阅读说明：本技术 缺氧nk细胞及其方法 (Hypoxic NK cells and methods thereof ) 是由 派翠克·松吉翁 沙赫鲁兹·拉比扎德 卡伊万·尼亚兹 斯蒂芬·查尔斯·本茨 于 2018-03-07 设计创作，主要内容包括：使用NK细胞中所选基因的低表达检测来证实缺氧肿瘤微环境,该缺氧肿瘤微环境通常对ADCC和NK细胞的细胞毒性细胞杀伤具有抑制作用。最值得注意的是,虽然已知缺氧上调HIF-1α和由HIF-1α调控的基因,但肿瘤微环境中的缺氧导致了包括HIF-1α在内的所选基因的低表达。因此,NK细胞上特定基因的基因表达分析可用于检测肿瘤中状况,从而指示haNK细胞的使用。(Most notably, while hypoxia is known to up-regulate HIF-1 α and genes regulated by HIF-1 α, hypoxia in the tumor microenvironment results in low expression of selected genes, including HIF-1 α.)

缺氧NK细胞及其方法

本申请要求于2017年3月8日递交的序列号为62/468863的美国临时申请的优先权。

技术领域

本发明的领域是涉及自然杀伤(NK)细胞的各种组合物和方法，特别是涉及在肿瘤微环境中在缺氧条件下保持活性的NK细胞。

背景技术

背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

本文中所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出以通过引用将其并入。如果并入的参考文件中术语的定义或用法与本文提供的术语的定义不一致或相反，则适用本文提供的该术语的定义，而不适用参考文件中的该术语的定义。

癌症免疫疗法由于至少在一些情况下显示出有利的治疗结果，而在最近受到了极大的关注。然而，显而易见的是，肿瘤微环境可以经历导致免疫逃逸的特定变化。在其他已知的机制中，可以通过免疫抑制细胞因子的分泌、一种或多于一种可溶性免疫检查点和/或NKG2D配体的分泌、抑制细胞的基于趋化因子的吸引、和上皮-间充质转化来介导免疫监视的逃逸。这些因子还与代谢匮乏和缺氧相互影响，这已被显示出使NK细胞在肿瘤微环境中的活性显著降低。例如，显示了缺氧下调参与NK细胞介导的靶细胞杀伤的活化受体的表达(参见例如，Eur.J.Immunol.2013.43:2756–2764)。另外，还证明缺氧下调肿瘤细胞上的NKG2D配体表达(参见例如，Cell Stress and Chaperones(2015)20:139–147)，并且以各种可能的直接和间接机制显著损害或甚至阻断NK细胞介导的细胞毒性(参见例如，FrontImmunol 2015,6:482)。

为了改善细胞毒性，已经进行了各种尝试。例如，体外显示IL-12增强NK细胞对不同固体和血液肿瘤细胞系的细胞毒性，并促进NK细胞分泌干扰素-γ(参见例如，HumImmunol.2008Aug；69(8):490-500)。然而，体外使用的IL-12浓度不一定能反映体内可实现的或甚至理想的水平。类似地，多柔比星加IL-12在体外显示出特异性地增加CD8+T细胞中NKG2D的表达，但在自然表达NKG2D的包括NK细胞在内的其他类型的免疫细胞中并非如此(参见例如，Molecular Cancer 2014 13:34)。虽然在体内对CD8+T细胞至少有些效果，但对NK细胞没有显示出显著效果。可通过NK细胞的IL2活化来克服缺氧诱导的NK细胞对多发性骨髓瘤的细胞毒性的损害(参见例如，PLoS ONE 8(5):e64835)。令人遗憾地是，在重新激活NK细胞所需的剂量下，IL2无法在全身很好地耐受。没有可靠的方法来识别肿瘤中的缺氧，使得与缺氧肿瘤微环境相关的困难进一步增加。

因此，仍然需要用于识别肿瘤微环境中的缺氧和伴随的NK细胞活性降低的组合物和方法，并且需要在这种微环境中利用抗缺氧型NK细胞的方法。

发明内容

本发明的主题涉及检测和治疗具有缺氧肿瘤微环境的患者的各种方法。最优选地，通过检测NK细胞中所选基因的低表达来检测缺氧。出乎意料的是，与常识相反，肿瘤微环境中的缺氧与NK细胞中HIF-1α和由HIF-1α调节的基因的表达降低有关。因此，当检测到肿瘤微环境中的缺氧时，可以采取适当的对策，例如施用对缺氧条件具有显著降低的敏感性的同种异体重组NK细胞，或施用恢复在受影响的NK细胞中的正常表达水平的药物。替代地或另外地，也可以将肿瘤驱动至缺氧状态(例如，使用贝伐珠单抗)，然后用同种异体重组NK细胞或对缺氧条件的敏感性显著降低的NK细胞进行处理。

例如，在本发明主题的一个方面，发明人预期了一种检测被诊断患有肿瘤的患者的NK细胞的方法，该方法包括从患者获取血液和从患者血液中分离NK细胞(例如，使用磁性分离和对NK细胞特异的抗体)的步骤。在进一步的步骤中，对NK细胞中的至少一种缺氧相关基因的表达进行定量(例如，使用定量rtPCR或RNA测序)，并且相对于缺氧相关基因在常氧条件下在NK细胞中的表达水平，来鉴定缺氧相关基因的低表达。

在特别预期的方面，缺氧相关基因是HIF-1α，或是选自ARL17B、PYHIN1、RPS24、CD52、RPL34、HSPA8、SLIRP、RPS11、B2M、RPS27、MYL12B、RPL39、RPS3A、PTPRC、NAMPT、CALM2、RGS1、KLRB1USP16、RAB8B、RPL26、RPS15A、CCL2、IFI16、CLEC2B、TANK、HSP90AA1、RPS21、KLRK1、RPS29CXCL8、YPEL5、EVI2B、GLIPR1、MARCH7、KLRF1、EIF3E、COX7B、SEC61G、NACA、SAMSN1、USMG5、PSMA4、GAPT、CXCL10、RPL21、MTRNR2L8、MTRNR2L2、MTRNR2L9、和MIR2861的缺氧相关基因，或是选自GZMA、LAMP1、GZMH、PRF1、BAMB、HIF1A、FCGR3A、KLRK1、GZMK、和GZMM的缺氧相关基因。在不限制本发明的主题的情况下，缺氧相关基因通常低表达的log₂倍数变化为至少1.5、至少1.7或至少2.0。在需要时，预期的方法还可包括(在鉴定至少一种缺氧相关基因的低表达的步骤之后)，施用以下至少一种的步骤：(1)经调节的NK细胞，其与未经调节的相同NK细胞相比，在缺氧条件下具有降低的细胞杀伤抑制；(2)同种异体haNK细胞；和(3)STAT3抑制剂。

因此，发明人还预期了诊断和治疗处于缺氧肿瘤微环境的肿瘤的方法。这些方法通常包括从患者获得血液样品，并从患者的血液样品中分离NK细胞的步骤；检测分离的NK细胞中至少一种缺氧相关基因低表达的进一步步骤；当检测到至少一种缺氧相关基因的低表达时，诊断患者具有处于缺氧肿瘤微环境的肿瘤的另一步骤；和向确诊的患者施用有效量的同种异体haNK细胞(例如，表达CD16的高亲和力变体的经修饰的NK92细胞)的又一步骤。关于NK细胞分离、表达的定量和缺氧相关基因，适用与上述相同的考虑因素。

在另一个实例中，发明人预期了一种治疗处于缺氧肿瘤微环境的肿瘤的方法，该方法包括从患者获得血液样品，并从患者的血液样品中分离NK细胞的步骤；检测分离的NK细胞中至少一种缺氧相关基因的低表达的步骤；当检测到至少一种缺氧相关基因的低表达时，诊断患者具有处于缺氧肿瘤微环境的肿瘤的另一步骤；以及向确诊患者施用有效量的STAT3抑制剂(例如，SH2结构域结合抑制剂、二聚化抑制剂和/或DNA结合域抑制剂)的又一步骤。再一次地，关于NK细胞分离、表达的定量和缺氧相关基因，适用与上述相同的考虑因素。

因此，本发明人还预期了一种***的方法，该方法包括向患者施用减少肿瘤新血管形成的药物的步骤，其中该药物以有效产生缺氧肿瘤微环境的量和方案施用；和当确定缺氧肿瘤微环境存在时，施用以下至少一种的另一步骤：(1)经调节的NK细胞，其与未经调节的相同NK细胞相比，在缺氧条件下具有降低的细胞杀伤抑制；(2)同种异体haNK细胞；和(3)STAT3抑制剂。

最典型的是，减少肿瘤新血管形成的药物是阻断VEGF信号传导的药物、抑制细胞增殖和内皮细胞细胞迁移的药物、下调血管生成刺激因子并抑制内皮细胞细胞迁移的药物、抑制血管生成刺激因子结合的药物和/或诱导内皮细胞凋亡的药物。例如，减少肿瘤新血管形成的特别优选的药物是贝伐单抗。还优选使用对至少一种缺氧相关基因的表达水平进行定量来确定缺氧肿瘤微环境的存在。特别优选的缺氧相关基因包括ARL17B、PYHIN1、RPS24、CD52、RPL34、HSPA8、SLIRP、RPS11、B2M、RPS27、MYL12B、RPL39、RPS3A、PTPRC、NAMPT、CALM2、RGS1、KLRB1USP16、RAB8B、RPL26、RPS15A、CCL2、IFI16、CLEC2B、TANK、HSP90AA1、RPS21、KLRK1、RPS29CXCL8、YPEL5、EVI2B、GLIPR1、MARCH7、KLRF1、EIF3E、COX7B、SEC61G、NACA、SAMSN1、USMG5、PSMA4、GAPT、CXCL10、RPL21、MTRNR2L8、MTRNR2L2、MTRNR2L9、MIR2861、GZMA、LAMP1、GZMH、PRF1、BAMB、FCGR3A、KLRK1、GZMK、和GZMM。

预期经调节的NK细胞是用IL-2调节的NK细胞，或者同种异体haNK细胞是表达CD16高亲和力变体的经修饰的NK92细胞。合适的STAT3抑制剂包括SH2结构域结合抑制剂、二聚化抑制剂和DNA结合域抑制剂。在适当的情况下，可以施用化学治疗药物或者可以对肿瘤进行辐射(例如，在有效增加肿瘤细胞上NKG2D配体的表达的方案和剂量下、和/或使用低剂量施用或低剂量辐射，任选以节拍方式)。

因此，本发明人还在另一个实例中预期了***的方法，该方法包括向患者施用减少肿瘤新血管形成的药物的步骤，其中该药物以有效产生缺氧肿瘤微环境的量和方案施用；从患者获得血液样品，并从患者血液样品中分离NK细胞的步骤；以及检测分离的NK细胞中至少一种缺氧相关基因的低表达的另一步骤。当检测到至少一种缺氧相关基因的低表达时，肿瘤被诊断为处于缺氧肿瘤微环境，并且在另一步骤中，在诊断时施用有效量的同种异体haNK细胞。关于药物和缺氧相关基因，适用与上述相同的考虑因素。

因此，在体外诊断肿瘤微环境中的缺氧的方法中考虑使用至少一种缺氧相关基因，其中该方法包括对分离的NK细胞中缺氧相关基因的基因表达进行定量的步骤。如前所述，优选的缺氧相关基因包括ARL17B、PYHIN1、RPS24、CD52、RPL34、HSPA8、SLIRP、RPS11、B2M、RPS27、MYL12B、RPL39、RPS3A、PTPRC、NAMPT、CALM2、RGS1、KLRB1USP16、RAB8B、RPL26、RPS15A、CCL2、IFI16、CLEC2B、TANK、HSP90AA1、RPS21、KLRK1、RPS29CXCL8、YPEL5、EVI2B、GLIPR1、MARCH7、KLRF1、EIF3E、COX7B、SEC61G、NACA、SAMSN1、USMG5、PSMA4、GAPT、CXCL10、RPL21、MTRNR2L8、MTRNR2L2、MTRNR2L9、MIR2861、GZMA、LAMP1、GZMH、PRF1、BAMB、FCGR3A、KLRK1、GZMK、和GZMM。

根据以下优选实施方案的详细描述以及附图，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显，同时附图中相同的数字表示相同的组分。

附图简要说明

图1是描绘在常氧(.20)和缺氧(.0)条件下的示例性供体NK细胞(962、996、950)与在常氧(.20)和缺氧(.0)条件下的haNK细胞之间的成对相对距离的图。

图2是描绘图1的所有细胞中变化最大的基因的图。

图3是描绘图1的所有细胞的常氧和缺氧条件之间基因表达的变化靠前的图。

图4是描绘最有可能在不同条件下发生变化的示例性考虑的缺氧相关基因集的图。

图5是描绘对于差异表达靠前的基因和IFN相关DNA损伤抗性特征(IRDS)标识中的基因，haNK细胞基因表达相对于供体NK细胞的示例性转录差异的图。

图6是描绘对于缺氧特征和所选蛋白，haNK细胞基因表达相对于供体NK细胞的示例性转录差异的图。

图7是描绘图1细胞的缺氧相关基因集的基因表达差异的另一个示例性图。

图8是描绘与NK细胞缺氧相关的预期调节作用的示例性图。

具体实施方式

发明人已经发现，基于NK细胞的癌症治疗可以适用于肿瘤，即使肿瘤处于缺氧肿瘤微环境，但条件是确定NK细胞是活性的，或者处理这种NK细胞以在缺氧肿瘤微环境中恢复或保持活性。最优选地，缺氧肿瘤微环境的确定基于NK细胞中特定的缺氧相关基因集，如下文更详细地显示。容易理解的是，了解缺氧条件下肿瘤中的缺氧状况和恢复/保留的NK活性不仅对基于NK细胞的治疗是有利的，而且对于向患者施用导致肿瘤缺氧状况的药物(例如贝伐单抗)的情况也是有益的。

本发明人的发现至少部分地基于意想不到的观察结果，即与常规观点相反，特定缺氧相关基因在缺氧(更典型的是严重缺氧，如＜0.5％O₂)条件下在NK细胞中是下调的(低表达)。在先前已知的实验条件下，缺氧通常在许多组织中诱导产生HIF-1α，HIF-1α是在缺氧诱导型启动子(例如，HRE，缺氧反应元件)控制下上调的基因的转录因子。相反，发现与常氧(20％O₂)条件相比，HIF-1α和由HIF-1α调节的选定基因在NK细胞中严重低表达，因此，这就为关于肿瘤微环境中缺氧的存在(以及可能的严重性)提供了特定指示。

因此，在检测到肿瘤微环境中的缺氧时，可以用显示出不受缺氧相关ADCC(抗体依赖性细胞毒性)和细胞毒性细胞杀伤(通常是颗粒酶和颗粒溶素介导)影响的NK细胞来处理具有这种肿瘤的对象，或者可以用经IL2预调节以恢复ADCC和细胞毒性细胞杀伤的NK细胞来处理具有这种肿瘤的对象，和/或可以用使受影响的NK细胞的低表达恢复到与NK细胞在常氧条件下相关的表达水平的试剂来处理具有这种肿瘤的对象。从不同的角度来看，因此应该理解的是，现在可以进行基于NK细胞的治疗选择，而该选择原本会由于缺氧肿瘤微环境的存在而被忽略(例如，由于NKG2D在NK细胞上的下调、NKG2D配体在肿瘤细胞上的下调以及ADCC和细胞毒性细胞杀伤的失活)。类似地，在迄今为止还不能确定肿瘤是否处于缺氧微环境的情况下，预期的系统和方法现在允许相对简单地确定缺氧微环境。

为了鉴定随组织中氧变化而产生的差异基因表达，本发明人在常氧(20体积％)和缺氧(0体积％)条件下检测了几种NK细胞系并进行了各种组学分析。更具体地，检测的细胞系是可商购获得的haNK细胞(NantKwest)和来自三个不同健康供体的NK细胞，如下文进一步详细描述的。出乎意料的是，发明人发现，在严格的缺氧条件下，许多与缺氧和/或HIF-1α表达相关的基因显著下调(低表达)。值得注意的是，在非常低的O₂水平(例如，等于或小于2体积％、或等于或小于1体积％、或等于或小于0.5体积％、或等于或小于0.1体积％)下，HIF-1α低表达，而已知中度缺氧条件会增加HIF-1α和由HIF-1α调控的基因的表达。这种氧依赖性基因特异性表达下调可能确实解释了NK细胞丧失ADCC和细胞毒性细胞杀伤能力的事实。

如下面更详细所示，在缺氧条件下在NK细胞中低表达的基因包括HIF-1α(HIF1A)、ARL17B、PYHIN1、RPS24、CD52、RPL34、HSPA8、SLIRP、RPS11、B2M、RPS27、MYL12B、RPL39、RPS3A、PTPRC、NAMPT、CALM2、RGS1、KLRB1USP16、RAB8B、RPL26、RPS15A、CCL2、IFI16、CLEC2B、TANK、HSP90AA1、RPS21、KLRK1、RPS29CXCL8、YPEL5、EVI2B、GLIPR1、MARCH7、KLRF1、EIF3E、COX7B、SEC61G、NACA、SAMSN1、USMG5、PSMA4、GAPT、CXCL10、RPL21、MTRNR2L8、MTRNR2L2、MTRNR2L9、MIR2861、GZMA、LAMP1、GZMH、PRF1、BAMB、FCGR3A、KLRK1、GZMK、和GZMM。值得注意的是，已知这些基因中的至少一些对细胞毒性细胞杀伤的NK细胞具有功能性影响(例如，颗粒酶相关基因)。因此，分析本文提供的一种或多于一种基因在NK细胞中的基因表达(例如，通过RNA测序、定量rtPCR、定量蛋白质组学等)将允许快速评估缺氧肿瘤微环境的存在。

本发明人还出乎意料地发现，一些NK细胞没有表现出上述特定基因(以及某些其他基因，见下文)的低表达，而是甚至表现出这些基因的中度过表达(与常氧条件相比)，如下面更详细地显示。值得注意的是，这些细胞在缺氧条件下杀伤活性(ADCC和细胞毒性杀伤)也没有降低。例如，这些不受缺氧影响的NK细胞包括haNK细胞(表达CD16和细胞内IL2的高亲和力变体的经基因修饰的NK92细胞，haNK细胞可从NantKwest，9920Jefferson Blvd，卡尔弗城，CA90232商购获得)。因此，应该注意的是，haNK细胞特别适用于***，其中该肿瘤被证明处于缺氧微环境。

在这种情况下，应当理解的是，这些预期的检测和缺氧条件下细胞毒性活性的知识也可用于用干扰肿瘤新血管形成的药物对患者进行治疗中，该药物可能导致肿瘤微环境中的缺氧状况。例如，已知贝伐单抗使得肿瘤微环境缺氧，这被认为是不期望的，因为这样的状况倾向于抑制NK细胞杀伤。相反，在施用贝伐单抗的情况下，通常不建议使用NK细胞治疗。因此，在缺氧条件下使用或产生能够抵抗ADCC和/或细胞毒性细胞杀伤抑制的NK细胞可以极大地增加可能产生缺氧状况的药物的使用。表1举例说明了已知干扰肿瘤新血管形成的治疗剂和其他药剂。

表1

基于健康供体NK细胞和haNK细胞之间的转录差异以及进一步的观察(参见下文)，发明人还预期，在施用一种或多于一种试剂之前，可以对NK细胞进行预处理，从而使得如此处理的NK细胞对缺氧不太敏感或甚至不敏感。例如，在其他合适的选择中，预期可以分离具有降低的表达的NK细胞并在体外用IL-2或IL2类似物重新激活细胞，从而增加下调基因的表达。类似地，也可以分离细胞并在体外用STAT3抑制剂(例如，使用靶向STAT3 SH2结构域的肽和非肽抑制剂、靶向STAT3的DNA结合域的抑制剂、靶向STAT3的N末端结构域的抑制剂等)重新激活细胞，从而增加下调基因的表达。在其他的替代方面，也可以用编码STAT3、IL2或IL2类似物的重组核酸转染NK细胞，该重组核酸可以在转染细胞中永久或瞬时地进行细胞内表达(即，不分泌)。经过预处理后，可以使用基因表达的定量分析将低表达的基因表达恢复至正常水平。然后可以将如此处理的细胞重新引入患者体内。或者，可以将haNK细胞施用于经诊断具有缺氧肿瘤微环境的患者。

关于用于预处理的合适的NK细胞，通常预期NK细胞可以是来自患者的自体NK细胞，并且这种自体NK细胞可以从全血中分离，或者使用本领域已知的方法从前体或干细胞培养。此外，应当理解的是，NK细胞不需要是自体的，也可以是同种异体NK细胞或异源NK细胞。然而，在本发明主题的特别优选的方面，NK细胞经基因工程改造以获得一种或多于一种所需性状，即是NK92细胞或NK92细胞衍生物。例如，在本发明主题的一个特别优选的方面，经基因工程改造的NK细胞是NK92衍生物，其被修饰为具有降低或消除的至少一种杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的表达，这将使得这些细胞组成型激活(通过缺乏或减少抑制)。

NK92细胞表现出不寻常的受体表达谱，其表达相对大量的活化受体(例如，NKp30、NKp46、2B4、NKGD、CD28)。相反地，NK92细胞也表达少量的抑制性受体(例如，NKGA/B、低水平的KIR2DL4、ILT-2)，并且缺乏在正常NK细胞上克隆表达的大多数杀伤抑制性受体(KIR)。此外，NK92表达相对高水平的参与穿孔素-颗粒酶细胞溶解途径的分子以及额外的细胞毒性效应分子，包括肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员FasL、TRAIL、TWEAK、TNF-α，从而显示出其通过替代机制进行杀伤的能力。此外，NK92细胞还表达涉及免疫效应细胞调节的其他分子(CD80、CD86、CD40L、TRANCE)，这些分子与NK杀伤的相关性尚不清楚。

此外，合适的NK细胞可具有一种或多于一种修饰的KIR，其经突变以减少或消除与MHC I类分子的相互作用。当然，应该注意的是，也可以使一种或多于一种KIR缺失，或者可以抑制其表达(例如，通过miRNA、siRNA等)。最典型地，多于一种KIR将被突变、缺失或沉默，并且特别预期的KIR包括具有两个或三个结构域的、具有短或长的胞质尾区的那些。从不同的角度来看，修饰、沉默或缺失的KIR包括KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3和KIR3DS1。可以使用本领域熟知的方案制备这些经修饰的细胞。或者，此类细胞也可以从NantKwest(参见URL www.nantkwest.com)商购获得，作为aNK细胞(活化的自然杀伤细胞)。

在本发明主题的另一个优选方面，经基因工程改造的NK细胞也可以是经修饰以表达高亲和力Fcγ受体(CD16)的NK92衍生物。Fcγ受体的高亲和力变体的序列是本领域熟知的(参见例如Blood 2009 113：3716-3725)，并且认为所有产生和表达的方式都适用于本文。据信这种受体的表达允许使用特定针对患者肿瘤细胞(例如，新表位)、特定肿瘤类型(例如，her2neu、PSA、PSMA等)的抗体、或与癌症相关的抗体(例如，CEA-CAM)来特异性靶向肿瘤细胞。有利地，此类抗体是可商购获得的并且可以与细胞联合使用(例如，与Fcγ受体结合)。或者，此类细胞也可以从NantKwest商购获得，作为haNK细胞(高亲和力自然杀伤细胞)。

在本发明主题的又一方面，也可以对经基因工程改造的NK细胞进行基因工程改造以表达嵌合T细胞受体。在特别优选的方面，嵌合T细胞受体将具有scFv部分或对肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原和癌症新表位具有结合特异性的其他胞外域。如前所述，存在多种基因工程改造NK细胞以表达这种嵌合T细胞受体的方式，并且认为所有方式适用于本文。或者，此类细胞也可以从NantKwest商购获得，作为taNK细胞(靶标激活的自然杀伤细胞)。

因此，从不同的角度来看，也可以对本文预期的所有NK细胞进行遗传修饰以表达非分泌型IL-2(例如，保留在ER区室中)。当用IL-2和/或IL-12预处理NK细胞时，通常预期使用本领域熟知的生理浓度或常见体外浓度。例如，IL-2和/或IL-12的合适浓度包括1U/ml至100U/ml、100U/ml至1000U/ml、或10U/ml至10000U/ml、甚至更高。另一方面，IL-2和/或IL-12也可以在细胞内由重组核酸表达，并且重组蛋白可以分泌，或更典型地，可以保留在细胞内。

在本发明主题的另一个方面，如此修饰的NK细胞可以用于药物组合物中，通常配制成具有每剂量单位10⁴个至10¹¹个细胞、更通常每剂量单位10⁵个至10⁹个细胞的无菌可注射组合物。然而，替代制剂也被认为适用于本文，并且本文预期了所有已知的给药途径和方式。如本文所用，术语“施用”药物组合物或药物是指药物组合物或药物的直接和间接施用，其中药物组合物或药物的直接施用通常由医疗保健专业人员(例如，医师、护士等)进行，并且其中间接施用包括向医疗保健专业人员提供药物组合物或药物或使他们能够获得药物组合物或药物以用于直接施用(例如，通过注射至肿瘤、输注、经口递送、局部递送等)的步骤。

最典型地，预期的治疗还包括(节拍)低剂量化疗/放射以在肿瘤组织上诱导NKG2D配体。例如，优选的治疗包括低剂量化学疗法和/或低剂量放射疗法，通常以等于或小于50％、等于或小于30％、等于或小于20％、或等于或小于10％的最大耐受剂量的剂量进行。此外，这种低剂量治疗优选以节拍方式进行，例如每隔一天、或每三天、或每周一次持续数周等。

因此，本发明人预期了检测被诊断具有肿瘤的患者的NK细胞的各种方法、以及诊断和治疗处于缺氧肿瘤微环境的肿瘤的方法、以及治疗处于缺氧肿瘤微环境的肿瘤的方法。如上所述，可以通过确定患者NK细胞(通常从血液中分离)中所选基因的表达水平来确定肿瘤微环境中缺氧的存在。相对于常氧条件，至少一个、或至少两个、或至少五个、或至少10个基因的低表达表明缺氧。一旦检测到低表达，可以施用评估过的相应物质，并且特别优选的化合物或组合物包括haNK细胞和/或经处理的NK细胞(例如，用IL-2或STATE3抑制剂处理)，其与未处理的NK细胞相比，在缺氧条件下的细胞杀伤的抑制降低。或者，也可以直接向患者施用STAT3抑制剂。

实施例

将从haNK系(从NantKwest商购获得)和在两种条件(常氧，20％O₂；和缺氧，0％O₂)下培养的2个NK系供体群体中提取的冷冻RNA用于下游分析。使用具有RiboErase的KAPA标准RNA测序试剂盒(Kapa Biosystems，威尔明顿，MA)制备RNA测序文库，并在IlluminaHiSeq平台(Illumina，圣迭戈，CA)上测序至目标深度200M读取。使用Bowtie2 v2.2.6将样品与RefSeq build 73转录组比对，并使用RSEM v1.2.25对每百万转录物(TPM)进行定量。使用numpy v1.11.1、scipy v0.17.1和pandas v0.18.1在Python v2.7.6中完成下游分析。

在常氧和缺氧条件下对所有细胞系进行表达水平的总体比较，图1描绘了示例性结果。在这里，来自患者供体样品对的RNA log₂-TPM数据的成对皮尔森(Pearson)相关性显示，患者之间的变异性远高于其他供体NK细胞系和haNK细胞的集合(样品内平均值r＝0.968，样品间平均值r＝0.857)。尽管样品之间存在差异，但是当在0％和20％氧气条件之间进行比较时，患者供体NK细胞系之间比与haNK细胞系之间更类似(haNK与患者平均值r＝-0.00317，患者平均值r＝0.575)。实际上，观察到在比较常氧和缺氧条件的成对相关性中，haNK细胞系基本上不受影响，而供体NK细胞群在常氧和缺氧条件之间均表现出强烈差异。

为了鉴定相对于正常NK供体细胞系的特异性缺氧转录变化，将NK TPM相对于正常供体细胞的log₂-TPM差异进行归一化。基于正常样品中的中心TPM比(log₂差异)的总体分布来计算每个基因的Z分数，得到平均值为0且标准偏差为0.453。图2说明了两种条件之间大多数可变表达基因的示例性结果。鉴别的许多转录量靠前的转录物显示出在供体NK系中的表达显著降低，而在haNK系中保持活性，这表明尽管处于缺氧条件，haNK细胞仍继续复制。除细胞周期外，与HIF1A、STAT1和STAT2相关的转录物似乎是一些最差异表达的基因，它们同样不受缺氧影响但在供体NK细胞中显著降低。以前发表的报告(PMID：22615451)已显示STAT1途径的持续表达对细胞毒性因子的抗性至关重要。

图3显示了对于各种细胞系，在常氧和缺氧条件下所选基因的表达水平差异(log₂倍数差异)。从图3中可以容易地看出，所选基因的表达水平相对不受影响，且在一些情况下甚至增加，而三个健康供体群体(950、962、966)的表达差异大部分且显著地为阴性。图4显示了主要与NK细胞相关的标志物的大量差异表达水平的子集(例如，HIF1A和颗粒酶基因GZMA、GZMB、GZMH、GZMK、GZMM)。所选基因的差异表达(log₂倍数差异)的进一步数据比较显示在图5中，其示出了差异靠前的基因(左图)和IFN相关DNA损伤抗性特征(IRDS，右图)。再次，haNK细胞和供体细胞之间的差异是显著的，其中大多数差异表达的基因在供体细胞系中在缺氧条件下下调。图6示例性地示出了与HIF-1和STAT1相关的子网络，其中相应的z分数显示了基因在haNK细胞与基因在供体细胞中表达的相对重要性。

如图7所示，当分析供体细胞和haNK细胞之间的差异靠前的基因时，显然缺氧条件下haNK细胞中的上调基因与NK细胞功能有关，而供体细胞中上调的基因与应激反应有关。同样地，当分析缺氧基因集时，观察到颗粒酶、穿孔素和HIF1A基因在haNK细胞中强烈上调并且在供体细胞中显著低表达。

图8示意性地示出了影响HIF1A和IL2的调节子网络，其中STAT3是图8中所示因子的潜在主调节物。因此，由于STAT3参与调节各种基因的上述变化，发明人预期STAT3抑制剂能够潜在地逆转上述基因的缺氧依赖性低表达。

因此，应当理解的是，对患者NK细胞中基因表达水平进行定量的检测可用于确定患者自身的NK细胞是否将在缺氧条件下保持活性，或者患者是否将受益于haNK细胞的施用。替代地，也可以用IL-2、IL-12和/或STAT3抑制剂预处理患者NK细胞，以在患者的NK细胞中诱导更强的对缺氧条件下细胞毒性活性受抑制的抗性。例如，发明人注意到NK细胞裂解活性可以通过体外外源IL-2激活(例如，16h，1000IU/ml)部分地恢复。这种经处理的NK细胞在1％O₂下保持ADCC能力。

在一些实施方案中，用于描述和要求保护本发明特定实施方案的表示成分的量、性质如浓度、反应条件等的数字应理解为在一些情况下由术语“约”修饰。因此，在一些实施方案中，书面描述和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据特定实施方案试图获得的所需性质而变化。在一些实施方案中，数值参数应根据报告的有效数字的量并通过应用通常的舍入方法来解释。尽管阐述本发明的一些实施方案的宽范围的数值范围和参数是近似值，但具体实施例中列出的数值尽可能精确地报告。在本发明的一些实施方案中呈现的数值可能包含必然由其各自的检测测量中存在的标准偏差引起的某些误差。除非上下文指出相反的情况，否则本文所述的所有范围应解释为包括其端点，并且开放式范围应解释为包括商业实用值。同样，除非上下文指出相反的情况，否则应将所有值的列表视为包含中间值。

如本文的描述和整个权利要求中所使用的，要素前无数量词包括复数指代，除非上下文另有明确说明。此外，如本文的描述中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”。此外，除非上下文另有规定，否则术语“连接至”旨在包括直接连接(其中两个彼此连接的元件彼此接触)和间接连接(其中至少一个附加元件位于两个元件之间)。因此，术语“连接至”和“连接到”同义词使用。

对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，除了所附权利要求的范围之外，本发明的主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语应以与上下文一致的最广泛的方式解释。特别地，术语“包括”和“包含”应该被解释为以非排他的方式引用元素、组件或步骤，这表示所引用的元素、组件或步骤可以存在、或者被利用或与未明确引用的其他元素、组件或步骤组合。当说明书和权利要求涉及选自A、B、C……和N中的至少一种时，文本应解释为只需要其中的一个元素，而不是A加N，或B加N等。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种检测经诊断患有肿瘤的患者的NK细胞以确定缺氧肿瘤微环境的存在的方法，其包括：

从患者获取血液，并从患者的血液中分离NK细胞；

对NK细胞中至少一种缺氧相关基因的表达进行定量；和

相对于常氧条件下NK细胞中至少一种缺氧相关基因的表达水平，鉴定至少一种缺氧相关基因的低表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其中使用磁性分离和对NK细胞特异的抗体来分离NK细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中使用定量rtPCR或RNA测序对表达进行定量。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种缺氧相关基因是HIF-1α。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种缺氧相关基因选自ARL17B、PYHIN1、RPS24、CD52、RPL34、HSPA8、SLIRP、RPS11、B2M、RPS27、MYL12B、RPL39、RPS3A、PTPRC、NAMPT、CALM2、RGS1、KLRB1USP16、RAB8B、RPL26、RPS15A、CCL2、IFI16、CLEC2B、TANK、HSP90AA1、RPS21、KLRK1、RPS29CXCL8、YPEL5、EVI2B、GLIPR1、MARCH7、KLRF1、EIF3E、COX7B、SEC61G、NACA、SAMSN1、USMG5、PSMA4、GAPT、CXCL10、RPL21、MTRNR2L8、MTRNR2L2、MTRNR2L9、和MIR2861。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种缺氧相关基因选自GZMA、LAMP1、GZMH、PRF1、BAMB、HIF1A、FCGR3A、KLRK1、GZMK和GZMM。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种缺氧相关基因低表达的log₂倍数变化为至少2.0。

8.根据权利要求1所述的方法，其还包括在鉴定所述至少一种缺氧相关基因的低表达的步骤之后，施用以下中的至少一种的步骤：

(1)经调节的NK细胞，其与未经调节的相同NK细胞相比，在缺氧条件下的细胞杀伤的抑制降低；

(2)同种异体haNK细胞；和

(3)STAT3抑制剂。

9.一种诊断和治疗处于缺氧肿瘤微环境的肿瘤的方法，其包括：

从患者获得血液样品，并从患者的血液样品中分离NK细胞；

检测分离的NK细胞中至少一种缺氧相关基因的低表达；

当检测到至少一种缺氧相关基因的低表达时，将患者诊断为具有处于缺氧肿瘤微环境的肿瘤；和

向确诊的患者施用有效量的同种异体haNK细胞。

10.根据权利要求9所述的方法，其中使用磁性分离和对NK细胞特异的抗体来分离NK细胞。

11.根据权利要求9所述的方法，其中使用定量rtPCR或RNA测序对表达进行定量。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一种缺氧相关基因是HIF-1α。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一种缺氧相关基因选自ARL17B、PYHIN1、RPS24、CD52、RPL34、HSPA8、SLIRP、RPS11、B2M、RPS27、MYL12B、RPL39、RPS3A、PTPRC、NAMPT、CALM2、RGS1、KLRB1USP16、RAB8B、RPL26、RPS15A、CCL2、IFI16、CLEC2B、TANK、HSP90AA1、RPS21、KLRK1、RPS29CXCL8、YPEL5、EVI2B、GLIPR1、MARCH7、KLRF1、EIF3E、COX7B、SEC61G、NACA、SAMSN1、USMG5、PSMA4、GAPT、CXCL10、RPL21、MTRNR2L8、MTRNR2L2、MTRNR2L9、和MIR2861。

14.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一种缺氧相关基因选自GZMA、LAMP1、GZMH、PRF1、BAMB、HIF1A、FCGR3A、KLRK1、GZMK和GZMM。

15.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一种缺氧相关基因低表达的log₂倍数变化为至少2.0。

16.根据权利要求9所述的方法，其中所述同种异体haNK细胞是表达CD16高亲和力变体的经修饰的NK92细胞。

17.一种治疗处于缺氧肿瘤微环境的肿瘤的方法，其包括：

从患者获得血液样品，并从患者的血液样品中分离NK细胞；

检测分离的NK细胞中至少一种缺氧相关基因的低表达；

当检测到至少一种缺氧相关基因的低表达时，将患者诊断为具有处于缺氧肿瘤微环境的肿瘤；和

向确诊的患者施用有效量的STAT3抑制剂。

18.根据权利要求17所述的方法，其中使用磁性分离和对NK细胞特异的抗体来分离NK细胞。

19.根据权利要求17所述的方法，其中使用定量rtPCR或RNA测序对表达进行定量。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述至少一种缺氧相关基因是HIF-1α。

21.根据权利要求17所述的方法，其中所述至少一种缺氧相关基因选自ARL17B、PYHIN1、RPS24、CD52、RPL34、HSPA8、SLIRP、RPS11、B2M、RPS27、MYL12B、RPL39、RPS3A、PTPRC、NAMPT、CALM2、RGS1、KLRB1USP16、RAB8B、RPL26、RPS15A、CCL2、IFI16、CLEC2B、TANK、HSP90AA1、RPS21、KLRK1、RPS29CXCL8、YPEL5、EVI2B、GLIPR1、MARCH7、KLRF1、EIF3E、COX7B、SEC61G、NACA、SAMSN1、USMG5、PSMA4、GAPT、CXCL10、RPL21、MTRNR2L8、MTRNR2L2、MTRNR2L9、和MIR2861。

22.根据权利要求17所述的方法，其中所述至少一种缺氧相关基因选自GZMA、LAMP1、GZMH、PRF1、BAMB、HIF1A、FCGR3A、KLRK1、GZMK和GZMM。

23.根据权利要求17所述的方法，其中所述至少一种缺氧相关基因低表达的log₂倍数变化为至少2.0。

24.根据权利要求17所述的方法，其中所述STAT3抑制剂选自SH2结构域结合抑制剂、二聚化抑制剂和DNA结合域抑制剂。

25.一种***的方法，其包括：

向患者施用减少肿瘤新血管形成的药物，其中所述药物以有效产生缺氧肿瘤微环境的量和方案来施用；

在确定缺氧肿瘤微环境存在后，施用以下中的至少一种：

(1)经调节的NK细胞，其与未经调节的相同NK细胞相比，在缺氧条件下的细胞杀伤的抑制降低；

(2)同种异体haNK细胞；和

(3)STAT3抑制剂。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述减少肿瘤新血管形成的药物是阻断VEGF信号传导的药物、抑制内皮细胞的细胞增殖和细胞迁移的药物、下调血管生成刺激因子并抑制内皮细胞的细胞迁移的药物、抑制血管生成刺激因子结合的药物、和诱导内皮细胞凋亡的药物中的至少一种。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述减少肿瘤新血管形成的药物是贝伐单抗。

28.根据权利要求25所述的方法，其中使用对至少一种缺氧相关基因的表达水平进行定量来确定缺氧肿瘤微环境的存在。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述至少一种缺氧相关基因选自ARL17B、PYHIN1、RPS24、CD52、RPL34、HSPA8、SLIRP、RPS11、B2M、RPS27、MYL12B、RPL39、RPS3A、PTPRC、NAMPT、CALM2、RGS1、KLRB1USP16、RAB8B、RPL26、RPS15A、CCL2、IFI16、CLEC2B、TANK、HSP90AA1、RPS21、KLRK1、RPS29CXCL8、YPEL5、EVI2B、GLIPR1、MARCH7、KLRF1、EIF3E、COX7B、SEC61G、NACA、SAMSN1、USMG5、PSMA4、GAPT、CXCL10、RPL21、MTRNR2L8、MTRNR2L2、MTRNR2L9、MIR2861、GZMA、LAMP1、GZMH、PRF1、BAMB、FCGR3A、KLRK1、GZMK、和GZMM。

30.根据权利要求25所述的方法，其中所述经调节的NK细胞由IL-2调节。

31.根据权利要求25所述的方法，其中所述同种异体haNK细胞是表达CD16高亲和力变体的经修饰的NK92细胞。

32.根据权利要求25所述的方法，其中所述STAT3抑制剂选自SH2结构域结合抑制剂、二聚化抑制剂和DNA结合域抑制剂。

33.根据权利要求25所述的方法，其还包括施用另外的化学治疗药物或对肿瘤进行辐射。

34.根据权利要求33所述的方法，其中在有效增加NKG2D配体在肿瘤细胞上的表达的方案和剂量下施用化学治疗药物或辐射。

35.根据权利要求33所述的方法，其中施用或辐射包括低剂量施用或低剂量辐射的步骤，任选地以节拍方式进行。

36.一种***的方法，其包括：

向患者施用减少肿瘤新血管形成的药物，其中所述药物以有效产生缺氧肿瘤微环境的量和方案来施用；

从患者获得血液样品，并从患者的血液样品中分离NK细胞；

检测分离的NK细胞中至少一种缺氧相关基因的低表达；

当检测到至少一种缺氧相关基因的低表达时，将肿瘤诊断为处于缺氧肿瘤微环境；和

在确诊后施用有效量的同种异体haNK细胞。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述减少肿瘤新血管形成的药物是阻断VEGF信号传导的药物、抑制内皮细胞的细胞增殖和细胞迁移的药物、下调血管生成刺激因子并抑制内皮细胞细胞迁移的药物、抑制血管生成刺激因子结合的药物、和诱导内皮细胞凋亡的药物中的至少一种。

38.根据权利要求36所述的方法，其中所述减少肿瘤新血管形成的药物是贝伐单抗。

39.根据权利要求36所述的方法，其中所述至少一种缺氧相关基因选自ARL17B、PYHIN1、RPS24、CD52、RPL34、HSPA8、SLIRP、RPS11、B2M、RPS27、MYL12B、RPL39、RPS3A、PTPRC、NAMPT、CALM2、RGS1、KLRB1USP16、RAB8B、RPL26、RPS15A、CCL2、IFI16、CLEC2B、TANK、HSP90AA1、RPS21、KLRK1、RPS29CXCL8、YPEL5、EVI2B、GLIPR1、MARCH7、KLRF1、EIF3E、COX7B、SEC61G、NACA、SAMSN1、USMG5、PSMA4、GAPT、CXCL10、RPL21、MTRNR2L8、MTRNR2L2、MTRNR2L9、MIR2861、GZMA、LAMP1、GZMH、PRF1、BAMB、FCGR3A、KLRK1、GZMK、和GZMM。

40.根据权利要求36所述的方法，其中所述同种异体haNK细胞是表达CD16高亲和力变体的经修饰的NK92细胞。

41.至少一种缺氧相关基因在用于体外诊断肿瘤微环境中的缺氧的方法中的用途，其中所述方法包括对分离的NK细胞中缺氧相关基因的基因表达进行定量的步骤，其中所述分离的NK细胞从血液中分离。

42.根据权利要求41所述的用途，其中所述至少一种缺氧相关基因选自ARL17B、PYHIN1、RPS24、CD52、RPL34、HSPA8、SLIRP、RPS11、B2M、RPS27、MYL12B、RPL39、RPS3A、PTPRC、NAMPT、CALM2、RGS1、KLRB1USP16、RAB8B、RPL26、RPS15A、CCL2、IFI16、CLEC2B、TANK、HSP90AA1、RPS21、KLRK1、RPS29CXCL8、YPEL5、EVI2B、GLIPR1、MARCH7、KLRF1、EIF3E、COX7B、SEC61G、NACA、SAMSN1、USMG5、PSMA4、GAPT、CXCL10、RPL21、MTRNR2L8、MTRNR2L2、MTRNR2L9、MIR2861、GZMA、LAMP1、GZMH、PRF1、BAMB、FCGR3A、KLRK1、GZMK、和GZMM。