阅读说明：本技术 一种负载肿瘤外泌体的凝胶体系及其制备方法和应用 (A kind of gel rubber system and its preparation method and application loading tumour excretion body ) 是由 郝永伟 南文滨 王帆 陈红丽 张其清 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于创面修复技术领域,具体涉及一种负载肿瘤外泌体的凝胶体系、制备方法及应用。本发明提供了一种肿瘤外泌体tEVs用于促进创面愈合的新用途,并获得了用tEVs悬浮液与凝胶材料制备的凝胶体系tEVs/GG-cl-Im-Ba,该凝胶体系能够显著缩短高糖小鼠创面愈合的时间,提高创面愈合率,具有促进创面愈合的功效。(The invention belongs to wound repair technical fields, and in particular to a kind of to load the gel rubber system of tumour excretion body, preparation method and application.The present invention provides the new applications that a kind of tumour excretion body tEVs is used for wound healing, and obtain the gel rubber system tEVs/GG-cl-Im-Ba prepared with tEVs suspension and gel rubber material, the gel rubber system can significantly shorten the time of high sugared wounds in mice healing, Wound healing rate is improved, has effects that wound healing.)

一种负载肿瘤外泌体的凝胶体系及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于创面修复技术领域，具体涉及一种负载肿瘤外泌体的凝胶体系、制备方法及应用。

背景技术

创伤是正常皮肤或组织在外界致伤因子的作用下所导致的损害，常见的创伤有手术切开、擦伤、烧伤、供皮区、褥疮、下肢血管性溃疡、糖尿病溃疡以及其它难愈合性创面等，对机体的功能产生重大的影响。而创面的自然愈合期限较长，容易导致创面感染。为了加速创伤的愈合，减少创面的感染，传统方法一般采用敷料覆盖和保护的方法进行治疗，但是以纱布、棉垫及合成纤维为主的传统敷料虽然经济便宜，但易造成创面的二次损伤和感染，逐渐被淘汰。

而临床可用的促进创面愈合药物非常有限，主要是生长因子类药物及生长激素类药物。但是，该类药物的使用具有一定的局限性。凝胶材料由于具有良好的吸湿性和载药性能，成为创面愈合常用的敷料和药物载体。目前常用的创面敷料以明胶、胶原蛋白或透明质酸钠为主，添加壳聚糖或各种抗菌剂制备而成，其中胶原蛋白本身具有一定的创面修复作用，而壳聚糖为常用的抑菌成分，具有一定的抗菌消炎作用，主要通过抑制细菌来加快愈合速度，但是对于创面愈合率的影响较小，并且该类敷料成分复杂，成本较高，制备工艺繁琐，交联强度低，力学性能差。

糖尿病足溃疡是一种复杂疾病，其创面的愈合还需要成纤维细胞的增殖、迁移。外泌体是细胞分泌的一种外囊泡，包裹有各种非编码核酸、蛋白等物质。目前肿瘤外泌体的研究主要集中于调控功能、诊断潜能、作为药物载体等方面。本发明意外地发现，三阴性乳腺癌4T1肿瘤细胞来源的外泌体tEVs具有促进创面愈合的作用，特别对于糖尿病足溃疡的愈合具有促进作用。

本发明经过筛选以瓜尔豆胶(GG)与Im-Ba(由对二苯胺和甲酰基苯硼酸反应合成)制备的凝胶材料GG-cl-Im-Ba为药物载体，并负载tEVs形成的复合凝胶体系不仅具有成本低，方法简单，快速成胶的优点，而且能够在创面环境下快速崩解，释放药物，对于创面的愈合具有较好的促进作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种tEVs在制备促进创面愈合药物中的新用途，其特征在于，所述tEVs为来源于三阴性乳腺癌4T1肿瘤细胞的外泌体。

本发明的另一目的在于提供一种凝胶体系，所述凝胶体系是由瓜尔豆胶、Im-Ba和tEVs组成，所述Im-Ba的结构式如下式(Ⅰ)所述：

本发明的另一目的在于提供一种凝胶体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配置Im-Ba溶液：称取Im-Ba样品，配置成Im-Ba溶液，调节pH至8-9；

(2)tEVs混悬液的制备：将tEVs分散于PBS缓冲溶液中，配置成tEVs混悬液；

(3)瓜尔豆胶溶液的配置：将瓜尔豆胶粉末溶解，制成瓜尔豆胶溶液；

(4)复合凝胶的制备：将步骤(2)所述的tEVs悬液加入到步骤(3)所述的瓜尔豆胶溶液中搅拌混匀，再加入步骤(1)所述的Im-Ba溶液混合均匀，即得复合凝胶。

优选地，所述步骤(1)中的Im-Ba浓度为0.5％-3％m/v，所述步骤(2)中tEVs混悬液的浓度为1.2×10⁹-1.2×10¹¹个/ml，所述步骤(3)中瓜尔豆胶溶液的浓度为1％-5％。

优选地，所述步骤(1)中的Im-Ba浓度为1％m/v，所述步骤(2)中tEVs混悬液的浓度为1.19×10¹⁰个/ml，所述步骤(3)中瓜尔豆胶溶液的浓度为3％。

优选地，所述步骤(4)中按体积比加入tEVs混悬液5-50份，瓜尔豆胶溶液10-50份，Im-Ba溶液5-40份。

优选地，所述步骤(4)中按体积比加入tEVs混悬液20份，瓜尔豆胶溶液30份，Im-Ba溶液10份。

本发明的另一目的在于提供一种凝胶体系在制备促进创面愈合可注射纳米复合水凝胶体系中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种凝胶体系在制备促进创口愈合凝胶和/或敷料中的应用。

优选地，所述创面为高糖创面。

本发明的有益效果是：①本发明提供的一种来源于三阴性乳腺癌4T1肿瘤细胞的外泌体tEVs具有促进创面愈合的作用；②以凝胶材料GG-cl-Im-Ba为药物载体复合tEVs形成的新型复合凝胶tEVs/GG-cl-Im-Ba能够响应创面部位高ROS特殊环境自动崩解释放tEVs，能够促进创面愈合，提高创面愈合率，对创面愈合尤其是高糖创面的愈合具有良好的促进作用。

附图说明

图1生物相容性实验结果

图2高糖小鼠创面愈合实验结果

具体实施方式

本发明所述的凝胶体系是通过瓜尔豆胶与Im-Ba通过链式聚合交联，并负载tEVs获得。下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。

实施例1凝胶体系的制备

配置Im-Ba溶液：称取Im-Ba干燥样品，配置成浓度为1％m/v的Im-Ba溶液，并用1MNaOH溶液调节至PH 8-9；

tEVs混悬液的制备：采用超速离心法从80ml三阴性乳腺癌4T1细胞培养上清中提取外泌体tEVs，并溶解于200μL PBS缓冲溶液中，配置成tEVs浓度为1.19×10¹⁰个/ml的tEVs混悬液，4℃保存备用；

瓜尔豆胶溶液的配置：称取瓜尔豆胶粉末36mg，溶于850μL去离子水中，500g磁力搅拌，直至瓜尔豆胶完全溶解，配置成瓜尔豆胶溶液，冷却至室温；

复合凝胶的制备：取上述配置好的瓜尔豆胶溶液300μL，加入tEVs悬液200μL，磁力搅拌混匀，得混合液；再加入Im-Ba溶液150μL，500g磁力搅拌30s，即得凝胶体系tEVs/GG-cl-Im-Ba。

实施例2凝胶体系tEVs/GG-cl-Im-Ba生物组织相容性评价

取4周龄雄性C57BL/6(C57)小鼠分为三组平行对照，每组3只，分别在每组小鼠腿部皮下注射0.5ml的复合凝胶tEVs/GG-cl-Im-Ba，4天后取腿部皮下注射周围的组织切片，采用苏木精-伊红(HE)染色法评价复合凝胶tEVs/GG-cl-Im-Ba在体内的生物相容性。

HE染色结果如图1所示，在小部位鼠注射复合凝胶tEVs/GG-cl-Im-Ba后，腿部肌肉并没有出现炎症细胞，说明复合凝胶tEVs/GG-cl-Im-Ba的免疫原性较低，安全性高。

实施例3高糖小鼠创面愈合实验

3.1凝胶的制备

根据实施例1制备获得tEVs/GG-cl-Im-Ba；

GG-cl-Im-Ba的制备：称取Im-Ba干燥样品，配置成浓度为1％m/v的Im-Ba溶液，并用1M NaOH溶液调节pH至8-9；称量0.1g瓜尔豆胶粉末，溶于10mL 60℃的去离子水中，60℃，500g磁力搅拌，直至瓜尔豆胶完全溶解，得到透明的瓜儿豆胶溶液；待瓜尔豆胶溶液冷却后，取300μL，并加入50μL Im-Ba溶液，500g磁力搅拌，即得GG-cl-Im-Ba。

3.2实验过程

4周龄，雄性C57BL/6(C57)小鼠18只，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。将小鼠随机均分为对照组和水凝胶(GG-cl-Im-Ba)组和复合凝胶组(tEVs/GG-cl-Im-Ba)，所有动物治疗和外科手术均按照中国新乡医学院伦理委员会的要求开展，小鼠自由饮水和进食。其中GG-cl-Im-Ba仅仅是由实施例1所述由瓜儿豆胶溶液与Im-Ba溶液混合制备的；tEVs/GG-cl-Im-Ba由实施例1制备获得。

链脲佐菌素(STZ)诱导高血糖动物模型的制备：C57小鼠腹腔注射用枸橼酸盐缓冲液(0.1M，pH 4.2)中溶解的STZ，剂量为55mg/kg。诱导1周建立高血糖动物模型；高血糖动物模型建立成功标准：用血糖仪监测血糖水平，随机血糖≥18mmol/L，即为模型构建成功。

创面模型构建：用5％三溴乙醇麻醉小鼠，在小鼠背部建立1cm²的皮肤创面，创面深至筋膜组织。

创面愈合实验：创面模型构建完成后，单独饲养小鼠。对照组小鼠创面用含0.2mlpH 7.4的PBS溶液的敷料处理后包扎，水凝胶组小鼠创面用含0.2ml GG-cl-Im-Ba水凝胶的敷料处理后包扎；复合凝胶组小鼠创面用含0.2ml凝胶体系tEVs/GG-cl-Im-Ba的敷料处理后包扎；所有小鼠每两天处理包扎一次，保证每次处理包扎时PBS溶液或水凝胶与创面的接触时间至少为6h，在创面处理前和处理包扎过程中用数码相机测量并记录创面大小，直至伤口完全愈合。

3.3实验结果

实验结果：如图2所示，处理至第7天时，复合凝胶tEVs/GG-cl-Im-Ba组小鼠的创面愈合率高于50％，与对照组和水凝胶组相比，具有显著性差异；处理至第21天时，复合凝胶tEVs/GG-cl-Im-Ba组小鼠的创面愈合基本完全愈合。实验结果证明，包含肿瘤外泌体tEVs的复合凝胶tEVs/GG-cl-Im-Ba能够缩短高糖小鼠创面愈合的时间，具有促进创面愈合的作用。