阅读说明：本技术 一种携载化疗药物的抗肿瘤微泡的制备方法、药剂及应用 (Preparation method, medicament and application of anti-tumor microvesicle carrying chemotherapeutic drugs ) 是由 金红林 于 2020-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种携载化疗药物的抗肿瘤微泡的制备方法、药剂及应用,包括以下步骤：1)原代肿瘤细胞培养与传代；2)将所述步骤1)得到的培养于培养皿中的原代肿瘤细胞进行X线照射,继续培养；3)将所述步骤2)得到的细胞与化疗药物共孵育,收集上清液,获得携载化疗药物的微泡。本发明还提供一种携带化疗药物的抗肿瘤微泡,由抗肿瘤微泡纯化浓缩得到。本发明提供的携载化疗药物的抗肿瘤微泡的制备方法制得的抗肿瘤微泡可用于制备抗肿瘤药物,可实现对肿瘤更高效的杀伤效应,拓展放疗与化疗的适应范围。(The invention relates to a preparation method, a medicament and application of an anti-tumor microbubble carrying chemotherapeutic drugs, which comprises the following steps: 1) culturing and subculturing primary tumor cells; 2) carrying out X-ray irradiation on the primary tumor cells cultured in the culture dish obtained in the step 1), and continuing culturing; 3) co-incubating the cells obtained in the step 2) with a chemotherapeutic drug, and collecting supernatant to obtain the microvesicles carrying the chemotherapeutic drug. The invention also provides an anti-tumor microbubble carrying chemotherapeutic drugs, which is obtained by purifying and concentrating the anti-tumor microbubble. The anti-tumor microvesicle prepared by the preparation method of the anti-tumor microvesicle carrying chemotherapeutic drugs can be used for preparing anti-tumor drugs, can realize more efficient killing effect on tumors, and expands the application range of radiotherapy and chemotherapy.)

一种携载化疗药物的抗肿瘤微泡的制备方法、药剂及应用

技术领域：

本发明涉及抗肿瘤技术领域，具体地，涉及一种携载化疗药物的抗肿瘤微泡的制备方法、药剂及应用。

背景技术：

放疗导致的旁观者效应(radiation-induced bystander effect，RIBE)是指射线辐射细胞后，不仅会导致被照射细胞死亡，还会导致未收到辐射的周围细胞死亡。RIBE的主要原理是辐射细胞产生的微泡中含有高含量的ROS以及其它一些DAMP损伤分子，该微泡能够被周围肿瘤细胞高效摄取，导致肿瘤细胞的间接死亡。前期的研究揭示，单独注射肿瘤细胞放疗后产生的微泡能够有效治疗和延缓肿瘤的发生发展，证明了自体来源的肿瘤细胞微泡具有重要的临床应用价值。

化疗是临床常见的对中晚期肿瘤进行治疗的一种手段，但是最近的研究揭示，部分肿瘤会产生多药耐药性，其产生原理主要与肿瘤细胞受到刺激后高表达多药耐药相关蛋白相关，并且大大减低化疗药物对肿瘤细胞的在体毒性作用。更多研究专注于结合不同肿瘤治疗方式防止肿瘤细胞多药耐药性的产生，从而实现对在体肿瘤的有效杀伤以及减小对正常器官的损伤。专利号为ZL201910031298.5的专利通过使用放疗照射肿瘤细胞后，细胞将大量分泌富含ROS的微泡，将富含ROS的细胞微泡和免疫激活剂物理混合制成抗肿瘤疫苗，能产生较强的体外和***内DC激活效应，起到防止肿瘤复发的效果。但是这种方法制得的抗肿瘤疫苗只能防止已有肿瘤的复发，对于防止肿瘤细胞产生多药耐药性效果不佳。

发明内容

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(一)解决的技术问题：

本发明旨在提供一种携载化疗药物的抗肿瘤微泡的制备方法、药剂及应用，将携载化疗药物的肿瘤细胞放疗后取得的微泡用于肿瘤治疗，可实现放疗一体化的有效治疗手段，解决现有技术存在局限性，在进行放疗后存在肿瘤细胞多药耐药性的问题。

(二)技术方案：

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种携载化疗药物的抗肿瘤微泡的制备方法，包括以下步骤：

1)获得离体肿瘤细胞在培养皿中培养原代肿瘤细胞，进行增殖传代；

2)将由所述步骤1)得到的放于培养皿中的所述原代肿瘤细胞进行X线照射，继续进行培养；

3)将所述步骤2)得到的细胞与溶解于培养基中的化疗药物一同孵育一段时间，收集上清液进行超滤离心，得到的微泡即为含有化疗药物的抗肿瘤微泡；

4)将所述步骤3)得到的携载所述化疗药物的所述抗肿瘤微泡使用紫外分光光度计或者高效液相色谱进行鉴定，携带的所述化疗药物具有特异性的紫外光谱吸收特性或者能够在高效液相色谱中观察到化疗药物组分。

进一步地，步骤3)中所述离心包括依次进行的第一离心、第二离心、第三次离心，所述第一离心的转速为1000g，时间为10分钟；继续进行第二离心的转速为14000g，时间为2分钟，得上清；第三离心的转速为14000g，时间为60分钟，得沉淀即为携载化疗药物的所述抗肿瘤微泡。

进一步地，所述步骤2)的X线放射剂量为2-30Gy，X线能量为6MV；所述上清液收集时间为放疗后的第2-7天，所述化疗药物包括烷化剂、抗代谢类药物或抗生素。

进一步地，所述离体肿瘤细胞为自体来源的肿瘤或肿瘤细胞系产生的肿瘤细胞。所述肿瘤细胞系包括人源性和鼠源性的多种细胞系，人乳腺癌细胞系MCF-1、HBL-100,人肺癌细胞系A549、H292、H1299、Calu-1、H460、H522，人鼻咽癌细胞系5-8F、CNE-2、SUNE-1、HONE1，小鼠黑色素瘤细胞系B16，小鼠肺癌细胞系Lewis细胞。

进一步地，所述离体肿瘤细胞来自于恶性胸腔积液或实体瘤。

进一步地，所述烷化剂为环磷酰胺，所述抗代谢类药物为甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶或吉西他滨，所述抗生素为阿霉素或丝裂霉素。

进一步地，所述抗肿瘤微泡为携载化疗药物的微囊泡结构，所述微囊泡结构的粒径为100-1000nm，所述抗肿瘤微泡的携载化疗药物的剂量可通过紫外分光光度计或者高效液相色谱检测。

一种携载化疗药物的抗肿瘤微泡药剂，由所述抗肿瘤微泡通过纯化浓缩而获得。

一种携化疗药物的抗肿瘤微泡的制备方法制得的所述抗肿瘤微泡在制备抗肿瘤药物中的应用。

(三)有益效果：

①对不能进行放射治疗的肿瘤，可以采用本技术制得抗肿瘤微泡药剂实现间接放疗；

②对化疗不敏感或者存在多药耐药性的肿瘤，可以采用本技术制得抗肿瘤微泡药剂实现化疗药物对肿瘤的高效杀伤；

③相较于放疗和化疗，本技术可通过静脉注射药剂，反复多次给药，可实现对转移瘤起到抑制作用；

④自体来源的微泡携载化疗药物制得的药剂具有较好的生物安全性和生物相容性；

⑤制备工艺简单，便于规模化生产。

附图说明：

图1为本发明携载化疗药物所述抗肿瘤微泡的电镜图；

图2为本发明携载化疗药物放疗微泡的粒径图；

图3为本发明携载阿霉素的放疗微泡与单独阿霉素杀伤肿瘤细胞能力的统计图；

图4为本发明携载阿霉素的放疗微泡在治疗Lewis细胞制备的小鼠恶性胸水模型中能够诱导较高数量的CD3阳性T细胞的募集分析图；

图5为本发明携载甲氨蝶呤的放疗微泡治疗Lewis细胞制备的小鼠恶性胸水模型的小鼠生存分析图；

图6为本发明携载顺铂的放疗微泡治疗Lewis细胞制备的小鼠恶性胸水模型的小鼠生存分析图；

图7为本发明携载阿霉素的放疗微泡治疗Lewis细胞制备的小鼠恶性胸水模型的小鼠生存分析图；

图8为本发明注射携载阿霉素的放疗微泡***后的小鼠体重统计分析图；

具体实施方式

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以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明涉及一种携载化疗药物的抗肿瘤微泡的制备方法、药剂及应用，所述抗肿瘤微泡来源于放射线处理肿瘤细胞而产生；所述化疗药物为临床常见化疗药物。携载化疗药物的所述抗肿瘤微泡，具有广谱的抗肿瘤活性，可有效杀伤自体来源和非自体来源的肿瘤细胞。可对化疗不敏感的肿瘤或者无法直接放疗的肿瘤进行有效治疗，即可局部给药，也可以静脉全身给药。其抗肿瘤原理主要涉及微泡携载的大量活性氧和化疗药物的联合肿瘤杀伤作用，以及调控肿瘤免疫微环境，如促进巨噬细胞的重编程。携载化疗药物的所述抗肿瘤微泡完全来自自体肿瘤细胞，生物安全性和生物相容性好。

一种携载化疗药物的抗肿瘤微泡的制备方法，包括以下步骤：

1)获得离体肿瘤细胞在培养皿中培养原代肿瘤细胞，进行增殖传代；

2)将由所述步骤1)得到的放于培养皿中的所述原代肿瘤细胞进行X线照射，继续进行培养；

3)将所述步骤2)得到的细胞与溶解于培养基中的化疗药物一同孵育一段时间，收集上清液进行超滤离心，得到的微泡即为含有化疗药物的抗肿瘤微泡；

4)将所述步骤3)得到的携载所述化疗药物的所述抗肿瘤微泡使用紫外分光光度计或者高效液相色谱进行鉴定，携带的所述化疗药物具有特异性的紫外光谱吸收特性或者能够在高效液相色谱中观察到化疗药物组分。

步骤3)中所述离心包括依次进行的第一离心、第二离心、第三次离心，第一离心的转速为1000g，时间为10分钟；继续进行第二离心的转速为14000g，时间为2分钟，得上清；第三次离心的转速为14000g，时间为60分钟，得沉淀即为携载化疗药物的所述抗肿瘤微泡。

所述步骤2)的X线放射剂量为2-30Gy，X线能量为6MV；所述上清液收集时间为放疗后的第2-7天，所述化疗药物包括烷化剂、抗代谢类药物或抗生素。

所述离体肿瘤细胞为自体来源的肿瘤或肿瘤细胞系产生的肿瘤细胞。所述肿瘤细胞系包括人源性和鼠源性的多种细胞系，人乳腺癌细胞系MCF-1、HBL-100,人肺癌细胞系A549、H292、H1299、Calu-1、H460、H522，人鼻咽癌细胞系5-8F、CNE-2、SUNE-1、HONE1，小鼠黑色素瘤细胞系B16，小鼠肺癌细胞系Lewis细胞。

所述离体肿瘤细胞来自于恶性胸腔积液或实体瘤。

所述烷化剂为环磷酰胺，所述抗代谢类药物为甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶或吉西他滨，所述抗生素为阿霉素或丝裂霉素。

所述抗肿瘤微泡为携载化疗药物的微囊泡结构，微囊泡结构的粒径为100-1000nm，所述抗肿瘤微泡的携载化疗药物的剂量可通过紫外分光光度计或者高效液相色谱检测。

一种携载化疗药物的抗肿瘤微泡药剂，由所述抗肿瘤微泡通过纯化浓缩而获得。

一种携化疗药物的抗肿瘤微泡的制备方法制得的所述抗肿瘤微泡在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的具体原理如下：

放疗后肿瘤微泡被证实是产生RIBE的主要原因。放疗后的肿瘤细胞微泡能够高度富集ROS，并且被临近的肿瘤细胞高效摄取，通过ROS破坏临近肿瘤细胞的DNA，具备较好的抗肿瘤效应。此外，该放疗微泡还可以通过重编程巨噬细胞改善肿瘤微环境，促进抗肿瘤免疫反应。利用体外放疗产生的微泡技术，可获得含有大量含ROS的微泡，这些微泡被证实通过多种途径给药，都能够产生对实体瘤的高效杀伤效应，进而实现间接放疗的目的。

化疗作为一种常用临床手段，被用来治疗中晚期癌症，但由于多药耐药抵制现象的出现，导致化疗药物对中晚期癌症的临床响应率不高。结合多种治疗手段突破肿瘤细胞的耐药特性是临床发展化疗手段的必然趋势。放疗后微泡作为一种自体来源的微囊泡结构，具有很强的临床转化特性。通过将放疗后微泡作为载体，携载化疗药物后产生的微泡可实现对肿瘤细胞的放化疗一体化治疗，打破肿瘤细胞对化疗药物的耐受特性，并且能够大幅度降低化疗药物的用药剂量，保证化疗的同时尽量不损伤周围正常组织区域。同时携载化疗药物的放疗后微泡也有助于无法直接放疗的相关癌症的治疗。

在使用放疗照射肿瘤细胞，并且将化疗药物与放疗后细胞进行孵育后，细胞将分泌携带化疗药物的微泡。所得到的携载化疗药物的微泡具有广谱的抗肿瘤能力，尤其是化疗抵抗的肿瘤，并且该携载化疗药物的放疗后微泡既可以杀伤供体肿瘤细胞，又可以杀伤其它类型的肿瘤细胞。本发明中，携载化疗药物的所述抗肿瘤微泡保存抗肿瘤活性的储存条件为4℃和7天以内。

本发明通过在实验过程中试验多种化疗药物与放疗后肿瘤细胞进行孵育，获得的携载化疗药物的放疗后微泡，具有比单纯的放疗后微泡或者单纯的化疗药物具有更强的杀伤作用。证明了放疗后肿瘤细胞来源的微泡与携带的化疗药物具有协同杀伤肿瘤细胞的能力。

本发明所述携载化疗药物的所述抗肿瘤微泡的结构如图1所示，图1为通过6MV的X射线放疗肿瘤细胞后，加入化疗药物阿霉素继续孵育72小时，提取的载药放疗微泡的电镜图，可见其为球形囊泡样结构，粒径约为400-500nm；图2为通过马尔文粒径分析仪分析得出的微泡的粒径图，得出微泡粒径分布在100-1000nm。

下文结合实施例对本发明的效果作进一步解释和验证。

实施例一，构建并BCA定量放疗后微泡蛋白浓度，并且通过高效液相色谱定量携载的化疗药物的剂量，以及携载化疗药物的放疗后微泡的保存方法。

在10mm×10mm的培养皿中用10％FBS(胎牛血清)的培养基培养肿瘤细胞，待培养皿中细胞达到约5×106个时，以20GY的剂量进行放疗，放疗后的第一天换液，加入20ml含10％FBS和一定浓度的化疗药物的培养基，第3天收集培养皿内所有液体采用梯度离心法提取放疗后微泡。取放疗后的细胞培养基1000g离心10min后取上清，再将上清14000g，离心2min去除碎片后弃沉淀，最后将上清14000g、4℃离心60min，弃上清，沉淀即是携载化疗药物的微泡，将沉淀再用生理盐水洗两遍，1mlPBS(即磷酸缓冲盐)溶液重悬后4℃保存，取100μl液体离心后，加入适量蛋白裂解液，冰上充***解30min后，12000g离心30min，取上清加入BCA定量液进行蛋白定量。同时取200μl液体离心后，加入有机溶剂如乙醇或者丙酮溶解微泡中化疗药物，然后进行高效液相色谱分离定量微泡中所携带的化疗药物的剂量。

实施例二，携载化疗药物的放疗后微泡针对肿瘤细胞的杀伤效应。

在96孔板中配置100μl的细胞悬液，细胞密度为5×104个/ml。将96孔板在培养箱预培养24小时(37℃，5％CO2)。向培养板中加入不同量的放疗产生的携带化疗药物的微泡(0.04、0.08、0.12、0.16mg/ml)，同时将单纯无化疗药物的微泡作为对照以及单纯的化疗药物作为对照组，将培养板在培养箱孵育48小时。向每孔加入10μl CCK8(Cell CountingKit-8)溶液，再将培养板在培养箱内孵育2小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。吸光度值反映细胞的活性强弱。如图3所示，随着携载化疗药物的放疗后抗肿瘤微泡数量的增加，微泡对肿瘤细胞的杀伤逐渐增强，并且比单纯的化疗药物的杀伤能力更强。携载化疗药物的放疗后微泡的半致死率浓度，明显低于单纯的化疗药物组。

实施例三，携载化疗药物的放疗后微泡抗恶性胸腔积液的动物实验。

建立恶性胸腔积液模型：以每只鼠3×104个Lewis-LUC小鼠肺癌细胞的接种量接种于C57小鼠胸腔，控制进针深度为3.3mm，注射体积为50μL。于第8天时进行小动物活体成像证明造模成功后，胸腔分别注射50μL的20GY放疗后第3天提取的携载化疗药物的放疗后微泡(5mg/kg)和PBS，以及同等剂量的化疗药物。连续注射7天，观察老鼠的生存时间。如图4所示，采用小鼠Lewis细胞制备的小鼠恶性胸水模型，接受阿霉素(3毫克/千克)或负载阿霉素的放疗微颗粒(阿霉素为3毫克/千克)治疗后7天，胸腔灌洗液行流式检测，发现其中CD3⁺T细胞比例显著升高，起到良好的治疗效果；图5为用小鼠Lewis肺癌制作小鼠胸水模型，采用游离的甲氨蝶呤(2.4毫克/公斤)，或负载等量甲氨蝶呤的放疗微颗粒胸腔注射给药，小鼠生存时间统计图；图6为用小鼠Lewis肺癌制作小鼠胸水模型，采用游离的顺铂(3.0毫克/公斤)，或负载等量顺铂的放疗微颗粒胸腔注射给药，小鼠生存时间统计图；图7为用小鼠Lewis肺癌制作小鼠胸水模型，采用游离的阿霉素(4.0毫克/公斤)，或负载等量阿霉素的放疗微颗粒胸腔注射给药，小鼠生存时间统计图；通过图5-图7所示可知，采用携载化疗药物的微泡注射给药相比较于单纯化疗药物组，小鼠生存时间明显延长，具有统计学意义。

实施例四，携载化疗药物的抗肿瘤微泡的毒性验证。

建立恶性胸腔积液模型，通过向小鼠胸腔注射放疗微颗粒，如图8所示，发现阿霉素组小鼠体重下降显著，阿霉素的放疗微颗粒组小鼠体重和阴性对照组体重保持稳定，说明将阿霉素载入放疗微颗粒后，可显著降低阿霉素副作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。