肿瘤来源外泌体在制备促进破骨分化和骨溶解药物中的用途
阅读说明：本技术 肿瘤来源外泌体在制备促进破骨分化和骨溶解药物中的用途 (Application of tumor-derived exosome in preparation of medicine for promoting osteoclast differentiation and osteolysis ) 是由 鱼丽娟 郝晓柯 于 2021-01-11 设计创作，主要内容包括：本发明属于细胞生物学技术领域,公开了一种外泌体在制备促进破骨分化和骨溶解药物中的用途,骨靶向的前列腺癌外泌体的制备方法包括：分离培养前列腺癌细胞,待细胞融合至70％时,将培养的细胞转移提前收集的无外泌体血清处理的条件培养基中；继续培养48小时；待细胞融合至90％时,收集条件培养上清；采用差速离心的方法分离得到前列腺癌细胞来源外泌体。本发明有效分离制备得到了前列腺癌细胞外泌体,并验证发现前列腺癌细胞外泌体能够靶向骨并与骨基质细胞结合,从而引起体外破骨分化和体内溶骨性改变,导致病理性骨重构,并最终促进肿瘤在骨内的生长。(The invention belongs to the technical field of cell biology, and discloses an application of an exosome in preparing a medicine for promoting osteoclast differentiation and osteolysis, wherein a preparation method of a bone-targeted prostate cancer exosome comprises the following steps: separating and culturing prostate cancer cells, transferring the cultured cells to a conditioned medium without exosome serum treatment collected in advance when the cells are fused to 70%; continuing to culture for 48 hours; collecting conditioned culture supernatant when the cells are fused to 90%; separating to obtain the prostate cancer cell-derived exosome by adopting a differential centrifugation method. The prostate cancer cell exosome is effectively separated and prepared, and the prostate cancer cell exosome is verified and found to be capable of targeting bones and combining with bone matrix cells, so that in-vitro osteoclast differentiation and in-vivo osteolytic change are caused, pathological bone remodeling is caused, and the growth of tumors in the bones is finally promoted.)
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，尤其涉及一种肿瘤来源外泌体在制备促进破骨分化和骨溶解药物中的用途。
背景技术
目前，外泌体是由多种细胞分泌的直径介于30-150nm的细胞外囊泡，具有脂质双分子层。现有研究证实，外泌体在细胞间和器官间信号传递过程中发挥重要作用。
分离出纯度高、生物活性好、适用于下游检测目的外泌体是外泌体研究面临的首要难点。依据2018国际囊泡协会(International Society of Extracellular Vesicles,ISEV)的指南MISEV2018，目前,外泌体的分离方法有多种(超速离心法、蔗糖密度梯度离心法以及聚乙二醇沉淀法等)，尚无统一标准；但是每种分离方法都存在一定的不足：超速离心法分离外泌体纯度高但得率低，且需要专门设备，但因其纯度高，目前仍是外泌体功能研究的首选方法；蔗糖密度梯度离心法前期准备工作繁琐，耗时长，获得的外泌体数量少；聚乙二醇沉淀法虽然有很高的外泌体得率，但因沉淀过程中引入杂质，不能满足后续外泌体内含物分析的要求。
肿瘤转移是肿瘤病人预后不良的最主要原因，但肿瘤转移的机制尚未完全清楚。早在1889年，Stephen Paget就提出了肿瘤转移的“种子-土壤”假说，该假说认为：肿瘤的转移并不是随机发生的，肿瘤细胞更易在特定的靶器官上发生转移。2015年，美国康奈尔大学David Lyden教授团队率先报道，外泌体的整合素决定了肿瘤转移的器官特异性。现有研究已经证实，在肿瘤转移过程中，外泌体能够先于肿瘤细胞到达转移部位，教化转移前微环境，形成肿瘤前转移龛，为肿瘤转移创造土壤。骨作为全身最坚硬的器官，是晚期前列腺癌最常见的转移部位。但骨作为前列腺癌转移靶器官的机制尚不清楚。
与乳腺癌骨转移、肺癌骨转移等不同，前列腺癌被认为是唯一发生成骨性骨转移的肿瘤。现有研究已经证实，前列腺癌外泌体传递的hsa-miR-141-3p和hsa-miR-940能够体外促进成骨细胞分化和成骨性骨转移，但是前列腺癌外泌体自身在骨平衡中的作用和机制尚未清楚。外泌体因其体积小、器官靶向性高、来源于生物本身而非自身合成，目前已经被认为是治疗多种疾病的有效药物载体。据此，骨靶向的外泌体十分有望成为多种骨相关疾病的治疗靶点或药物载体。但是，能够靶向骨的外泌体尚未见报道。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)分离骨靶向的外泌体尚未见报道；
(2)前列腺癌外泌体在前列腺癌与骨交互对话中的作用和机制不清楚
解决以上问题及缺陷的难度为：尚不明确哪种细胞的外泌体能够靶向骨，从而为骨疾病的外泌体治疗方式提供可行性；前列腺癌易发生骨转移，但是前列腺癌外泌体是否能够在体内分布于骨，并通过一定的机制发挥相应功能尚不清楚。
解决以上问题及缺陷的意义为：
明确前列腺癌外泌体能够靶向骨及其在骨平衡中的功能，为开发以外泌体为骨疾病治疗靶点的相关研究奠定基础和技术方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种肿瘤来源外泌体在制备促进破骨分化和骨溶解药物中的用途。
本发明是这样实现的，一种骨靶向的前列腺癌外泌体在制备促进破骨分化和骨溶解药物中的用途。
所述骨靶向的前列腺癌外泌体剂量为10ug。
本发明的另一目的在于提供一种骨靶向的前列腺癌外泌体的制备方法，包括：
步骤一，分离培养前列腺癌细胞，待细胞融合至70％时，弃去培养基，换含无外泌体血清的培养基；
步骤二，继续培养48小时；待细胞融合至90％时，收集条件培养上清；
步骤三，采用差速离心的方法分离得到前列腺癌细胞来源外泌体。
进一步，步骤三中，所述采用差速离心的方法分离得到前列腺癌细胞来源外泌体包括：
将收集的约210mL前列腺癌细胞MDA PCa 2b/C4-2/PC3上清，进行差速离心得到囊泡；并经PBS清洗后得到最终的前列腺癌细胞来源外泌体。
进一步，所述差速离心包括：
首先，于300g下离心10min；
其次，于2000g下离心10min；
再者，于10000g下离心30min；
接着，于120000g下离心70min。随后，PBS重悬后再次1200000g 70min清洗沉淀得到外泌体。
进一步，所述骨靶向的前列腺癌外泌体的制备方法还包括：
当电镜下外泌体呈卵圆形杯托状形态、外泌体的标志物Alix,CD9阳性、NTA分析显示外泌体大小为90-150nm时，骨靶向的前列腺癌外泌体的制备完成。
本发明的另一目的在于验证所述用途中制备的促进破骨分化和骨溶解药物药效的动物模型构建方法，明确前列腺癌外泌体的骨靶向能力及其在骨平衡中的体内外功能，所述动物模型构建方法包括：
(1)将荧光标记的外泌体经尾静脉注射裸鼠后，24小时收集有荧光标记的外泌体裸鼠的胫骨；并在不淬灭荧光的条件下分析荧光；
(2)采用免疫荧光的方法对骨组织中的成骨和破骨细胞进行标记，共定位免疫荧光，分析前列腺癌外泌体被骨组织中的成骨细胞和破骨细胞是否摄取；
(3)体外促进破骨分化；
(4)体外抑制成骨分化；
(5)体内促进骨溶解。
进一步，步骤(2)中，所述共定位包括：前列腺癌细胞来源外泌体与成骨标志物RANKL、OCN共定位，与破骨标志物CTSK、TRAP共定位。
进一步，所述步骤(3)包括：
将前列腺癌外泌体20μg/mL与MC3T3-E1细胞共培养6天，通过体外茜素红染色和mRNA水平分析验证所述前列腺癌外泌体在体外抑制成骨分化。
进一步，所述步骤(3)包括：将10μg前列腺癌外泌体通过尾静脉注射裸鼠每周3次，4周，随后通过micro-CT和trap染色证实前列腺癌外泌体可在体内促进溶骨。
本发明的另一目的在于提供一种骨靶向的前列腺癌外泌体在制备用于治疗骨疾病药物中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明有效分离制备得到了前列腺癌细胞外泌体，并验证发现前列腺癌细胞外泌体能够靶向骨并与骨基质细胞结合，从而引起体外破骨分化和体内溶骨性改变，导致病理性骨重构，并最终促进肿瘤在骨内的生长。
本发明采用差速离心进行外泌体分离制备，于300g 10min去除细胞残留，2000g10min去除细胞碎片；10000g 30min去除大的微囊泡；12 0000g 70min得到囊泡，并经PBS清洗后得到最终的前列腺癌细胞来源外泌体。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的骨靶向的前列腺癌外泌体的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的动物模型构建方法流程图。
图3是本发明实施例提供的外泌体的TEM照片。
图4是本发明实施例提供的采用NTA技术测定的外泌体粒度分布。
图5是本发明实施例提供的Western Blotting检测到的外泌体表面标志物。
图6是本发明实施例提供的尾静脉注射24小时后，带有荧光标记的前列腺癌外泌体与骨内成骨细胞结合；
图7是本发明实施例提供的尾静脉注射24小时后，带有荧光标记的前列腺癌外泌体与骨内破骨细胞结合；
图8是本发明实施例提供的前列腺癌外泌体与BMMs共培养6天，TRAP染色证实前列腺癌外泌体促进破骨分化；
图9本发明实施例提供的前列腺癌外泌体与BMMs共培养6天，mRNA水平分析证实前列腺癌外泌体促进破骨分化；
图10本发明实施例提供的前列腺癌外泌体与MC3T3-E1共培养7天，茜素红染色证实前列腺癌外泌体抑制成骨分化；
图11本发明实施例提供的前列腺癌外泌体与MC3T3-E1共培养7天，ALP染色证实前列腺癌外泌体抑制成骨分化；
图12本发明实施例提供的前列腺癌外泌体与MC3T3-E1共培养7天，成骨标志物mRNA水平证实前列腺癌外泌体抑制成骨分化；
图13本发明实施例提供的前列腺癌细胞尾静脉注射教化裸鼠4周micro-CT显示骨小梁分离度增加；
图14本发明实施例提供的前列腺癌细胞尾静脉注射教化裸鼠4周trap染色结果。
图15本发明实施例提供的前列腺癌外泌体教化骨髓4周后，骨内注射携带luc标记的前列腺癌细胞，观察肿瘤在骨内的生长图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种外泌体在制备促进破骨分化和骨溶解药物中的用途，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的骨靶向的前列腺癌外泌体的制备方法包括：
S101，分离培养前列腺癌细胞，待细胞融合至70％时，弃去培养基，换含无外泌体血清的培养基；
S102，继续培养48小时；待细胞融合至90％时，收集条件培养上清；
S103，采用差速离心的方法分离得到前列腺癌细胞来源外泌体。
步骤S103中，本发明实施例提供的采用差速离心的方法分离得到前列腺癌细胞来源外泌体包括：
将收集的约210mL前列腺癌细胞MDA PCa 2b/C4-2/PC3上清，进行差速离心得到囊泡；并经PBS清洗后得到最终的前列腺癌细胞来源外泌体。
本发明实施例提供的差速离心包括：
首先，于300g下离心10min；
其次，于2000g下离心10min；
再者，于10000g下离心30min；
接着，于120000g下离心70min。随后，PBS重悬后再次1200000g 70min清洗沉淀得到外泌体。
本发明实施例提供的骨靶向的前列腺癌外泌体的制备方法还包括：
当电镜下外泌体呈卵圆形杯托状形态、外泌体的标志物Alix,CD9阳性、NTA分析显示外泌体大小为90-150nm时，则判定骨靶向的前列腺癌外泌体的制备成功。
如图2所示，本发明实施例提供的验证所述用途中制备的促进破骨分化和骨溶解药物药效的动物模型构建方法，所述动物模型构建方法包括：
S201，将荧光标记的外泌体经尾静脉注射裸鼠后，24小时收集裸鼠胫骨；并在不淬灭荧光的条件下观察荧光；
S202，采用免疫荧光的方法对骨组织中的成骨和破骨细胞进行标记，共定位免疫荧光证实前列腺癌外泌体被骨组织中的成骨细胞和破骨细胞摄取；
S203，经体外和体内实验验证前列腺癌外泌体可促进破骨分化和骨溶解。
步骤S202中，本发明实施例提供的共定位包括：前列腺癌细胞来源外泌体与成骨标志物RANKL、OCN共定位，与破骨标志物CTSK、TRAP共定位。
步骤S203中，本发明实施例提供的经体外和体内实验验证前列腺癌外泌体可促进破骨分化和骨溶解包括：
将前列腺癌外泌体20μg/mL与MC3T3-E1细胞共培养6天，通过体外茜素红染色和mRNA水平分析验证所述前列腺癌外泌体在体外抑制成骨分化。
将10μg前列腺癌外泌体通过尾静脉注射裸鼠每周3次，4周，随后通过micro-CT和trap染色证实前列腺癌外泌体可在体内促进溶骨。
步骤S203中，具体包括：体外促进破骨分化；体外抑制成骨分化；体内促进骨溶解。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
以下实施例所用前列腺癌细胞购买自ATCC,所用试剂来源：无外泌体血清(Vivacell,中国)，免疫荧光一抗OCN/RANKL/CTSK/TRAP(Cell signaling technology,美国)，Trap染色(Sigma,美国)，RNA提取(Qiangen,美国)，反转录(Takara,日本)，luc载体构建(汉恒，中国)。
实施例1：采用前列腺癌细胞上清制备骨靶向前列腺癌外泌体的具体制备方法：
1)本发明将靶向骨的前列腺癌外泌体的提取方法进行公开：依据ATCC对相应细胞培养的条件和要求，培养前列腺癌细胞,待细胞融合至70％，换含无外泌体的血清培养基，继续培养48小时待细胞融合至90％，收集条件培养上清；
采用超速离心的方法分离得到前列腺癌细胞来源外泌体,将收集的约210mL前列腺癌细胞上清，分别于300g 10min去除细胞残留，收集上清继续离心，2000g 10min去除细胞碎片；收集上清继续离心，10000g 30min去除大的微囊泡；收集上清继续离心，120000g70min得到含有外泌体的沉淀，并经PBS清洗沉淀后得到最终的前列腺癌细胞来源外泌体。如图3-图5。
将荧光标记的前列腺癌细胞外泌体经尾静脉注射裸鼠后，24小时收集裸鼠胫骨，在不淬灭荧光的条件下观察荧光，随后采用免疫荧光的方法对骨组织中的成骨和破骨细胞进行标记，共定位免疫荧光证实前列腺癌外泌体被骨组织中的成骨细胞和破骨细胞摄取。如图6-图7。
实施例2：实施例1制备的骨靶向的前列腺癌外泌体体外促进破骨分化：
本发明公开前列腺癌外泌体体外促进破骨分化的证据：将前列腺癌外泌体20μg/mL与BMMs共培养6天，通过体外trap染色和mRNA水平分析证实其在体外促进破骨分化。如图8-图9。
实施例3：实施例1制备的骨靶向的前列腺癌外泌体体外抑制成骨分化：
本发明公开前列腺癌外泌体体外抑制成骨分化的证据：将前列腺癌外泌体20μg/mL与MC3T3-E1细胞共培养6天，通过体外ALP染色、茜素红染色和mRNA水平分析证实其在体内抑制成骨分化。如图10-12。
实施例4：实施例1制备的骨靶向的前列腺癌外泌体体内促进溶骨：
本发明公开前列腺癌外泌体体内促进溶骨的证据：将10μg前列腺癌外泌体通过尾静脉注射裸鼠4周，随后通过micro-CT和trap染色证实前列腺癌外泌体在体内促进溶骨。如图13-图14。
实施例5：实施例1制备的骨靶向的前列腺癌外泌体体外体内促进肿瘤在骨内的生长。
本发明公开前列腺癌外泌体体内促进肿瘤在骨内生长的证据：前列腺癌外泌体教化骨髓4周后，骨内注射携带luc标记的前列腺癌细胞，观察肿瘤在骨内的生长。如图15。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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