胞进行损害式培养，使细胞受到损伤而产生应激，激发其修复机制，启动其原始的分化基因表达，从而对恶性程度不同的肿瘤细胞产生诱导再分化，促使不成熟的、停滞在某一发育阶段、容易增值的幼稚状态的肿瘤细胞继续发育，分化为正常细胞。上述细胞提取物的作用机制对于所有肿瘤细胞均能起作用，包括被诊断为恶性肿瘤的细胞。由于本发明对于肿瘤细胞并不是杀害作用，因此对干细胞的正常发育无不良影响，解决了现有技术对于肿瘤细胞和正常体细胞、正常组织干细胞、胚胎干细胞无差别化杀伤的技术难题，为彻底治愈肿瘤提供了一个高效而无毒的全新治疗策略。
细胞受损后的提取物中含有能够启动基因片段修复的物质，可作为启动信号带动细胞继续发育，因此该提取物不仅能够用于诱导肿瘤细胞分化，还能用于促进组织修复。
上述提取物来自于细胞间质、细胞裂解物和细胞分泌物，可进一步进行分离、纯化、加工，根据终产品水溶性、脂溶性等特性的不同以及作用部位的需求提供不同的产品，供给不同药用途径包括注射、输液、口服、局部涂抹等使用。
优选地，所述提取物为可溶组分、不可溶组分中的至少一种。
优选地，所述可溶组分包括小分子多肽、核酸、糖类、脂类、蛋白和酶中的至少一种，其中所述小分子多肽为分子量小于100000道尔顿的多肽。该可溶性组分都可被进一步分离、纯化、加工，以适应不同的临床需求。优选采用分子量小于10000道尔顿的可溶性组分，以避免引起被输入机体的免疫反应。
优选地，所述非肿瘤细胞包括自体、异源或动物的普通细胞和干细胞。这些干细胞不限于可通过商业途径或合法试验获得的骨髓干细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、组织内干细胞等。
优选地，所述干细胞包括人胚胎干细胞和/或动物胚胎干细胞，所述人胚胎干细胞来自未经过体内发育的受精14天以内的人胚胎。
优选地，所述动物胚胎干细胞来自鼠胚组织、鸡胚组织或猪胚组织中的至少一种。实验发现，采用受损后的鸡胚肝细胞提取物、鼠胚肝细胞提取物、猪胚肝细胞提取物均可显著抑制人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖，能够使瘤块逐渐缩小并最终消失，且停药后无复发。
优选地，所述胚胎干细胞为胎肝干细胞，所述胎肝干细胞的分选方法为：分离胎肝，用含EDTA的胰酶充分消化，收集细胞，离心，去上清，用磷酸缓冲盐溶液重悬细胞，离心，去上清，用含有磁珠和CD90抗体的PBS重悬后在4℃孵育30min，加磷酸缓冲盐溶液，离心清洗两遍，去上清，加磷酸缓冲盐溶液重悬细胞，充分吹打细胞后过无菌滤器，得细胞液；将所述细胞液进行层析分离、纯化，被磁珠包裹的胎肝干细胞；其中所述磷酸缓冲盐溶液为含有0.5％wt BSA和0.2Mm EDTA的PBS。经该方法分选得到的胚肝干细胞即可用于制备受损细胞提取物。
以及，本发明实施例还提供一种受损细胞提取物的制备方法：将细胞置于细胞培养介质中培养至细胞丰度达到80-90％，然后继续培养并同时对所述细胞给予损害干预因素，在细胞凋亡前收集所述细胞培养介质并提取；所述给予损害干预因素的方法包括以下至少一种：
向所述细胞培养介质中施加化疗药物；
用放射线照射所述细胞；
将所述细胞置于磁场中；
将所述细胞置于电场中；
将所述细胞置于F＞20KHz的超声环境下；
将所述细胞置于37～45℃或0℃以下的细胞培养介质中；
将所述细胞置于渗透压大于450mOsm/kg或渗透压＜150mOsm/kg以下的细胞培养介质中；
将所述细胞置于pH＞8或pH＜6的细胞培养介质中。
采用上述一种或多种组合的给予损害干预因素的方法可造成细胞损伤，从而能够使细胞启动修复机制，产生能够激活基因片段修复的物质，使所得提取物能够激发细胞继续发育，达到诱导肿瘤分化的作用。以上各种损害干预因素的具体参数以能够使细胞产生损伤为准，不同的细胞所需的参数不同，本领域技术人员可根据具体细胞的特性进行选择。
以及，本发明实施例还提供上述受损细胞提取物在制备诱导肿瘤细胞分化产品中的应用，所述受损细胞提取物来自于与所述肿瘤细胞同源的细胞。如，用于诱导肝癌细胞分化的受损细胞提取物来自于自体、异体或动物的肝组织。
优选地，所述肿瘤细胞包括黑素瘤、神经胶质瘤、肾上腺、膀胱、骨、骨髓、脑、脊柱、胸、颈部、胆囊、神经节、胃肠道、胃、结肠、心脏、肾、肝、肺、肌肉、卵巢、胰、甲状旁腺、阴茎、前列腺、唾液腺、皮肤、脾、睾丸、胸腺、子宫、葡萄胚或乳腺的肿瘤细胞。
优选地，所述受损细胞的受损程度根据所述提取物对肿瘤细胞的诱导分化效果进行选择。
以及，本发明实施例还提供按上述受损细胞提取物在制备促进细胞修复产品中的应用，所述受损细胞提取物来自于与待修复部位同源的细胞。如，用于修复皮肤的受损细胞提取物应来自于自体、异体或动物的皮肤组织。
优选地，所述受损细胞的受损程度根据所述提取物对待修复部位的细胞的修复效果进行选择。
附图说明
图1示出了本发明实施例1中鼠胚肝的胚胎干细胞分离纯化，其中1-A为13.5天鼠胚，1-B为其胚肝，1-C为用IV型胶原酶消化胚肝得到单个细胞，1-D为差速贴壁后得到胚肝干细胞；
图2示出了本发明实施例1中流式细胞术鉴定胚肝干细胞标记分子CD90.1和CD133；
图3示出了本发明实施例1中受损鼠胚肝干细胞诱导肝癌HepG2细胞株形态变化，其中3-A为加入受损鼠胚肝干细胞提取物后HepG2细胞在培养不同时间的显微镜观察结果，3-B加入受损鼠胚肝干细胞提取物后免疫荧光检测HepG2细胞标记分子AFP的含量变化；
图4示出了本发明实施例1中流式细胞术检测得到的加入受损鼠胚肝干细胞提取物后肝癌HepG2细胞凋亡情况；
图5示出了本发明实施例2中加入受损鸡胚肝干细胞提取物后裸鼠癌块生长抑制情况；
图6是本发明的实施例3的不同浓度的硫酸长春新碱作用于肝癌细胞后的上清液的甲胎蛋白(AFP)的mRNA的表达图；
图7是本发明的实施例3的不同浓度的硫酸长春新碱作用于肝癌细胞后的上清液的甲胎蛋白(AFP)的蛋白水平的表达图；
图8是本发明的实施例3的浓度为4μM的硫酸长春新碱水溶液刺激后上清液对肝癌细胞刺激不同时间的甲胎蛋白(AFP)的mRNA的表达图；
图9是本发明的实施例3的浓度为4μM的硫酸长春新碱水溶液刺激后上清液对肝癌细胞刺激不同时间的甲胎蛋白(AFP)的蛋白水平的表达图；
图10是本发明的实施例3的浓度为4μM的硫酸长春新碱水溶液刺激后上清液对肝癌细胞刺激15min后的肝癌分化相关标志物(HNF4α和HNF6)、肝脏肿瘤干细胞标志物(CD133和EpCAM)和增殖相关基因(PCNA和c-Myc)的mRNA的表达图；
图11是本发明的实施例3的浓度为4μM的硫酸长春新碱水溶液刺激后上清液对肝癌细胞刺激15min后的肝癌分化相关标志物(HNF4α和HNF6)、肝脏肿瘤干细胞标志物(CD133和EpCAM)和增殖相关基因(PCNA和c-Myc)的蛋白水平的表达图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供了一种受损细胞提取物，该提取物来自鼠胚肝。
在无菌条件下，取发育13.5d的小鼠胚肝，用含EDTA的胰酶充分消化，收集细胞，离心，去上清，用磷酸缓冲盐溶液重悬细胞，离心，去上清，用含有磁珠和CD90抗体的PBS重悬后在4℃孵育30min，加磷酸缓冲盐溶液，离心清洗两遍，去上清，加磷酸缓冲盐溶液重悬细胞，充分吹打细胞后过无菌滤器，得细胞液；将所述细胞液进行层析分离、纯化，被磁珠包裹的小鼠胚肝干细胞。去除磁珠，将所得鼠胚肝干细胞鉴定后(图1、图2)，在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL的链霉素的DMEM培养基中培养至细胞丰度达到80-90％，然后分为空白对照组、实验组。将HepG2细胞(105)培养于6孔板底的Transwell小室内。将实验组的含有鼠胚肝干细胞的培养基加热至40～43℃，培养4h后，1200rpm离心4min，将上清液(含有细胞间质、细胞裂解物、细胞分泌物的可溶组分和不可溶组分)作为实验组样品。将空白对照组的培养基1200rpm离心4min，将上清液作为空白对照组样品。将实验组样品加入3个含有肝癌HepG2细胞的Transwell小室中，另外3个含有肝癌HepG2细胞的Transwell小室中加入空白对照组样品。培养不同时间后，进行照相观察和指标检测。
结果表明，实验组大多数HepG2细胞变圆、皱缩和漂起，而只有小部分贴壁细胞。说明上述受损后的鼠胚肝干细胞提取物对HepG2的增殖率和癌症标记物AFP显著抑制(参见图3、图4)
实施例2
本发明实施例提供了一种受损细胞提取物，该提取物来自鸡胚肝。
用1×107HepG2 cells注射到裸鼠皮下，以制作荷瘤小鼠模型。在无菌条件下，取发育14.5d的鸡胚肝，用含EDTA的胰酶充分消化，收集细胞，离心，去上清，用磷酸缓冲盐溶液重悬细胞，离心，去上清，用含有磁珠和CD90抗体的PBS重悬后在4℃孵育30min，加磷酸缓冲盐溶液，离心清洗两遍，去上清，加磷酸缓冲盐溶液重悬细胞，充分吹打细胞后过无菌滤器，得细胞液；将所述细胞液进行层析分离、纯化，被磁珠包裹的鸡胚肝干细胞。去除磁珠，将所得鸡胚肝干细胞鉴定后，在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL的链霉素的DMEM培养基中培养至细胞丰度达到80-90％。将含有组鸡胚肝干细胞的培养基置于γ射线(钴60)下照射，照射剂量为1000拉德，照射后72h，1600rpm离心5min，用0.22μm滤膜过滤，得到可溶性组分。将该可溶性组分在荷瘤小鼠的荷瘤部位进行皮下注射，每天一次，每次0.5mL，持续给药15d。连续给药第9天，62％裸鼠肿瘤消退变小。连续给药第15天，80％裸鼠肿瘤消退，变硬变为白色。结果表明，随着打药天数的增加，瘤块逐渐缩小，实验结束时，给药组瘤块完全消失(参见图5)。
实施例3
本实施例提供了一种受损细胞提取物，该提取物来自市售人肝癌细胞系SMMC7721。
将人肝癌细胞系SMMC7721培养在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL的链霉素的DMEM培养基中使细胞丰度达到80-90％，然后在直径为60mm的培养皿或6孔板或12孔板中培养24h，得到SMMC7721细胞液；
将人肝癌细胞系Bel7402培养在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL的链霉素的DMEM培养基中使细胞丰度达到80-90％，然后在直径为60mm的培养皿或6孔板或12孔板中培养24h，得到Bel7402细胞液；
将人肝癌细胞系Huh7培养在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL的链霉素的DMEM培养基中，使细胞丰度达到80-90％，然后在直径为60mm的培养皿或6孔板或12孔板中培养24h，得到Huh7细胞液；
(1)被用于刺激肝癌细胞的硫酸长春新碱(VCR)的浓度优化：
将得到的SMMC7721细胞液、Bel7402细胞液和Huh7细胞液，均分别用浓度为4μM、6μM、8μM或10μM的VCR水溶液刺激30min，离心清洗后，加入含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM培养基继续培养24h。分别取不同浓度VCR刺激的各肝癌细胞的上清液(TSN)，所述TSN中未检出VCR。通过qRT-PCR和Western blot(免疫印迹法)检测TSN中的甲胎蛋白(AFP)的mRNA的表达和AFP蛋白水平的表达，结果如图6、7所示：
图6中，Con为空白对照，由图可知，随着VCR的浓度不同，不同程度的降低AFP的mRNA的表达水平；图7中，GAPDHA(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)蛋白为内参，Con为空白对照，图7中上图为免疫印迹图，图7中下图为AFP蛋白的表达量数值图，由图6、7由图可知，随着加入的VCR的浓度不同，不同程度的降低AFP的mRNA的表达水平和AFP的蛋水平的表达，在VCR在4μM时，对AFP的mRNA的表达和AFP蛋白水平的表达的抑制水平较好，说明VCR可浓度依赖性地降低AFP的mRNA的表达(图6)和AFP蛋白水平的表达(图7)，降低肝癌细胞的增殖和分化。
将浓度为4μM的VCR水溶液刺激后的TSN作为用于抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞分化的前处理条件，进行后续试验。
(2)用于抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞分化的作用时间的确定：
将得到的SMMC7721细胞液、Bel7402细胞液和Huh7细胞液分别均用上述浓度为4μM的VCR水溶液刺激后的TSN作用5min、10min、15min、20min和25min，结果是图8和图9所示：
图8中，Con为空白对照，由图可知，随着作用时间不同，不同程度的降低甲胎蛋白AFP的mRNA的表达水平；图9中，GAPDHA(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)蛋白为内参，Con为空白对照，图9中上图为免疫印迹图，图9中下图为AFP蛋白的表达量数值图，由图8、9由图可知，随着TSN作用时间的不同，不同程度的降低AFP的mRNA的表达水平和AFP的蛋水平的表达，在作用时间为15min时，对AFP的mRNA的表达和AFP蛋白水平的表达的抑制水平较好。可见，VCR水溶液刺激后的TSN呈时间性依赖地降低甲胎蛋白(AFP)的mRNA的表达(图8)和AFP蛋白水平的表达(图9)。
将浓度为4μM的VCR水溶液刺激后的TSN对肝癌细胞刺激15min，进行后续试验。
(3)TSN的作用：
将上述浓度为4μM的VCR水溶液刺激后的TSN分别对SMMC7721细胞液、Bel7402细胞液和Huh7细胞液分别刺激15min后，通过qRT-PCR和Western blot(免疫印迹法)检测TSN对SMMC7721、Bel7402和Huh7细胞分化相关标志物(HNF4α和HNF6)、肝脏肿瘤干细胞标志物(CD133和EpCAM)和增殖相关基因(PCNA和c-Myc)表达的调节作用。
由图10可知，以Con为空白对照，TSN抑制了SMMC7721、Bel7402和Huh7细胞分化相关标志物(HNF4α和HNF6)、肝脏肿瘤干细胞标志物(CD133和EpCAM)和增殖相关基因(PCNA和c-Myc)的mRNA的表达。
由图11可知，以GAPDHA(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)蛋白为内参，Con为空白对照，TSN抑制了SSMMC7721、Bel7402和Huh7细胞分化相关标志物(HNF4α和HNF6)、肝脏肿瘤干细胞标志物(CD133和EpCAM)和增殖相关基因(PCNA和c-Myc)的的蛋白水平的表达。
说明TSN具有促进肝癌细胞分化、抑制肝脏肿瘤干细胞标志物转录、抑制肝癌细胞增殖的作用，可用于制备抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞分化的药物。
实施例4
本发明实施例提供了一种受损细胞提取物，该提取物来自健康小鼠骨髓。
在无菌条件下，取4周龄健康小鼠骨髓，用常规方法进行原代培养，将所得骨髓细胞鉴定后，在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL的链霉素的DMEM培养基中培养至细胞丰度达到80-90％，然后分为空白对照组、实验组。将白血病M2细胞(105)培养于6孔板底的Transwell小室内。将实验组的含有白血病M2细胞的培养基以加入氯化钠的方法调整渗透压至500mOsm/kg培养0.5h，调整渗透压至400mOsm/kg，继续培养36h后，1600rpm离心5min，弃去上清液，重新加入DMEM培养基重悬，1200rpm离心4min，取上清液(主要含有细胞间质、细胞裂解物、细胞分泌物的不可溶组分)作为实验组样品。将空白对照组的培养基1200rpm离心4min，取上清液，制成空白对照组样品。将实验组样品加入3个含有白血病M2细胞的Transwell小室中，另外3个含有白血病M2细胞的Transwell小室中加入空白对照组样品。培养不同时间后进行检测。
结果表明，实验组样品能够诱导白血病M2细胞分化。
实施例5
本发明实施例提供了一种受损细胞提取物，该提取物来自健康大鼠胃部。
在无菌条件下，取4周龄健康大鼠胃内壁全层，用常规方法进行原代培养，将所得胃内壁细胞鉴定后，在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL的链霉素的DMEM培养基中培养至细胞丰度达到80-90％，然后分为空白对照组、实验组。将胃腺癌细胞(105)培养于6孔板底的Transwell小室内。将实验组的含有胃内壁细胞的培养基pH调整至8.5，培养0.5h后，调整pH至7.0，1600rpm离心5min，弃去上清液，重新加入DMEM培养基重悬，继续培养36h后，1200rpm离心4min，取上清液(主要含有细胞间质、细胞裂解物、细胞分泌物的不可溶组分)作为实验组样品。将空白对照组的培养基1200rpm离心4min，取上清液，制成空白对照组样品。将实验组样品加入3个含有胃腺癌细胞的Transwell小室中，另外3个含有胃腺癌细胞的Transwell小室中加入空白对照组样品。培养不同时间后进行检测。
结果表明，实验组样品能够诱导胃腺癌细胞分化。
实施例6
本发明实施例提供了一种受损细胞提取物，该提取物来自健康雌性大鼠子宫。
在无菌条件下，取4周龄健康大鼠子宫内膜，用常规方法进行原代培养，将所得子宫内膜细胞鉴定后，在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL的链霉素的DMEM培养基中培养至细胞丰度达到80-90％，然后分为空白对照组、实验组。将子宫内膜癌细胞(105)培养于6孔板底的Transwell小室内。将实验组的含有子宫内膜细胞的培养基pH调整至5.5，培养1.5h后，调整pH至7.4，1600rpm离心5min，弃去上清液，重新加入DMEM培养基重悬，继续培养36h后，用0.22μm滤膜过滤，得到可溶性组分，作为实验组样品。将空白对照组的培养基用0.22μm滤膜过滤，制成空白对照组样品。将实验组样品加入3个含有子宫内膜癌细胞的Transwell小室中，另外3个含有子宫内膜癌细胞的Transwell小室中加入空白对照组样品。培养不同时间后进行检测。
结果表明，实验组样品能够诱导子宫内膜癌细胞分化。
实施例7
本发明实施例提供了一种受损细胞提取物，该提取物来自猪胚乳腺。
在无菌条件下，取发育90d的家猪胚胎乳腺，用含EDTA的胰酶充分消化，收集细胞，离心，去上清，用磷酸缓冲盐溶液重悬细胞，离心，去上清，用含有磁珠和CD90抗体的PBS重悬后在4℃孵育30min，加磷酸缓冲盐溶液，离心清洗两遍，去上清，加磷酸缓冲盐溶液重悬细胞，充分吹打细胞后过无菌滤器，得细胞液；将所述细胞液进行层析分离、纯化，被磁珠包裹的猪胚乳腺干细胞。将所得猪胚乳腺干细胞鉴定后，在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL的链霉素的DMEM培养基中培养至细胞丰度达到80-90％，然后分为空白对照组、实验组。将乳腺导管腺癌细胞(105)培养于6孔板底的Transwell小室内。将实验组1600rpm离心5min，弃去上清液，加入渗透压为120mOsm/kg的培养基培养0.5h后，1600rpm离心5min，弃去上清液，重新加入DMEM培养基重悬，继续培养36h后，1200rpm离心4min，取上清液(主要含有细胞间质、细胞裂解物、细胞分泌物的不可溶组分)作为实验组样品。将空白对照组的培养基1200rpm离心4min，取上清液，制成空白对照组样品。将实验组样品加入3个含有乳腺导管腺癌细胞的Transwell小室中，另外3个含有乳腺导管腺癌细胞的Transwell小室中加入空白对照组样品。培养不同时间后进行检测。
结果表明，实验组样品能够诱导乳腺导管腺癌细胞分化。
实施例8
本发明实施例提供了一种受损细胞提取物，该提取物来自猪胚皮肤组织。
在无菌条件下，取发育90d的家猪胚胎皮肤组织，用含EDTA的胰酶充分消化，收集细胞，离心，去上清，用磷酸缓冲盐溶液重悬细胞，离心，去上清，用含有磁珠和CD90抗体的PBS重悬后在4℃孵育30min，加磷酸缓冲盐溶液，离心清洗两遍，去上清，加磷酸缓冲盐溶液重悬细胞，充分吹打细胞后过无菌滤器，得细胞液；将所述细胞液进行层析分离、纯化，被磁珠包裹的猪胚皮肤干细胞。将所得猪胚皮肤干细胞鉴定后，在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL的链霉素的DMEM培养基中培养至细胞丰度达到80-90％，然后分为空白对照组、实验组。将皮肤鳞癌细胞(105)培养于6孔板底的Transwell小室内。将实验组的含有猪胚皮肤干细胞的培养基置于3000高斯磁场中，培养1h后，1600rpm离心5min，弃去上清液，重新加入DMEM培养基重悬，继续培养36h后，用0.22μm滤膜过滤，得到可溶性组分，作为实验组样品。将空白对照组的培养基用0.22μm滤膜过滤，制成空白对照组样品。将实验组样品加入3个含有皮肤鳞癌细胞的Transwell小室中，另外3个含有皮肤鳞癌细胞的Transwell小室中加入空白对照组样品。培养不同时间后进行检测。
结果表明，实验组样品能够诱导皮肤鳞癌细胞分化。
实施例9
本发明实施例提供了一种受损细胞提取物，该提取物来自黑素瘤细胞。
将黑素瘤细胞在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL的链霉素的DMEM培养基中培养至细胞丰度达到80-90％，然后分为空白对照组、实验组。将实验组的含有黑素瘤细胞的培养基置于10000伏特的高压电场中，培养0.5h后，1600rpm离心5min，弃去上清液，重新加入DMEM培养基重悬，继续培养36h后，用0.22μm滤膜过滤，得到可溶性组分，作为实验组样品。将空白对照组的培养基用0.22μm滤膜过滤，制成空白对照组样品。另取黑素瘤细胞(105)培养于6孔板底的Transwell小室内。将实验组样品加入3个含有黑素瘤细胞的Transwell小室中，另外3个含有黑素瘤细胞的Transwell小室中加入空白对照组样品。培养不同时间后进行检测。
结果表明，实验组样品能够诱导黑素瘤细胞分化。
实施例10
本发明实施例提供了一种受损细胞提取物，该提取物来自甲状腺细胞。
将甲状腺细胞在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL的链霉素的DMEM培养基中培养至细胞丰度达到80-90％，然后分为空白对照组、实验组。将实验组的含有甲状腺细胞的培养基置于F＞20KHz的超声环境中，培养0.5h后，1600rpm离心5min，弃去上清液，重新加入DMEM培养基重悬，继续培养36h后，用0.22μm滤膜过滤，得到可溶性组分，作为实验组样品。将空白对照组的培养基用0.22μm滤膜过滤，制成空白对照组样品。另取甲状腺癌细胞(105)培养于6孔板底的Transwell小室内。将实验组样品加入3个含有甲状腺癌细胞的Transwell小室中，另外3个含有甲状腺癌细胞的Transwell小室中加入空白对照组样品。培养不同时间后进行检测。
结果表明，实验组样品能够诱导甲状腺癌细胞分化。
实施例11
本发明实施例提供了一种受损细胞提取物，该提取物来自健康小鼠皮肤。
在无菌条件下，取4周龄健康小鼠背部皮肤组织，用常规方法进行原代培养，将所得皮肤细胞鉴定后，在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL的链霉素的DMEM培养基中培养至细胞丰度达到80-90％，然后分为空白对照组、实验组。将实验组的含有皮肤细胞的培养基置于-0℃环境下培养1.5h后，1600rpm离心5min，弃去上清液，重新加入DMEM培养基重悬，继续培养36h后，1200rpm离心4min，取上清液(主要含有细胞间质、细胞裂解物、细胞分泌物的不可溶组分)作为实验组样品。将空白对照组的培养基1200rpm离心4min，取上清液，制成空白对照组样品。
选择新西兰大耳白兔，再其背部脊柱两侧分别建立II度烫伤模型，每天分别在相同时间涂膜相同剂量的实验组样品和空白对照组样品，并进行观察。
结果表明，实验组样品能够促进皮肤组织修复。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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